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Bioingegneria

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/60805
, ,
1Department of Plant and Microbial Biology,University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center,United States Department of Agriculture

Summary

모종 홍수 분석은 슈도모나스 주사기 박테리아에 대한 저항성을 위한 야생 토마토 접근물의 신속한 스크리닝을 용이하게 한다. 이 분석법은, 모종 세균 성장 분석과 함께, 박테리아에 대한 근본적인 저항성을 더욱 특성화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 저항의 유전적 기초를 결정하기 위해 매핑 인구를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

Abstract

토마토는 그람 음성 박테리아인 슈도모나스 주사기에감염되어 세균성 반점 질환을 초래할 수 있는 농업학적으로 중요한 작물입니다. 토마토-P. 주사기 pv. 토마토 병리 시스템은 널리 식물 타고난 반응과 질병 저항의 유전 기초를 해부하는 데 사용됩니다. 질병은 성공적으로 재배 토마토에 Solanum pimpinellium에서 Pto/Prf 유전자 클러스터의 도입을 통해 수십 년 동안 관리되었지만, P. 주사기의 경주 1 균주는 Pto/Prf 유전자 클러스터에 의해 수여된 저항을 극복하기 위하여 발전하고 전 세계적으로 발생합니다.

야생 토마토 종은 병원체 인식에서 자연 다양성의 중요한 저수지입니다, 그들은 다른 병원균 압력을 가진 다양한 환경에서 진화하기 때문에. 야생 토마토의 질병 저항에 대한 일반적인 화면에서 성인 식물이 사용되며, 이는 성장 시간이 길어지고 성장 공간 요구 사항이 커지므로 선별 할 수있는 식물의 수를 제한 할 수 있습니다. 우리는 식물의 성장 시간과 성장 챔버 공간을 최소화하고 식물의 빠른 회전율을 허용하며 큰 샘플 크기를 테스트 할 수있는 저항을위해 10 일 된 토마토 묘목을 선별하는 방법을 개발했습니다. 생존 또는 죽음의 묘목 결과는 홍수 후 살아남은 묘목의 새로운 성장양에 의해 정의된 이산 표현형 또는 저항 척도로 취급될 수 있습니다. 이 방법은 두 개의 P. 주사기 균주에 대한 저항성을 위해 10 일 된 토마토 묘목을 스크리크로 최적화되었으며 다른 P. 주사기 균주에 쉽게 적응 할 수 있습니다.

Introduction

슈도모나스 주사기는 광범위한 식물 숙주를 감염시키는 그람 음성 병원성 박테리아입니다. 세균은 구내 또는 물리적 상처를 통해 숙주 식물에 진입하여 apoplast1에서증식합니다. 식물은 세균성 병원체에 의한 감염으로부터 보호하기 위해 2계층 면역 반응을 진화시켰습니다. 첫번째 수준은 식물 세포 막에 패턴 인식 수용체가 PAMP 트리거된 면역 (PTI)에게 불린 프로세스에 있는 높게 보존된 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs)를 인식하는 식물 세포 표면에서 생깁니다2. 이 과정에서 숙주 식물은 세포벽에 칼로오스 증착, 구내 종단 폐쇄, 반응성 산소 종의 생산 및 병인 관련 유전자의 유도를 포함한 방어 반응 경로를 upregulates.

박테리아는 식물 세포3에직접 이펙터라고 불리는 단백질을 전달하기 위해 III 형 분비 시스템을 이용하여 PTI를 극복 할 수 있습니다. 이펙터 단백질은 일반적으로 PTI의 성분을 표적으로 하고 병원체독성을 촉진합니다 4. 식물 면역의 두 번째 단계는 이펙터 단백질을 인식하면 식물 세포 내에서 발생합니다. 이러한 인식은 레지스탕스 유전자에 의존하며, 이는 뉴클레오티드 결합 부위류신-풍부한 수용체(NLRs)를 함유하고 있다. NlR은 이펙터를 직접 인식하거나 독성 대상 또는 미끼5에서자신의 활동을 인식 할 수 있습니다. 그(것)들은 감염의 사이트에 현지화한 세포 죽음의 한 형태인 과민반응 (HR)과 수시로 연관되는 이펙터 트리거된 면역 (ETI)에게 불린 프로세스에 있는 이차 면역 반응을트리거합니다 6. ETI와 관련된 유전자 에 대한 유전자 저항과는 대조적으로, 식물은 다중 유전자7의기여에 의존하는 양적 부분 저항성을 나타낼 수 있다.

P. 주사기 pv. 토마토 (Pst)는토마토에 세균 성 반점의 인과 에이전트이며 지속적인 농업 문제입니다. 필드에 우세한 균주는 일반적으로 중 하나 또는 유형 III 이펙터 AvrPto 및 AvrPtoB의 둘 다를 표현하는 Pst 경주 0 균주되었습니다. DC3000(PstDC3000)은 대표적인 경주 0 균주 및 토마토에 세균 성 반점을 일으킬 수있는 모델 병원체입니다. 세균성 반점 질환에 대처하기 위해, 육종가들은 Pto [P. 주사기 pv. 토마토]/Prf [Pto 저항성 및 펜티온 민감성]유전자 클러스터를 야생 토마토 종솔라눔 포피넬리폴리움에서 현대 품종으로8,9. Pto 유전자는 Prf NLR과 함께, 이펙터 AvrPto 및 AvrPtoB10,11,12,13,14의인식을 통해 PstDC3000에 저항성을 부여하는 세린-트레오닌 단백질 키나아제인을 인코딩한다. 그러나, 이 저항은 신흥 인종에 대한 효과가 1 균주, 최근 몇 년 동안 자신의 신속하고 공격적인 확산을 허용15,16. 레이스 1 균주는 AvrPto가 이러한 균주에서 분실되거나 돌연변이되기 때문에 Pto / Prf 클러스터에 의한 인식을 회피하고 AvrPtoB는 최소15,17,18을축적하는 것으로 보입니다.

야생 토마토 개체군은 Pst 저항에 대한 자연변화의 중요한 저수지이며, 이전에는 잠재적 저항성 로시19,20,21을식별하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 병원체 저항에 대한 현재의 스크린은 4-5 주 령 성인 식물20,21를이용합니다. 따라서, 이들은 성장 시간, 성장 챔버 공간 및 상대적으로 작은 샘플 크기에 의해 제한된다. 종래의 접근법의 한계를 해결하기 위해 10일 된 토마토 묘목22를사용하여 고처리량 토마토 P. 주사기 저항 분석법을 개발했습니다. 이 접근 방식은 성인 용 식물을 사용하는 데 비해 몇 가지 이점을 제공합니다: 즉, 성장 시간 단축, 공간 요구 사항 감소 및 더 높은 처리량. 더욱이, 우리는 이 접근법이 성인 식물22에서관찰된 질병 저항 표현형을 충실하게 재현한다는 것을 입증했다.

본 프로토콜에 기재된 모종 홍수 분석에서, 토마토 모종은 10일 동안 멸균무라시게 및 스쿠그(MS) 매체의 페트리 접시상에서 재배된 후 관심 있는 박테리아및 계면활성제를 함유하는 접종제로 범람한다. 홍수 후, 모종은 세균 성장 분석을 통해 질병 저항성을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 또한, 모종 생존 또는 사망은 홍수 후 7-14일 후에 이산 저항성 또는 질병 표현형으로 작용할 수 있다. 이 접근법은 Pst 균주T1(PstT1)과 같은 Pst 경주 1 균주에 대한 저항성을 위해 많은 수의 야생 토마토 수탁을 스크리닝하기 위한 높은 처리량 대안을 제공하며, 관심 있는 다른 세균 균주에 쉽게 적응할 수 있다.

Protocol

1. 생체 안전 성 캐비닛의 준비 및 사용 70% 에탄올로 생체 안전 캐비닛을 닦아냅니다. 새시를 닫고 생체 안전 성 캐비닛에서 자외선을 15 분 동안 켭니다. 15 분 후, 생체 안전 성 캐비닛에서 자외선을 끕니다. 새시를 들어 올려 송풍기에서 15분 동안 켭니다. 살균 된 캐비닛에 품목을 넣기 전에 70 % 에탄올로 생체 안전 캐비닛에 사용할 모든 품목을 닦으하십시오. …

Representative Results

묘목 저항 성 분석기를 사용하여 품종 및 등화 선에서 PtoR-매개 면역 검출그림 5는 PstDC3000으로 홍수 후 머니메이커-PtoR 및 머니메이커-PtoS 품종 7-10일 의 대표적인 결과를 보여줍니다. 감염 되기 전에, 10 일 된 묘목 표시 완전히 등장 하 고 확장 된 자엽 과 신흥 첫 번째 진정한 잎. 모종은 0.005 + 0.015% 계면활성제의 광학 밀도에서 음의 …

Discussion

토마토 모종에서 이러한 세균 균주에 대한 저항성을 검출하도록 최적화된 PstDC3000 또는 PstT1을 사용하여 홍수 접종을 위한 프로토콜이 설명되어 있다. 세균 농도 및 계면활성제 농도를 포함하는 모종 저항성 분석에서 최적의 결과를 위한 몇 가지 중요한 파라미터가 있으며, 이는 경험적으로22로결정되었다. PstDC3000의 경우, 광학 밀도는 Pto/Prf 클러스터를…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 질병 이나 저항 결과에 미디어 볼륨의 효과 테스트 에 대 한 제이미 Calma 감사 합니다. 루이스 연구소의 마엘 보딘 박사와 칼 J. 셰이버 박사에게 원고에 대한 건설적인 의견과 제안을 해주신 것에 감사드립니다. 루이스 실험실에서 식물 면역에 대한 연구는 USDA ARS 2030-21000-046-00D 및 2030-21000-050-00D (JDL) 및 생물 과학 IOS-1557661 (JDL)에 대한 NSF 이사회(JDL)에 의해 지원되었습니다.

Materials

3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) VWR International 56222-182
3mm borosilicate glass beads Friedrich & Dimmock GB3000B
Bacto peptone BD 211677
Bacto agar BD 214010
Biophotometer Plus Eppendorf E952000006
Biosafety cabinet, class II type A2
BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene VWR International 47744-642
Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks VWR International 500029-808
cycloheximide Research Products International C81040-5.0
Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade Fisher Scientific P288-500
Dimethylformamide
Dissecting microscope (Magnification of at least 10x)
Ethanol – 190 Proof
Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom Fisher Scientific 08-772-3
Glass Alcohol Burner Wick Fisher Scientific S41898A / No. W-125
Glass Alcohol Burners Fisher Scientific S41898 / No. BO125
Glycerol ACS reagent VWR International EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666-A
Magnesium chloride, ACS grade VWR International 97061-356
Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade VWR International 97062-130
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL
Microcentrifuge tubes, 2.2 mL
Mini Beadbeater-96, 115 volt Bio Spec Products Inc. 1001
Murashige & Skoog, Basal Salts Caisson Laboratories, Inc. MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL Rainin L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL Rainin L8-20XLS
Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish VWR International 89107-632
Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish Fisher Scientific FB08-757-14
Polystyrene 150x15mm sterile petri dish Fisher Scientific 08-757-148
Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) Staples 1013131
Rifampicin Gold Biotechnology R-120-25
Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) Fisher Scientific NCO138454
Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 Rainin 17005091
Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 Rainin 17005093
VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" VWR International 82027-386
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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Hassan, J. A., Chau-Ly, I. J., Lewis, J. D. High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay. J. Vis. Exp. (157), e60805, doi:10.3791/60805 (2020).
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