シュードモナスシリンゲpvに対する耐性のハイスループット同定苗フラッドアッセイを用いたトマトのトマト
Summary
苗の洪水アッセイは、シュードモナスシリンガエ細菌に対する耐性のための野生のトマトの受診の迅速なスクリーニングを促進する。このアッセイは、苗菌増殖アッセイと組み合わせて使用され、細菌に対する根底にある耐性をさらに特徴付けるのに役立ち、かつ、マッピング集団をスクリーニングして抵抗の遺伝的基礎を決定するために使用することができる。
Abstract
トマトは、グラム陰性細菌であるシュードモナスシリンゲに感染し、細菌斑点病を引き起こす可能性のある農事学的に重要な作物です。トマト-P. シリンガエpv.トマトパソシステムは、植物の自然応答と耐病性の遺伝的基盤を解剖するために広く使用されています。ソラナム・ピンピネリフォリウムから栽培トマトへのPto/Prf遺伝子クラスターの導入により、病気は何十年もの間正常に管理されていましたが、P.シリンガエのレース1株はPto/Prf遺伝子クラスターによって与えられた抵抗を克服するために進化し、世界中で発生しています。
野生のトマト種は、異なる病原体の圧力を持つ多様な環境で進化したため、病原体認識における自然の多様性の重要な貯水池です。野生のトマトの耐病性の典型的なスクリーンでは、大人の植物が使用され、成長時間の延長と成長スペースの要件の増加のためにスクリーニングできる植物の数を制限することができます。植物の成長時間と成長室空間を最小限に抑え、植物の急速な回転を可能にし、大きなサンプルサイズをテストできる耐性のために10日齢のトマト苗をスクリーニングする方法を開発しました。生存または死の苗の結果は、離散表現型として、または洪水後に生き残った苗の新たな成長の量によって定義される抵抗スケールで扱うことができる。この方法は、2つのP.シリンガ株に対する耐性のために10日齢のトマト苗をスクリーニングするように最適化されており、他のP.シリンゲ株に容易に適応することができる。
Introduction
シュードモナスシリンゲは、広範囲の植物宿主に感染するグラム陰性病原菌である。細菌は、宿主植物に住み、または、心の傷を通して、アポプラスト1に増殖する。植物は、細菌病原体による感染から保護するために、2層の免疫応答を進化させた。第1レベルは植物細胞表面で起こり、植物細胞膜上のパターン認識受容体はPAMP誘発免疫(PTI)2と呼ばれるプロセスにおいて高度に保存された病原体関連分子パターン(PMP)を知覚する。このプロセスの間に、宿主植物は、細胞壁へのカロキスの沈着、気孔の閉鎖、活性酸素種の産生、および病原性関連遺伝子の誘導を含む防御応答経路を上方制御する。
細菌は、エフェクターと呼ばれるタンパク質を植物細胞3に直接送達するためにIII型分泌システムを利用することによってPTIを克服することができる。エフェクタータンパク質は、一般的にPTIの成分を標的とし、病原体の毒性を促進する 4.植物免疫の第2層は、エフェクタータンパク質の認識時に植物細胞内で発生する。この認識は、受容体(NlRs)を含むヌクレオチド結合部位ロイシンリッチリピートをコードする耐性遺伝子に依存する。NlRは、エフェクターを直接認識するか、毒性目標またはおとり5に対する活性を認識することができる。次いで、エフェクター誘発免疫(ETI)と呼ばれるプロセスにおいて二次免疫応答を引き起こし、これはしばしば過敏応答(HR)に関連する、感染部位における局所細胞死の一種である6。ETIに関連する遺伝子耐性とは対照的に、植物は、複数の遺伝子7の寄与に依存する定量的な部分抵抗性を示すことができる。
P. シリンガエpv.トマト(Pst)はトマトの細菌斑点の因果剤であり、持続的な農業上の問題である。この分野における主な株は、典型的には、タイプIIIエフェクターAvrPtoおよびAvrPtoBのいずれかまたは両方を発現するPstレース0株であった。DC3000(Pst DC3000)は、代表的なレース0株およびトマトに細菌斑点を引き起こす可能性のある病原体のモデルである。細菌斑病と闘うために、ブリーダーはPto[P.シリンガエpv.トマト]/Prf [Pto耐性とフェンチオン感受性]遺伝子クラスターを野生のトマト種ソラナムピンピネリフォリウムから現代の品種8,9に浸透させた。Pto遺伝子は、セリンスレオニンプロテインキナーゼをコードし、Prf NLRと共に、エフェクターAvrPtoおよびAvrPtoB 10、11、12、13、14の認識を介して、PstDC3000に対する耐性を付与する。しかし、この抵抗は、近年15、16で彼らの急速かつ積極的な広がりを可能にする、新興のレース1株に対して効果がありません。レース1株は、Pto/Prfクラスターによる認識を回避し、AvrPtoがこれらの株で失われるか変異し、AvrPtoBは最小15、17、18を蓄積するように見える。
野生のトマト集団は、Pst抵抗のための自然変動の重要な貯水池であり、以前に潜在的な抵抗loci19、20、21を同定するために使用されてきた。しかし、病原体耐性の現在のスクリーンは、4〜5週齢の成虫植物20,21を利用する。したがって、それらは、成長時間、成長室空間、および比較的小さいサンプルサイズによって制限される。従来のアプローチの限界に対処するために、我々は10日齢のトマト苗22を用いて高スループットトマトP.シリンゲ耐性アッセイを開発した。このアプローチは、大人の植物を使用する上で、いくつかの利点を提供します: すなわち、より短い成長時間、スペースの要件を減らし、より高いスループット。さらに、このアプローチが、成体植物22で観察される疾患耐性のフェノタイプを忠実に再現することを実証した。
このプロトコルに記載されている苗の洪水アッセイでは、トマトの苗は10日間無菌ムラシゲとスクーグ(MS)メディアのペトリ皿で栽培され、その後、関心のある細菌と界面活性剤を含む接種物であふれています。洪水の後、苗は細菌増殖アッセイを介して耐病性について定量的に評価することができる。さらに、苗の生存または死は、洪水の7〜14日後に離散性抵抗または疾患表現型として作用することができます。このアプローチは、Pst株T1(Pst T1)などのPstレース1株に対する耐性のために多数の野生トマトの受け入れをスクリーニングするためのハイスループットの代替手段を提供し、関心のある他の細菌株に容易に適応することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
トマト苗のこれらの細菌株に対する耐性を検出するように最適化されたPstDC3000またはPstT1による洪水接種のプロトコルについて説明します。苗の抵抗性アッセイにおいて最適な結果を得るためのいくつかの重要なパラメータがあり、細菌濃度および界面活性剤濃度を含む、経験的に22を決定した。PstDC3000の場合、光学密度は、Pto/Prfクラスタを含む?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
メディアボリュームが病気や抵抗の結果に及ぼす影響をテストしてくれたジェイミー・カルマに感謝します。ルイス・ラボのマエル・ボーディン博士とカール・J・シャイバー博士が、原稿に関する建設的なコメントや提案をしてくれたことに感謝します。ルイス研究所における植物免疫に関する研究は、USDA ARS 2030-21000-046-00Dおよび2030-21000-050-00D(JDL)とNSF生物科学局IOS-1557661(JDL)によって支えられていました。
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
Riferimenti
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