Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay
Summary
L’essai d’inondation de semis facilite le criblage rapide des adhésions de tomate sauvage pour la résistance à la bactérie de seringue de Pseudomonas. Cet essai, utilisé en conjonction avec l’essai de croissance bactérienne de semis, peut aider à caractériser davantage la résistance sous-jacente à la bactérie, et peut être employé pour dépister la cartographie des populations pour déterminer la base génétique de la résistance.
Abstract
La tomate est une culture d’importance agronomique qui peut être infectée par les seringues Pseudomonas, une bactérie Gram-négative, entraînant une maladie bactérienne des taches. La tomate-P. syringae pv. le pathosystem de tomate est employé couramment pour disséquer la base génétique des réponses innées de plante et de résistance de la maladie. Alors que la maladie a été gérée avec succès pendant de nombreuses décennies grâce à l’introduction de l’amas de gènes Pto/Prf de Solanum pimpinellifolium dans la tomate cultivée, les souches de la race 1 des seringues P. ont évolué pour surmonter la résistance conférée par le groupe génétique Pto/Prf et se produisent dans le monde entier.
Les espèces de tomates sauvages sont d’importants réservoirs de diversité naturelle dans la reconnaissance des agents pathogènes, parce qu’elles ont évolué dans divers environnements avec différentes pressions pathogènes. Dans les écrans typiques pour la résistance aux maladies dans la tomate sauvage, les plantes adultes sont utilisées, ce qui peut limiter le nombre de plantes qui peuvent être examinées en raison de leur temps de croissance prolongée et de plus grandes exigences d’espace de croissance. Nous avons mis au point une méthode pour dépister les semis de tomates vieux de 10 jours pour détecter la résistance, ce qui réduit au minimum le temps de croissance des plantes et l’espace de la chambre de croissance, permet un roulement rapide des plantes et permet de tester de grandes tailles d’échantillons. Les résultats de la survie ou de la mort peuvent être traités comme des phénotypes discrets ou sur une échelle de résistance définie par la quantité de nouvelle croissance des semis survivants après les inondations. Cette méthode a été optimisée pour filtrer les semis de tomates vieux de 10 jours pour la résistance à deux souches de seringues P. et peuvent facilement être adaptées à d’autres souches de seringues P.
Introduction
Pseudomonas syringae est une bactérie pathogène Gram-négative qui infecte un large éventail d’hôtes végétaux. Les bactéries pénètrent dans la plante hôte par les stomates ou les blessures physiques et prolifèrent dans l’apoplast1. Les plantes ont développé une réponse immunitaire à deux niveaux pour se protéger contre l’infection par des agents pathogènes bactériens. Le premier niveau se produit à la surface des cellules végétales, où les récepteurs de reconnaissance des motifs sur la membrane des cellules végétales perçoivent des modèles moléculaires hautement conservés associés aux agents pathogènes (PAMP) dans un processus appelé immunité déclenchée par pAMP (PTI)2. Au cours de ce processus, la plante hôte dérégère les voies de réponse de défense, y compris le dépôt de callose à la paroi cellulaire, la fermeture des stomates, la production d’espèces réactives d’oxygène, et l’induction des gènes liés à la pathogénie.
Les bactéries peuvent surmonter PTI en utilisant un système de sécrétion de type III pour fournir des protéines, appelés effecteurs, directement dans la cellule végétale3. Les protéines Effector ciblent généralement les composants de PTI et favorisent la virulence pathogène4. Le deuxième niveau d’immunité végétale se produit dans la cellule végétale lors de la reconnaissance des protéines effectrices. Cette reconnaissance dépend des gènes de résistance, qui codent la répétition du site de liaison nucléotide contenant des récepteurs (NLR). Les NLR sont capables soit de reconnaître directement les effecteurs, soit de reconnaître leur activité sur une cible de virulence ou leurre5. Ils déclenchent alors une réponse immunitaire secondaire dans un processus appelé l’immunité effector-déclenchée (ETI), qui est souvent associée à une réponse hypersensible (HR), une forme de mort cellulaire localisée au site de l’infection6. Contrairement à la résistance du gène pour gène associée à l’ETI, les plantes peuvent présenter une résistance partielle quantitative, qui dépend de la contribution de multiples gènes7.
P. syringae pv. tomate (Pst) est l’agent causal de la tache bactérienne sur la tomate et est un problème agricole persistant. Les souches prédominantes sur le terrain ont généralement été les souches de la course Pst 0 qui expriment l’un ou l’autre ou les deux des effecteurs de type III AvrPto et AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) est une souche représentative de race 0 et un modèle pathogène qui peut causer des taches bactériennes dans la tomate. Pour lutter contre la maladie bactérienne des taches, les éleveurs ont introgressé le Pto [P. syringae pv. tomate]/Prf [Pto résistance et sensibilité au fenthion] groupe génétique de l’espèce de tomate sauvage Solanum pimpinellifolium dans les cultivars modernes8,9. Le gène Pto code une protéine sérine-threonine kinase protéine qui, avec le Prf NLR, confère une résistance à PstDC3000 via la reconnaissance des effecteurs AvrPto et AvrPtoB10,11,12,13,14. Cependant, cette résistance est inefficace contre les souches émergentes de la course 1, ce qui permet leur propagation rapide et agressive ces dernières années15,16. Les souches de la course 1 échappent à la reconnaissance par le cluster Pto/Prf, parce qu’AvrPto est soit perdu, soit muté dans ces souches, et AvrPtoB semble s’accumuler au minimum15,17,18.
Les populations de tomates sauvages sont d’importants réservoirs de variation naturelle pour la résistance au Pst et ont déjà été utilisées pour identifier les loci de résistance potentielle19,20,21. Cependant, les écrans actuels pour la résistance aux agents pathogènes utilisent des plantes adultes de 4 à 5 semaines20,21. Par conséquent, ils sont limités par le temps de croissance, l’espace de chambre de croissance, et la taille relativement petite d’échantillon. Pour répondre aux limites des approches conventionnelles, nous avons développé un essai de résistance aux seringues de tomate P. à haut débit à l’aide d’semis de tomates de 10 jours22. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de plantes adultes : à savoir, un temps de croissance plus court, des besoins d’espace réduits et un débit plus élevé. En outre, nous avons démontré que cette approche récapitule fidèlement les phénotypes de résistance aux maladies observés chez les plantes adultes22.
Dans l’analyse d’inondation des semis décrite dans ce protocole, les semis de tomates sont cultivés sur des boîtes de Petri de murashige stérile et Skoog (MS) médias pendant 10 jours, puis sont inondés d’un inoculum contenant les bactéries d’intérêt et un surfactant. Après les inondations, les semis peuvent être évalués quantitativement pour la résistance aux maladies par le biais d’essais de croissance bactérienne. En outre, la survie ou la mort des semis peut agir comme une résistance discrète ou un phénotype de la maladie 7 à 14 jours après l’inondation. Cette approche offre une alternative à haut débit pour le dépistage d’un grand nombre d’accessions à la tomate sauvage pour la résistance aux souches de la course Pst 1, telles que la souche Pst T1(PstT1), et peut facilement être adaptée à d’autres souches bactériennes d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole d’inoculation d’inondation avec PstDC3000 ou PstT1 optimisé pour détecter la résistance à ces souches bactériennes dans les semis de tomates est décrit. Il existe plusieurs paramètres critiques pour des résultats optimaux dans l’essai de résistance aux semis, y compris la concentration bactérienne et la concentration de surfactant, qui ont été empiriquementdéterminés 22. Pour PstDC3000, la densité optique a été optimisée pour atteindr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jamie Calma d’avoir testé l’effet du volume des médias sur les maladies ou les résultats de la résistance. Nous remercions le Dr Mael Baudin et le Dr Karl J. Scheiber du Laboratoire Lewis d’avoir fourni des commentaires et des suggestions constructifs sur le manuscrit. La recherche sur l’immunité végétale dans le laboratoire Lewis a été soutenue par l’USDA ARS 2030-21000-046-00D et 2030-21000-050-00D (JDL), et la Direction des sciences biologiques de la NSF IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
Riferimenti
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