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Bioingegneria

High-Throughput Identifikation der Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomaten mit Seedling Flood Assay

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/60805
, ,
1Department of Plant and Microbial Biology,University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center,United States Department of Agriculture

Summary

Der Sämlingsfluttest erleichtert die schnelle Überprüfung von Wildtomaten-Beitritten auf die Resistenz gegen das Pseudomonas syringae Bakterium. Dieser Assay, der in Verbindung mit dem bakteriellen Wachstumstest verwendet wird, kann bei der weiteren Charakterisierung der zugrunde liegenden Resistenz gegen das Bakterium helfen und kann verwendet werden, um Kartierungspopulationen zu untersuchen, um die genetische Grundlage des Widerstands zu bestimmen.

Abstract

Tomate ist eine agronomisch wichtige Pflanze, die von Pseudomonas syringaeinfiziert werden kann, einem gramnegativen Bakterium, das zu einer bakteriellen Speckerkrankung führt. Die Tomaten-P. syringae pv. Tomatenpathosystem ist weit verbreitet, um die genetische Grundlage der pflanzenanten Reaktionen und Krankheitsresistenz zu sezieren. Während Die Krankheit über viele Jahrzehnte erfolgreich durch die Einführung des Pto/Prf-Genclusters aus Solanum pimpinellifolium in kultivierte Tomaten gemanagt wurde, haben sich Rassen-1-Stämme von P. Syringae entwickelt, um Resistenzen des Pto/Prf-Genclusters zu überwinden und weltweit vorzufinden.

Wilde Tomatenarten sind wichtige Reservoirs natürlicher Vielfalt bei der Erkennung von Krankheitserregern, da sie sich in verschiedenen Umgebungen mit unterschiedlichen Krankheitserregerdrücken entwickelt haben. In typischen Siebeinwänden zur Krankheitsresistenz in Wildtomaten kommen erwachsene Pflanzen zum Einsatz, die aufgrund ihrer verlängerten Wachstumszeit und des größeren Wachstumsraumbedarfs die Anzahl der Pflanzen begrenzen können, die gesiebt werden können. Wir haben eine Methode entwickelt, um 10 Tage alte Tomatensämlinge auf Resistenz zu prüfen, die die Pflanzenwachstumszeit und den Wachstumsraum minimiert, einen schnellen Umbruch von Pflanzen ermöglicht und große Probengrößen testen lässt. Die Samenergebnisse des Überlebens oder des Todes können als diskrete Phänotypen oder auf einer Resistenzskala behandelt werden, die durch die Menge des neuen Wachstums bei überlebenden Sämlingen nach Überschwemmungen definiert wird. Diese Methode wurde optimiert, um 10 Tage alte Tomatensämlinge auf Widerstand gegen zwei P. syringae-Stämme zu überprüfen und kann leicht an andere P. syringae-Stämme angepasst werden.

Introduction

Pseudomonas syringae ist ein gramnegatives pathogenes Bakterium, das eine breite Palette von Pflanzenwirten infiziert. Bakterien gelangen durch die Stomata oder physikalische Wunden in die Wirtspflanze und vermehren sich im Apoplast1. Pflanzen haben eine zweistufige Immunantwort entwickelt, um vor Infektionen durch bakterielle Krankheitserreger zu schützen. Die erste Ebene tritt an der Pflanzenzelloberfläche auf, wo Mustererkennungsrezeptoren auf der Pflanzenzellmembran hochkonservierte pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) in einem Prozess namens PAMP-triggered immunity (PTI)2wahrnehmen. Während dieses Prozesses reguliert die Wirtsanlage die Abwehrwege, einschließlich der Ablagerung von Callose an die Zellwand, dem Verschluss von Stomata, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und der Induktion pathogenesebezogener Gene.

Bakterien können PTI überwinden, indem sie ein Sekretionssystem des Typs III verwenden, um Proteine, sogenannte Effektoren, direkt in die Pflanzenzelle3zu liefern. Effektorproteine zielen häufig auf Komponenten von PTI ab und fördern die Pathogenvirulenz4. Die zweite Stufe der Pflanzenimmunität tritt innerhalb der Pflanzenzelle bei der Erkennung der Effektorproteine auf. Diese Erkennung ist abhängig von Resistenzgenen, die Nukleotid-bindende Stelle leucin-reiche Wiederholungsrezeptoren (NLRs) kodieren. NLRs sind in der Lage, Effektoren entweder direkt zu erkennen oder ihre Aktivität auf einem Virulenzziel oder Lockvogel5zu erkennen. Sie lösen dann eine sekundäre Immunantwort in einem Prozess namens Effektor-ausgelöste Immunität (ETI), die oft mit einer überempfindlichen Reaktion (HR) verbunden ist, eine Form des lokalisierten Zelltodes an der Stelle der Infektion6. Im Gegensatz zur Gen-für-Gen-Resistenz im Zusammenhang mit ETI können Pflanzen eine quantitative Partielleresistenz aufweisen, die vom Beitrag mehrerer Gene abhängt7.

P. syringae pv. Tomate (Pst) ist der Erreger von bakteriellen Flecken auf Tomaten und ist ein anhaltendes landwirtschaftliches Problem. Vorherrschende Stämme im Feld waren typischerweise Pst-Race 0-Stämme, die einen oder beide der Typ-III-Effektoren AvrPto und AvrPtoB ausdrücken. DC3000(PstDC3000) ist ein repräsentativer Race 0-Stamm und ein Modell-Erreger, der bakterielle Flecken in Tomaten verursachen kann. Zur Bekämpfung der bakteriellen Speckkrankheit introgressierten Züchter den Pto [P. syringae pv. tomato]/Prf [Pto resistance and fenthion sensitivity] gen cluster from the wild tomato species Solanum pimpinellifolium into modern cultivars8,9. Das Pto-Gen kodiert eine Serin-Threonin-Proteinkinase, die zusammen mit der Prf NLR eine Resistenz gegen PstDC3000 durch Erkennung der Effektoren AvrPto und AvrPtoB10,11,12,13,14verleiht. Allerdings ist dieser Widerstand wirkungslos gegen aufkommende Race 1-Stämme, die ihre schnelle und aggressive Ausbreitung in den letzten Jahren15,16ermöglichen. Race 1-Stämme umgehen der Erkennung durch den Pto/Prf-Cluster, da AvrPto entweder verloren geht oder in diesen Stämmen mutiert ist und AvrPtoB minimal15,17,18anzusammeln scheint.

Wilde Tomatenpopulationen sind wichtige Reservoirs der natürlichen Variation für Pst-Resistenz und wurden zuvor verwendet, um potenzielle Resistenz loci19,20,21zu identifizieren. Aktuelle Siebe auf Pathogenresistenz nutzen jedoch 4–5 Wochen alte erwachsene Pflanzen20,21. Daher sind sie durch Wachstumszeit, Wachstumskammerraum und relativ kleine Stichprobengrößen begrenzt. Um die Grenzen konventioneller Ansätze auszuräumen, haben wir einen Hochdurchsatz-Tomaten-P.-Syringae-Resistenz-Assay mit 10 Tage alten Tomatensämlingen22entwickelt. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung erwachsener Pflanzen: nämlich kürzere Wachstumszeit, geringerer Platzbedarf und höherer Durchsatz. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass dieser Ansatz die bei erwachsenen Pflanzen beobachteten Perhänotypen der Krankheitsresistenz getreu rekapituliert22.

In dem in diesem Protokoll beschriebenen Sämling-Fluttest werden Tomatensämlinge 10 Tage lang auf Petrischalen steriler Murashige- und Skoog-Medien (MS) angebaut und dann mit einem Inokulum überflutet, das die von Interesse verwendeten Bakterien und ein Tensid enthält. Nach Überschwemmungen können Sämlinge mittels bakterieller Wachstumstests quantitativ auf Krankheitsresistenz ausgewertet werden. Darüber hinaus kann das Überleben oder der Tod von Sämlingen 7-14 Tage nach der Überflutung als diskreter Resistenz- oder Krankheitsphänotyp fungieren. Dieser Ansatz bietet eine Alternative mit hohem Durchsatz für das Screening einer großen Anzahl von Wildtomaten-Beitritten auf Resistenz gegen Pst Race 1-Stämme, wie Pst-Stamm T1 (PstT1), und kann leicht an andere bakterielle Stämme von Interesse angepasst werden.

Protocol

1. Vorbereitung und Verwendung des Biosicherheitsschranks Biosicherheitsschrank mit 70% Ethanol abwischen. Schließen Sie die Schärpe und schalten Sie das ultraviolette Licht im Biosicherheitsschrank für 15 min ein. Nach 15 min schalten Sie das ultraviolette Licht im Biosicherheitsschrank aus. Heben Sie die Schärpe an und schalten Sie das Gebläse 15 min ein. Wischen Sie alle Gegenstände, die im Biosicherheitsschrank verwendet werden sollen, mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Ge…

Representative Results

Nachweis der PtoR-vermitteltenImmunität in Sorten und isogenen Linien mit dem SämlingsresistenztestAbbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse für Moneymaker-PtoR und Moneymaker-PtoS-Sorten 7-10 Tage nach dem Hochwasser mit PstDC3000. Vor der Infektion zeigten 10 Tage alte Sämlinge vollständig aufgetauchte und erweiterte Kotyledonen und entstehende erste echte Blätter. Die Sämlinge wurden mit 10 mM MgCl2 + 0,015% Ten…

Discussion

Ein Protokoll zur Hochwasserimpfung mit PstDC3000 oder PstT1, das optimiert ist, um Resistenzen gegen diese Bakterienstämme bei Tomatensämlingen zu erkennen, wird beschrieben. Es gibt mehrere kritische Parameter für optimale Ergebnisse im Sämlingsresistenztest, einschließlich der Bakterienkonzentration und Tensidkonzentration, die empirisch bestimmt wurden22. Für PstDC3000 wurde die optische Dichte optimiert, um ein vollständiges Überleben auf einer resistenten S…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Jamie Calma für die Prüfung der Wirkung des Medienvolumens auf Krankheits- oder Resistenzergebnisse. Wir danken Dr. Mael Baudin und Dr. Karl J. Scheiber vom Lewis Lab für die konstruktiven Kommentare und Anregungen zum Manuskript. Die Forschung zur Pflanzenimmunität im Lewis-Labor wurde von der USDA ARS 2030-21000-046-00D und 2030-21000-050-00D (JDL) und der NSF-Direktion für Biologische Wissenschaften IOS-1557661 (JDL) unterstützt.

Materials

3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) VWR International 56222-182
3mm borosilicate glass beads Friedrich & Dimmock GB3000B
Bacto peptone BD 211677
Bacto agar BD 214010
Biophotometer Plus Eppendorf E952000006
Biosafety cabinet, class II type A2
BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene VWR International 47744-642
Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks VWR International 500029-808
cycloheximide Research Products International C81040-5.0
Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade Fisher Scientific P288-500
Dimethylformamide
Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)
Ethanol – 190 Proof
Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom Fisher Scientific 08-772-3
Glass Alcohol Burner Wick Fisher Scientific S41898A / No. W-125
Glass Alcohol Burners Fisher Scientific S41898 / No. BO125
Glycerol ACS reagent VWR International EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666-A
Magnesium chloride, ACS grade VWR International 97061-356
Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade VWR International 97062-130
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL
Microcentrifuge tubes, 2.2 mL
Mini Beadbeater-96, 115 volt Bio Spec Products Inc. 1001
Murashige & Skoog, Basal Salts Caisson Laboratories, Inc. MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL Rainin L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL Rainin L8-20XLS
Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish VWR International 89107-632
Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish Fisher Scientific FB08-757-14
Polystyrene 150x15mm sterile petri dish Fisher Scientific 08-757-148
Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) Staples 1013131
Rifampicin Gold Biotechnology R-120-25
Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) Fisher Scientific NCO138454
Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 Rainin 17005091
Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 Rainin 17005093
VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" VWR International 82027-386
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Riferimenti

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High-throughputResistancePseudomonas Syringae Pv. TomatoTomatoSeedling Flood AssayBacterial PathogenWild AccessionsComplex Genetic BackgroundsFlood InoculationBacterial PathogensTomato SeedlingsSterileStratifyGrowth ChamberCotyledonsTrue LeavesPst T1InoculumOptical Density

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Hassan, J. A., Chau-Ly, I. J., Lewis, J. D. High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay. J. Vis. Exp. (157), e60805, doi:10.3791/60805 (2020).
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