تعريف عالي الإنتاجية للمقاومة لـ Pseudomonas syringae pv. الطماطم في الطماطم باستخدام الشتلات الفيضانات أساي
Summary
يسهل فحص فيضان الشتلات الفحص السريع لوالانضمامات الطماطم البرية للمقاومة لبكتيريا Pseudomonas syringae. هذا الفحص، المستخدم بالاقتران مع فحص نمو الشتلات البكتيرية، يمكن أن يساعد في زيادة توصيف المقاومة الأساسية للبكتيريا، ويمكن استخدامه لفحص مجموعات رسم الخرائط لتحديد الأساس الوراثي للمقاومة.
Abstract
الطماطم هي محصول مهم زراعيا يمكن أن يصاب بـ Pseudomonas syringae، وهي بكتيريا سلبية الغرام ، مما يؤدي إلى مرض بقع بكتيرية. الطماطم-P. syringae الكهروضوئية. يستخدم نظام الطماطم على نطاق واسع لتشريح الأساس الوراثي للاستجابات الفطرية النباتية ومقاومة الأمراض. في حين تمت إدارة المرض بنجاح لعدة عقود من خلال إدخال مجموعة الجينات Pto / Prf من Solanum pimpinellifolium إلى الطماطم المزروعة ، تطورت سلالات العرق 1 من P. syringae للتغلب على المقاومة التي تمنحها مجموعة جينات Pto / Prf وتحدث في جميع أنحاء العالم.
أنواع الطماطم البرية هي خزانات هامة للتنوع الطبيعي في التعرف على مسببات الأمراض ، لأنها تطورت في بيئات متنوعة مع ضغوط مسببات الأمراض المختلفة. في الشاشات النموذجية لمقاومة الأمراض في الطماطم البرية ، يتم استخدام النباتات البالغة ، والتي يمكن أن تحد من عدد النباتات التي يمكن فحصها بسبب وقت نموها الممتد ومتطلبات مساحة النمو الأكبر. لقد طورنا طريقة لفحص شتلات الطماطم التي يبلغ عمرها 10 أيام للمقاومة ، مما يقلل من وقت نمو النبات ومساحة غرفة النمو ، ويسمح بدوران سريع للنباتات ، ويسمح باختبار أحجام العينات الكبيرة. يمكن التعامل مع نتائج الشتلات من البقاء على قيد الحياة أو الموت كأنماط ظاهرية منفصلة أو على مقياس مقاومة محدد بكمية النمو الجديد في الشتلات الناجية بعد الفيضانات. وقد تم تحسين هذه الطريقة لفحص شتلات الطماطم التي يبلغ عمرها 10 أيام لمقاومة اثنين من سلالات P. syringae ويمكن بسهولة تكييفها مع سلالات P. syringaee الأخرى.
Introduction
Pseudomonas syringae هي بكتيريا الإمراض السلبي للجرام الذي يصيب مجموعة واسعة من مضيفي النباتات. البكتيريا تدخل النبات المضيف من خلال الجروح الجسدية أو الستاماتا وتتكاثر في apoplast1. وقد تطورت النباتات استجابة مناعية من مستويين للحماية من العدوى من مسببات الأمراض البكتيرية. يحدث المستوى الأول في سطح الخلية النباتية ، حيث تتصور مستقبلات التعرف على الأنماط على غشاء الخلية النباتية الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) في عملية تسمى المناعة التي يتم تشغيلها PAMP (PTI)2. خلال هذه العملية ، يقوم النبات المضيف باستضافة مسارات الاستجابة الدفاعية ، بما في ذلك ترسب الكالوز إلى جدار الخلية ، وإغلاق الستوماطا ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتحريض الجينات المرتبطة بالإمراض.
يمكن للبكتيريا التغلب على PTI من خلال استخدام نظام إفراز النوع الثالث لتقديم البروتينات ، وتسمى المؤثرات ، مباشرة إلى الخلية النباتية3. البروتينات Effector تستهدف عادة مكونات PTI وتعزيز الفوعة الممرض4. يحدث المستوى الثاني من مناعة النبات داخل الخلية النباتية عند التعرف على البروتينات المؤثرات. يعتمد هذا الاعتراف على جينات المقاومة ، والتي تقوم بترميز موقع ربط النيوكليوتيدات الغنية بالليوسين تكرار المستقبلات التي تحتوي على (NLRs). NLRs قادرة إما على الاعتراف المؤثرات مباشرة أو الاعتراف بنشاطهم على هدف الفوعة أو الفخ5. ثم تؤدي إلى استجابة مناعية ثانوية في عملية تسمى المناعة التي تسببها المؤثرات (ETI) ، والتي غالبًا ما ترتبط باستجابة شديدة الحساسية (HR) ، وهي شكل من أشكال موت الخلايا المترجمة في موقع العدوى6. وعلى النقيض من مقاومة الجينات مقابل الجينات المرتبطة بـ ETI ، يمكن للنباتات أن تظهر مقاومة جزئية كمية ، والتي تعتمد على مساهمة جينات متعددة7.
P. syringae الكهروضوئية. الطماطم (PST)هو العامل السببي للذرة البكتيرية على الطماطم وهو مشكلة زراعية مستمرة. وكانت السلالات السائدة في هذا المجال عادة سباق توقيت المحيط الهادي 0 سلالات التي تعبر عن أي أو كلا من نوع الثالث المؤثرات AvrPto وAvrPtoB. DC3000(PSTDC3000) هو سباق تمثيلي 0 سلالة وعامل ممرض نموذجي يمكن أن يسبب ذرة بكتيرية في الطماطم. لمكافحة مرض بقع البكتيرية، والمربين مقدمة Pto [P. syringae pv. الطماطم]/ Prf [Pto المقاومة وحساسية الفينثيون]الكتلة الجينات من أنواع الطماطم البرية سولانوم pimpinellifolium في الأصناف الحديثة8،9. جين Pto ترميز كيناز بروتين سيرين-ثريونين التي، جنبا إلى جنب مع NLR Prf، تمنح مقاومة لتوقيت المحيط الهاديDC3000 عن طريق التعرف على المؤثرات أفريبتو وAvrPtoB10،11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن هذه المقاومة غير فعالة ضد سلالات العرق 1 الناشئة ، مما يسمح لانتشارها السريع والعدواني في السنوات الأخيرة15،16. سلالات العرق 1 تهرب من الاعتراف من قبل الكتلة Pto / Prf ، لأن AvrPto إما فقدت أو تحور في هذه السلالات ، ويبدو أن AvrPtoB تتراكم الحد الأدنى15،17،18.
مجموعات الطماطم البرية هي خزانات هامة من الاختلاف الطبيعي لمقاومة توقيت المحيط الهادي وقد استخدمت سابقا لتحديد المقاومة المحتملة loci19،20،21. ومع ذلك ، تستخدم الشاشات الحالية لمقاومة مسببات الأمراض النباتات البالغة التي يبلغ عمرها 4-5 أسابيع20،21. ولذلك، فهي محدودة من قبل وقت النمو، ومساحة غرفة النمو، وأحجام عينة صغيرة نسبيا. لمعالجة القيود المفروضة على النهج التقليدية، وضعنا عالية الإنتاجية الطماطم P. syringae اختبار المقاومة باستخدام 10 يوما من العمر شتلات الطماطم22. يوفر هذا النهج العديد من المزايا على استخدام النباتات البالغة: وهي وقت النمو الأقصر، وتقليل متطلبات المساحة، وارتفاع الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن هذا النهج يُلخص بأمانة الأنماط الظاهرية لمقاومة الأمراض التي لوحظت في النباتات البالغة22.
في الشتلات فيضان الاسهاص الموصوفة في هذا البروتوكول، تزرع شتلات الطماطم على أطباق بيتري من المعقمة Murashige وSkoog (MS) وسائل الإعلام لمدة 10 أيام ومن ثم يتم غمرها مع تلقيح يحتوي على البكتيريا ذات الاهتمام وsurfactant. بعد الفيضانات، يمكن تقييم الشتلات كميًا لمقاومة الأمراض عن طريق المقايسات البكتيرية للنمو. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون بقاء الشتلات أو الموت بمثابة مقاومة منفصلة أو النمط الظاهري للمرض 7-14 يوما بعد الفيضانات. هذا النهج يوفر بديلا عالية الإنتاجية لفحص أعداد كبيرة من انضمام الطماطم البرية لمقاومة سلالات سباق المحيط الهادي 1، مثل سلالة توقيت المحيط الهادي T1(توقيت المحيط الهاديT1)، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع سلالات بكتيرية أخرى من الفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد وصف بروتوكول لتلقيح الفيضانات مع توقيت المحيط الهاديDC3000 أو توقيت المحيط الهاديT1 الأمثل للكشف عن مقاومة لهذه السلالات البكتيرية في شتلات الطماطم. هناك العديد من المعلمات الحرجة للحصول على النتائج المثلى في تحليل مقاومة الشتلات ، بما في ذلك التركيز البكتيري وتركيز السطحي ، …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيمي كالما لاختبار تأثير حجم وسائل الإعلام على نتائج المرض أو المقاومة. نشكر الدكتور ة مايل بودين والدكتور كارل ج. شيبر من مختبر لويس على تقديم تعليقات واقتراحات بناءة حول المخطوطة. تم دعم البحوث على مناعة النبات في مختبر لويس من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ARS 2030-21000-046-00D و 2030-21000-050-00D (JDL)، ومديرية NSF للعلوم البيولوجية IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
Riferimenti
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. Genetica. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
