Summary
大脑区域三维结构内的神经元纤维长度是量化特定神经元结构完整性或退化的可靠参数。本文详细介绍了一种立体定量方法，以小鼠Meynert细胞核基质内胆碱能纤维长度为例。
Abstract
不同大脑区域的胆碱能或其他神经元轴子的长度通常与该区域的特定功能相关。立体学是量化各种大脑结构神经元特征的有用方法。在这里，我们提供一个基于软件的立体学协议，以估计基底前脑Meynert（NBM）细胞核基底中胆碱能纤维的总长度。该方法使用空间球探头进行长度估计。胆碱能纤维通过胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫染色与马萝卜过氧化物酶-二氨基苯甲酸酯（HRP-DAB）检测系统可视化。使用立体学软件，染色协议对于各种大脑区域的纤维和细胞数估计也有效。立体学协议可用于估计任何线性轮廓，如胆囊状纤维、多巴胺可列菌纤维/二代胺纤维、血清素纤维、星形细胞过程，甚至血管型材。
Introduction
大脑中神经纤维长度和/或密度的定量估计是神经病理学研究的重要参数。不同大脑区域的胆碱能、多巴胺能和血清素轴子的长度通常与该区域的特定功能相关。由于这些斧子的分布通常是异构的，因此使用基于设计的立体学来避免采样过程中的偏差。立体学的空间球探针被设计为在感兴趣的区域提供高效可靠的线状结构，如神经元纤维。探头制作一个虚拟球体，在组织中系统地施加，以测量与探头表面的线交交。由于不可能将球体探头放入组织进行分析，因此市售软件提供了一个虚拟的三维（3D）球体，基本上就是代表球体探头表面的一系列不同直径的同心圆。
选择性胆碱能神经退化是阿尔茨海默氏病（AD）2、3、4的一贯特征之一。功能失调的胆碱能传输被认为是AD认知衰退的一个致能因素。胆碱功能障碍在许多其他精神障碍中也很明显，如帕金森氏症、成瘾和精神分裂症。在动物模型中研究了胆碱能神经退化的不同方面（例如，减少乙酰胆碱5，ChAT蛋白6，淀粉样斑块6附近的胆碱能纤维神经退化，减少胆碱能纤维和突触性静脉曲张7，8）。纤维退化被认为比神经元损失更早发生，因为在研究中并不总是观察到胆碱能神经元损失。大多数胆碱能神经元在基底前脑和脑干，其轴突项目到各种大脑区域，如皮质和海马。NBM位于基础前脑，发现是AD中常见的大脑区域之一。
立体学的分馏方法基于多级组织的系统随机采样。截面采样分数（SSF）是立体学分馏法中基于计算机的节面系统采样。面积采样分数 （ASF） 是该节中感兴趣区域的分馏。厚度采样分数 （TSF） 是截面厚度的分馏。空间球探头允许我们在分数位置对 3D 球体中感兴趣的轮廓进行量化。在这里，我们使用空间球探针来估计小鼠大脑NBM中胆碱能纤维的总长度，以说明这些过程。目前的方案提供了有关组织处理的细节，立体学的采样方法，使用ChAT抗体的免疫组织化学染色，以及用于估计小鼠大脑NBM中胆碱能纤维长度和纤维密度的无偏立体学。
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Protocol
使用这些动物的所有程序都已获得堪萨斯城退伍军人事务医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验中，18个月大的小鼠过度表达瑞典突变β-淀粉样蛋白前体蛋白（APPswe）及其C57/BL6 WT杂物。育种和基因分型的细节在He等人8。
1. 灌注和组织处理
- 使用氯胺酮（100毫克/千克）和木拉津（10毫克/千克）注射，对小鼠进行麻醉。捏脚趾，以确认缺乏反应之前继续9。
- 在0.1M磷酸盐缓冲液（PB）10中，注入±50 mL的冰冷0.1M Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），后用4%的甲醛（PFA） 进行。
注意：PFA 是有毒的。使用 PFA 时，请使用个人防护设备 （PPE）。 - 取出大脑10，在4°C下浸入0.1M PB中的4%PFA，进行24小时后固定，用DPBS 3x清洗。
- 在 0.1 DPBS 中过夜，在 0.1 DPBS 中更改为 15% 蔗糖溶液，然后在 0.1 M DPBS 中再在 4°C 下再更换 30% 蔗糖溶液。
- 从蔗糖溶液中取出组织，并冷冻在预置的冷冻室中，温度为-20°C。冷冻样品可储存在-80°C密封管中，直至切片。
- 将组织嵌入最佳切割温度嵌入介质（参见材料表），并安装在试样盘上。使用冷冻剂在日冕平面中切割串行 30 μm 厚的部分，并收集所有部分，从而在 24 个充满低温保护剂溶液的孔培养板中收集所有部分（30% 甘油、30% 乙二醇、40% DPBS）;图 1A+C。存放在-20°C冰柜中。
注：较厚的部分（例如50 μm）在可行的情况下更可取。确保各部分保持切割顺序，并且所有部分完全处于低温保护状态。96 孔板可用作 24 孔板的替代品，以收集截面。 - 用板封口机盖住井，防止蒸发和干燥。将盘子储存在-20°C，直到进一步使用。在-20°C下储存的节在ChAT免疫性化学中稳定数月。
2. IHC的系统部分选择
注：应进行试点研究，了解实现可接受的误差系数 （CE） 所需的部分总数。CE 值表示采样过程中的总误差量。最低值表示最小误差，低于 0.1 的 CE 值被此处使用的软件（参见材料表）11认为可以接受。
- 通过将形态特征与标准小鼠大脑图集（如富兰克林和帕克西诺斯）进行比较，确定每个大脑的第一部分和最后一部分。NBM 从 -0.0mm 开始，在 -1.6 mm 结束。因此，大约50个部分包含国家银行。节的总数是立体学期间所需的参数之一。每第8节（SSF = 1/8）的选择总共给出了6~7个部分进行分析，并在我们的试验研究中为体积估计和纤维长度估计提供了可接受的CE。
- 随机从前八个部分之一开始，然后每隔8节进行系统采样，直到包含 NBM 的最后一节（图 1C）。
3. 免疫性化学
- 将冷冻保存部分转移到室温中，在低温保护剂中，然后在6个孔板中转移0.1M磷酸盐缓冲液（PB）。
- 在 PB 中洗涤 3 倍。
- 在甲醇中孵育0.3%H2O215分钟。
- 在Tris缓冲盐水（TBS）中洗涤3倍。
- 在 TBS 中孵育 0.25% Triton X-100 30 分钟。
- 在 TBS 中用 0.1% Triton X-100 中 10% 正常牛血清 （NBS） 块 30 分钟。
- 在 TBS 中用 0.1% Triton X-100 和 1% NBS 在 4°C 下 48 小时孵育山羊抗人 ChAT 原抗体（见材料表）。
- 在室温下，在 TB 中洗涤 3 倍。在室温下进行所有进一步的孵育和洗涤。
- 用生物素化牛抗山羊二级抗体孵育1小时（见材料表）。
- 在 TBS 中洗涤 3 倍。
- 用阿维林-生物蛋白-过氧化物酶复合物孵育（见材料表）。
- 在 TBS 中洗涤 3 倍。
- 根据制造商的建议，使用增强的 DAB 过氧化物酶基板解决方案（参见材料表）进行开发。
注意：民建联是一种可疑的致癌物质。接触和吸入有毒。使用 DAB 时，请使用个人防护装备。 - 用蒸馏水清洗部分几次，并保持在Tris pH = 7.6。
- 在明胶幻灯片上安装各部分。一个组织的所有部分都可以放在同一张幻灯片上。空气干燥部分，脱水2次，每次5分钟，分别用70%、90%、95%和100%乙醇，然后用两个10分钟二甲苯洗洗清除部分。使用安装介质盖上部分（参见材料表）。
注： 脱水和清除的处理时间会影响各部分的厚度。因此，所有部分都应使用相同的条件。在目前的研究中，最终厚度的平均值为21.11 ± 0.45 μm。 - 保持烟气罩中的部分干燥。干燥的部分已准备好进行立体学。
4. 立体学
注：参见所用显微镜和软件的材料表。具有数字光圈 （NA） > 1.2 的浸入式目标将非常有用，如果需要，应使用。幻灯片应根据基因型或治疗组进行分组并编码。一项研究的完整立体学应由同一人进行，而执行立体学的人应对被检查的1、12、13的个别幻灯片或小组的身份视而不见。
- 在软件中打开一个新的研究。（文件 > 新研究）将打开"学习初始化"对话框。使用多级（基于分数）（图2A）填写学习信息。
- 双击"参数"下的"音量"，这将打开"音量"对话框。命名感兴趣的特征并选择"区域点计数"探测器。单击"下一步"。
- 双击下一个参数"长度"。
- 提供要素的名称（例如，"L"）选择"球体"探测，然后单击"下一步"。
- 接下来，单击"学习初始化"对话框，该对话框将打开"案例初始化"框。填写案例信息。在开始研究之前，必须对组进行编码。节数是从第一节开始的节数，该节包含感兴趣区域到最后一节包含感兴趣区域的部分（请参阅步骤 2.1）。截面采样间隔为 8，因为为 IHC 染色选择每8节。
- 单击"下一步"将打开"探测初始化"对话框，该对话框将自动设置区域选择和体积估计的最低放大倍数。确认设置，并检查是否可以在选定的较低放大倍率上识别感兴趣的区域。双击"体积"，为区域体积分数每点填充 50，000 μm3。单击"完成"。
- 在"对象（高）放大"下，将长度设置为63倍或100倍。双击"长度"以打开"长球"对话框，并将球体的直径设置为 10 μm。
注： 防护区应根据各路段的实际厚度确定。操作员必须检查多个站点的各路段的厚度，以避免任何损坏。如有必要，根据截面厚度调整防护区厚度。 - 为帧区域、帧高度、防护区域和帧间距设置适当的值。
注： 这些值取决于研究区域中对象轮廓（光纤）的异质性。帧面积为400μm2，帧高度为10μm，防护区为2μm，帧间距为300μm，为NBM中的光纤长度估计提供了可接受的CE值。在进行下一个案例之前，必须使用这些值进行试验性研究。 - 按照软件在每个步骤后提供的说明进行操作。说明显示为对话框和/或屏幕底部。
- 插入第 1 节。
- 在低放大倍率（5倍）下，通过在国家/地区周围设置任意边界来定义感兴趣的区域。单击视频窗口左角的"下一步"按钮。按照说明操作，确认所有绿点都位于国家/地区。可以通过单击点来包括或排除这些点。
注： NBM 周围没有明确的设定边界。选择主要是调查员定义的。NBM 的 ChAT® 胆碱能神经元可在内部胶囊 （ic） 和球状苍白 （GP） 中观察到。在此协议中，CAT® 胆碱能神经元及其投影（纤维）和整个GP的ic包含在NBM中（图1D）。 - 按照说明，以电流分数进行光纤测量，更改为 63 倍。"截面厚度"对话框出现在屏幕上。设置截面的顶部和底部表面以测量截面的实际厚度。应使用手动 Z 轴移动。单击"完成"。
注： 如果区域中没有光纤，则可以跳过该步骤以转到下一个分数位置。 - 在截面的帧高度中从上到下缓慢移动 Z 轴，并在虚拟球体探头表面上标记所有相交的光纤（图 3）。完成后，单击"下一步"转到下一个位置。
- 完成所有分数后，软件将要求插入下一节。对组织的所有六个或七个部分重复步骤 4.9_4.12。
- 最后，软件将生成显示 CE 值的案例的结果（图 4）。如果 CE 可以接受，则继续下一种情况。文件 > 新案例.如果 CE 不可接受（图 4A），该软件会提供更改某些参数的建议。在许多情况下，减小帧间距会将 CE 值减小到可接受的范围（图 4B）。
- 完成所有案例后，为每个案例和组生成结果 （文件 > 结果）。
5. 分析和统计
- 该软件提供每个样本和每个组的数据。软件本身计算 SSF、ASF 和 TSF 等分数，并提供参考区域中光纤的总参考量 （VREF）和总长度 （L）（本例中为 NBM）（图4B）。导出数据，并将数据保存或复制到组分析之间选择的统计软件。表 1显示了用于统计分析的典型结果数据。通过将总光纤长度与参考体积分开来分析光纤密度 （Lv）。
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Representative Results
代表性结果如图1和图5所示。被解码为APpswe群（APP）的C组，其纤维长度（图5B）和纤维长度密度（图5C）与其野生型（WILD）杂物相比，具有显著降低。结果表明，所分析的两组国家/地区NBM的体积无显著差异（图5A）。
图1：本研究中使用的组织处理和取样的插图。样品制备和取样。（A） 小脑和嗅球在安装到试样盘之前，先取出。（B） 在试样盘上大脑的方向进行截面切割。一个半球上的浅纵向切口（用一条线标记）有助于识别各部分中大脑的一侧。（C） 24 孔板的示意图，显示从 24 个井板（标记为"X"）中每8节的系统选择。（D） 在系统选择的六节中，绘制了分隔NBM边界的日冕部分的示意图。（E-G）日冕部分的代表性图像免疫染色的ChAT和国家主机的位置（概述）。（H） 显示国家边界的高放大倍率图像。LV = 侧心室;VL = 心边性脑细胞核;ic = 内部胶囊;GP = 球状苍白;CPu = 牛纹子条（纹状体）;NBM = 梅内特核基底（在富兰克林和帕克西诺斯小鼠地图集中称为"B"）。刻度杆 = 1 毫米 （E-G）， 200 μm （H）请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：屏幕截图图像。（A） "研究初始化" （B） "案例初始化' 和 （C） "探测初始化' 对话框.请点击此处查看此图的较大版本。
图3：使用光学扇区的球体探头。代表性的屏幕截图图像，显示球体的四个平面和相交纤维的标记。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：代表性结果。（A） 显示不可接受的 CE 和 （B） 表示长度估计可接受的 CE。结果中还提供了每个案例的 ASF、SSF 和 TSF。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：代表性数据和分析。两个组 NBM 中体积 （A） 长度 （B） 和长度密度 （C） 的图形表示.使用学生 t 测试在两个不同的组中分析数据。•p < 0.05。请点击此处查看此图的较大版本。
| 组 | 情况 下# | 体积 （μm=3） | 长度（微米） | 吕 （μm/μm=3） |
| B | 1 | 926885302 | 16446282 | 0.018 |
| B | 2 | 856582400 | 19254528 | 0.022 |
| B | 3 | 1150520830 | 15980131 | 0.014 |
| C | 1 | 981056585 | 12108328 | 0.012 |
| C | 2 | 894169486 | 6905567 | 0.008 |
| C | 3 | 998618871 | 10359766 | 0.010 |
| 统计 | ||||
| 平均组 B | 977996177.3 | 17226980.33 | 0.018 | |
| SD 组 B | 153490036.6 | 1771309.218 | 0.004 | |
| 平均组 C | 957948314 | 9791220.333 | 0.010 | |
| SD 组 C | 55927744.89 | 2647567.494 | 0.002 | |
| TTEST B vs C | 0.84 | 0.02 | 0.049 | |
表1：代表性数据和分析。体积和长度值直接从立体学软件提供的结果中复制。长度密度 （Lv） 的计算方法是将长度值除以每个案例的体积值。p 值是使用学生的 t 检验计算的。
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Discussion
在这里，我们演示了一种使用空间球（球）探测器估计NBM中胆碱能纤维密度的方法。此探头估计了感兴趣区域的总光纤长度。总长度可以除以区域的体积来获得光纤密度。为了估计区域的体积，使用了卡瓦利埃里点计数方法。Cavalieri 点计数方法是对任何区域的 3D 参考体积的无偏和高效的估计。该方法通过计算点（表示面积分数）计算截面上截面上的面积估计值，然后乘以分析为 11的两个截面之间的距离。该方法不需要劳动密集型、精确地跟踪感兴趣的区域的周界。它与光学分馏器结合使用，用于估计细胞和光纤的密度。
立体分析需要精确的采样方法。感兴趣的大脑区域应该用染色正确定义。NBM 位于每个富兰克林和帕克西诺斯小鼠地图集的 AP bregma -0.0 mm 到 -1.6 mm 之间。对于免疫组化学，应系统地、随机地选择各部分，这意味着第一部分应随机选择，然后系统地选择其他部分。对于成年小鼠大脑，NBM由约1，600μm（前后体）组成，这意味着约53个冠状部分30μm厚。然后，如果选择每8个部分，将有6~7个部分需要染色进行立体分析。在我们的通常过程中，6~7节足以估计NBM中胆碱能纤维的总数。在方法优化12的开头，建议对CE进行分析以进行验证。
适当的染色方法是研究的基本要求。胆碱能纤维的ChAT染色可能具有挑战性，许多抗体会染色一些细胞部分，但不是遥远的轴突状过程。有关 ChAT 染色8的相关详细信息，请参阅我们前面描述的协议。
该方法基本上需要厚部分，因为组织学处理会导致组织收缩。理想情况下，空间球探头需要超过20μm的后处理、最终厚度（通常比初始组织部分厚度更薄）的部分。因此，建议截面厚度为50μm。收缩率一般不均匀，影响组织内的体积扭曲，从而改变Lv值。例如，在使用多光子成像14、15分析毛细管长度密度时，在体内观察到了多倍差。考虑到此问题，报告每个区域的长度比报告每个卷的长度更有效。
尽管协议中给出的值效果良好，但始终建议对单个研究进行试点研究。完成单个组织样本案例后，软件为所选采样设计提供 CE 值。CE 值用于估计估计的精度，并且可以通过多个公式计算。这里使用的软件使用Gunderson的1999年公式来分析CE，并认为如果数值小于0.11，16，它是可以接受的。在将协议调整用于其他样品之前，应调整采样设计方案，直到 CE 值变得可接受。通常，增加采样次数（通过减少帧间隔）会降低 CE 值。生物系统中几乎没有结构是理想的线型，但带状或钢瓶。因此，在聚焦点上决定精确的相交特征因人而异。因此，特定研究的所有样本的立体学应由同一个人执行。为了避免可能的偏差，立体学运算符应对样本标识符视而不见。
重复性是此方法中的一个主要问题。一个因素是样品处理过程中的组织收缩和畸形，可以通过在体内共聚焦显微镜13、14、15在一定程度上克服。太空球需要高对比度染色和良好的成像分辨率来可视化结构。由于纤维通常不是线性形式，因此截距的确定主要仍由操作员决定。为了解决这个问题，提出了组织学特征的自动分割。但是，这尚未提供13。
使用立体学的优点是它提供了一个无偏见的方案来分析3D组织的结构。空间球探头在组织样本中提供各向异性分数，因此提供了一种无偏见的方法来量化纤维长度。分析纤维密度的另一种方法是测量化学染色的光学密度。基于染色强度的方法提供染色密度的半定量估计，并且可能不够敏感，也可能不是足够敏感，能够区分 NBM 中胆碱能神经元和纤维的变化。使用空间球（球）探头的立体方法使用基于其视觉特征的光纤测定，并提供光纤实际长度的估计。该协议还可用于分析大脑中的其他线性轮廓，如胆囊状纤维（使用乙酰胆碱酯酶组织化学）、多巴胺基或儿茶胺酯纤维（酪氨酸羟基酶免疫染色）、血清素纤维（血清素免疫染色）、血管结构（CD31免疫染色）、或星形细胞过程（胶质纤维 GFAP， 免疫染色）17，18，19，20，21.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了退伍军人事务部医学研究与发展处（功绩审查1I01 BX001067-01A2）、阿尔茨海默氏症协会（NPSPAD-11-202149）和中西部生物医学资源对W.Z.S.的资助。研究基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
References
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