Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay
Summary
Il saggio sull’alluvione delle piantine facilita lo screening rapido delle adesioni di pomodoro selvatico per la resistenza al batterio delle siringhe Pseudomonas. Questo test, utilizzato in combinazione con il test della crescita batterica delle piantine, può aiutare a caratterizzare ulteriormente la resistenza sottostante al batterio e può essere utilizzato per lo screening delle popolazioni di mappatura per determinare la base genetica della resistenza.
Abstract
Il pomodoro è una coltura agronomicamente importante che può essere infettata da Pseudomonas siringae, un batterio Gram-negativo, con conseguente malattia del speck batterico. Il pomodoroP. siringa e pv. il sistema di patosistema del pomodoro è ampiamente usato per sezionare la base genetica delle risposte innate delle piante e della resistenza alle malattie. Mentre la malattia è stata gestita con successo per molti decenni attraverso l’introduzione del cluster genico Pto/Prf dal pimpinellifolium di Solanum al pomodoro coltivato, i ceppi di razza 1 di P. siringae si sono evoluti per superare la resistenza conferita dal cluster genico Pto/Prf e si verificano in tutto il mondo.
Le specie di pomodoro selvatico sono importanti serbatoi di diversità naturale nel riconoscimento dei patogeni, perché si sono evoluti in ambienti diversi con diverse pressioni dei patogeni. Negli schermi tipici per la resistenza alle malattie nel pomodoro selvatico, vengono utilizzate piante adulte, che possono limitare il numero di piante che possono essere sottoposte a screening a causa del loro tempo di crescita prolungato e dei maggiori requisiti di spazio di crescita. Abbiamo sviluppato un metodo per vagliare le piantine di pomodoro vecchie di 10 giorni per la resistenza, che riduce al minimo il tempo di crescita delle piante e lo spazio della camera di crescita, consente un rapido ricambio delle piante e consente di testare grandi dimensioni del campione. Gli esiti delle piantine di sopravvivenza o di morte possono essere trattati come fenotipi discreti o su una scala di resistenza definita dalla quantità di nuova crescita nelle piantine sopravvissute dopo l’inondazione. Questo metodo è stato ottimizzato per lo screening di piantine di pomodoro vecchie di 10 giorni per la resistenza a due ceppi di siringhe P. e può essere facilmente adattato ad altri ceppi di siringhe P.
Introduction
Pseudomonas syringae è un batterio patogeno Gram-negativo che infetta una vasta gamma di ospiti vegetali. I batteri entrano nella pianta ospite attraverso gli stomi o le ferite fisiche e proliferano nell’apoplasta1. Le piante hanno sviluppato una risposta immunitaria a due livelli per proteggersi dalle infezioni da agenti patogeni batterici. Il primo livello si verifica sulla superficie delle cellule vegetali, dove i recettori di riconoscimento dei pattern sulla membrana cellulare vegetale percepiscono modelli molecolari associati a i patogeni altamente conservati (PPAM) in un processo chiamato immunità innescata da PAMP (PTI)2. Durante questo processo, la pianta ospite upregulate i percorsi di risposta della difesa, tra cui la deposizione di callosi alla parete cellulare, la chiusura degli stomi, la produzione di specie reattive dell’ossigeno e l’induzione di geni patogeni-correlati.
I batteri possono superare la PTI utilizzando un sistema di secrezione di tipo III per fornire proteine, chiamate efcontadini, direttamente nella cellula vegetale3. Le proteine acchettori sono comunemente destinate ai componenti della PTI e promuovono la virulenza patogena4. Il secondo livello di immunità vegetale si verifica all’interno della cellula vegetale dopo il riconoscimento delle proteine eftraificatori. Questo riconoscimento dipende dai geni di resistenza, che codificano il sito legante nucleotide che contiene i recettori (NLR). Gli NLR sono in grado di riconoscere direttamente gli eftori o di riconoscere la loro attività su un bersaglio di virulenza o esca5. Quindi innescano una risposta immunitaria secondaria in un processo chiamato immunità attivata dagli effetti (ETI), che è spesso associata a una risposta ipersensibile (HR), una forma di morte localizzata delle cellule nel sito di infezione6. A differenza della resistenza gene-per-gene associata all’ETI, le piante possono presentare una resistenza quantitativa parziale, che dipende dal contributo di più geni7.
P. syringae pv. pomodoro (Pst) è l’agente causale di speck batterico sul pomodoro ed è un problema agricolo persistente. ceppi predominanti nel campo sono stati tipicamente Pst gara 0 ceppi che esprimono uno o entrambi gli effetti di tipo III AvrPto e AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) è un ceppo di razza 0 rappresentativo e un patogeno modello che può causare speck batterico nel pomodoro. Per combattere la malattia del cela batterico, gli allevatori hanno introretto il Pto [P. syringae pv. tomato]/Prf [ Resistenza al piatto e sensibilità alfenthion] cluster genico della specie di pomodoro selvatico Solanum pimpinellifolium nelle moderne cultivar8,9. Il gene Pto codifica una chinasi della proteina serine-threonine che, insieme alla Prf NLR, conferisce resistenza a PstDC3000 attraverso il riconoscimento degli effetti AvrPto e AvrPtoB10,11,12,13,14. Tuttavia, questa resistenza è inefficace contro le ceppi emergenti di gara 1, consentendo la loro rapida e aggressiva diffusione negli ultimi anni15,16. Gara 1 sforza eludere il riconoscimento da parte del cluster Pto / Prf, perché AvrPto è o perso o mutato in questi ceppi, e AvrPtoB sembra accumulare almeno15,17,18.
Le popolazioni di pomodori selvatici sono importanti serbatoi di variazione naturale per la resistenza Pst e sono stati precedentemente utilizzati per identificare i loci di resistenza potenziale19,20,21. Tuttavia, gli schermi attuali per la resistenza agli agenti patogeni utilizzano piante adulte di 4-5 settimane20,21. Pertanto, sono limitati dal tempo di crescita, spazio camera di crescita, e dimensioni del campione relativamente piccole. Per affrontare i limiti degli approcci convenzionali, abbiamo sviluppato un saggio di resistenza al pomodoro P. siringa ad alto contenuto di velocità utilizzando piantine di pomodoro di 10 giorni22. Questo approccio offre diversi vantaggi rispetto all’utilizzo di piante per adulti: vale a dire, tempi di crescita più brevi, requisiti di spazio ridotti e maggiore produttività. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo approccio ricapitola fedelmente i fenotipi di resistenza alle malattie osservati nelle piante adulte22.
Nell’alluvione delle piantine descritta in questo protocollo, le piantine di pomodoro vengono coltivate su piatti Petri di sterili supporti Murashige e Skoog (MS) per 10 giorni e poi vengono inondate da un inoculum contenente i batteri di interesse e un surfactant. In seguito alle inondazioni, le piantine possono essere valutate quantitativamente per la resistenza alle malattie attraverso saggi di crescita batterica. Inoltre, la sopravvivenza delle piantine o la morte possono agire come una resistenza discreta o fenotipo della malattia 7–14 giorni dopo l’inondazione. Questo approccio offre un’alternativa ad alto valore effettiva per lo screening di un gran numero di ascese di pomodoro selvatico per la resistenza ai ceppi Pst race 1, come il ceppo Pst T1 (PstT1), e può essere facilmente adattato ad altri ceppi batterici di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene descritto un protocollo per l’inoculazione delle inondazioni con PstDC3000 o PstT1 ottimizzato per rilevare la resistenza a questi ceppi batterici nelle piantine di pomodoro. Ci sono diversi parametri critici per risultati ottimali nel saggio di resistenza alle piantine, tra cui la concentrazione batterica e la concentrazione di surfactant, che sono stati empiricamente determinati22. Per PstDC3000, la densità ottica è stata ottimizzata per ottenere una completa s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jamie Calma per aver testato l’effetto del volume dei media sui risultati di malattia o resistenza. Ringraziamo il Dr. Maàl Baudin e il Dr. Karl J. Scheiber del Lewis Lab per aver fornito commenti costruttivi e suggerimenti sul manoscritto. La ricerca sull’immunità vegetale nel laboratorio di Lewis è stata sostenuta dall’USDA ARS 2030-21000-046-00D e 2030-21000-050-00D (JDL), e dal direzione delle scienze biologiche IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
Riferimenti
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