Summary
प्रस्तुत विधि विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल सेलुलर प्रोटीन के दृश्य को सक्षम बनाती है जिससे पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर 70 एनएम का संकल्प होता है।
Abstract
ग्लोमरुलर एंडोथेलियम, ग्लोमरुलर बेसमेंट झिल्ली और पोडोसाइट्स से बने ग्लोमेरुलर फिल्टर का व्यवधान, एल्बुमिनुरिया में परिणाम है। पोडोसाइट पैर प्रक्रियाओं में ऐक्टिन बंडल होते हैं जो साइटोस्केलेटल एडाप्टर प्रोटीन जैसे पोडोसिन से बांधते हैं। वे एडाप्टर प्रोटीन, जैसे कि पोडोसिन, ग्लोमेरुलर स्लिट डायाफ्राम की रीढ़ को लिंक करते हैं, जैसे नेफ्रिन, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन से। स्वास्थ्य और रोग में ग्लोमर्युलर फिल्टर की भूमिका की समझ के लिए इन और अन्य पोडोसाइटिक प्रोटीन के स्थानीयकरण और कार्य का अध्ययन करना आवश्यक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता को पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ कोशिकाओं में ऐक्टिन, पोडोसिन और नेफ्रिन की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। सबसे पहले, कोशिकाओं को एक पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक से सना हुआ है। नमूने के भीतर सभी प्रोटीन तो एक सूजन हाइड्रोगेल के लिए सहसंयोजक लंगर डाले जाते हैं । प्रोटीन के साथ पाचन के माध्यम से, संरचनात्मक प्रोटीन अंतिम चरण में जेल की आइसोट्रॉपिकल सूजन की अनुमति देते हैं। पानी में नमूने के डायलिसिस के परिणामस्वरूप नमूने का 4-4.5 गुना विस्तार होता है और नमूने को पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के माध्यम से इमेज किया जा सकता है, जो 70 एनएम का संभावित समाधान प्रदान करता है।
Introduction
एल्बुमिनुरिया हृदय जोखिम का एक सरोगेट पैरामीटर है और ग्लोमेरुलर फिल्टर1के व्यवधान से परिणाम है। ग्लोमरुलर फिल्टर फेनेस्ट्रेटेड एंडोथेलियम, ग्लोमरुलर बेसमेंट झिल्ली और पोडोसाइट्स द्वारा गठित स्लिट डायाफ्राम से बना है। ग्लोमरूलम2की केशिका दीवार के चारों ओर पोडोसाइट्स की प्राथमिक और माध्यमिक पैर की प्रक्रियाएं लपेटती हैं । पैरों की प्रक्रियाओं की नाजुक संरचना कॉर्टिकल ऐक्टिन बंडलों द्वारा बनाए रखी जाती है जो कई स्लिट डायाफ्राम प्रोटीन और अन्य एडाप्टर प्रोटीन के लिए लंगर के रूप में भी काम करती है2। स्लिट डायाफ्राम की बैकबोन प्रोटीन को नेफ्रिन कहा जाता है और विरोध करने वाले पोडोसाइट्स के नेफ्रिन अणुओं के साथ होमोफिलिक तरीके से बातचीत करता है। विविध एडाप्टर प्रोटीन के माध्यम से, नेफ्रिन को ऐक्टिन साइटोस्केलेटन2,3 से जोड़ाजाताहै। नेफ्रिन-एन्कोडिंग जीन NPHS1 में उत्परिवर्तन फिनिश टाइप4के नेफ्रोटिक सिंड्रोम का कारण बनता है।
नेफ्रिन के इंटरैक्टिंग प्रोटीन में से एक पॉडोसिन है, जो स्टोमेटिन परिवार का हेयरपिन जैसा प्रोटीन है3। पोडोसिन नेफ्रिन को लिपिड राफ्ट में भर्ती करता है और इसे ऐक्टिन साइटोस्केलेटन5से जोड़ता है । पोडोसिन को NPHS2 जीन द्वारा एन्कोड किया जाता है। NPHS2 में उत्परिवर्तन स्टेरॉयड प्रतिरोधी नेफ्रोटिक सिंड्रोम6के लिए सीसा ।
ऐक्टिन एडाप्टर प्रोटीन की कल्पना और सह-स्थानीयकरण करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, प्रकाश की विवर्तन बाधा पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के संकल्प को 200-350 एनएम7तक सीमित करती है। उपन्यास माइक्रोस्कोपी तकनीक, उदाहरण के लिए, उत्सर्जन की कमी (एसटीडी)8,फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम)9,स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान या डस्टॉर्म) या ग्राउंड स्टेट विलोपन माइक्रोस्कोपी के बाद व्यक्तिगत अणु वापसी (जीएसडीएम)9,10,11,लगभग 10 एनएम तक एक संकल्प सक्षम करते हैं। हालांकि, इन सुपर रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के लिए अत्यधिक महंगी माइक्रोस्कोप, अच्छी तरह से प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है और इसलिए कई प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हैं।
विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM) एक उपन्यास और सरल तकनीक है जो पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम बनाती है और संभावित रूप से एक बड़े शोध समुदाय12के लिए उपलब्ध है। प्रोटीन प्रतिधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (प्रोएक्सएम) में, ब्याज (कोशिकाओं या ऊतक) का नमूना तय किया जाता है और फ्लोरोफोरस13के साथ दाग दिया जाता है। नमूने के भीतर प्रोटीन को एक छोटे अणु (6-(एक्रिलोइल)अमीनो) हेक्सानोइक एसिड, सुसिनिमिडिल एस्टर, एकेक्सी) द्वारा एक सूजन हाइड्रोगेल13में सहसंयोजक रूप से लंगर डाला जाता है। प्रोटीन के (प्रोके) के साथ एंजाइमेटिक पाचन के माध्यम से, प्रोटीन और फ्लोरोफोरसविस्तार 13के बाद जेल के भीतर अपनी सापेक्ष स्थिति बनाए रखते हैं। जेल की सूजन के बाद, नमूना 4.5 गुना (90-गुना वॉल्यूमेट्रिक विस्तार) तक फैलता है जिससे लगभग 60-70 एनएम (300 एनएम/4.5) का प्रभावी पार्श्व समाधान होता है। इस तकनीक के संशोधन 10 गुना विस्तार (1,000 गुना वॉल्यूमेट्रिक विस्तार) की अनुमति भी दे सकते हैं, जो पारंपरिक माइक्रोस्कोप14, 15, 16 पर 20-30एनएम का संकल्प प्रदान करसकतेहैं।
माउस और मानव गुर्दे की ग्लोमेरुलर संरचनाओं को एक्सएम17के माध्यम से कल्पना की गई है। इस पेपर के भीतर, हम एक विस्तृत प्रोएक्सएम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं के भीतर एफ-ऐक्टिन और ऐक्टिन-एडाप्टर प्रोटीन पोडोसिन की सुपर रिज़ॉल्यूशन छवियों की कल्पना करने के लिए है।
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Protocol
1. कोशिकाओं का विभाजन और सीडिंग
- 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और बाँझ ट्रिप्सिन सहित बाँझ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) को गर्म करें। स्वच्छ पीठ को सक्रिय करें।
- बाँझ संदंश का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से एक बाँझ ग्लास कवर स्लिप (10 मिमी) जोड़कर एक 6-अच्छी प्लेट तैयार करें।
- स्वच्छ पीठ के नीचे Cos7 कोशिकाओं के साथ एक 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान रखो। स्वच्छ पीठ के नीचे, वैक्यूम डिवाइस का उपयोग करके कोशिकाओं के माध्यम को एस्पिरेट करें।
- एक हाथ में अंगेटेड सेल कल्चर डिश पकड़ो और कोशिकाओं को धोने से बचने के लिए सेल कल्चर डिश के किनारे 10 एमएल बाँझ पीबीएस जोड़ें। सेल कल्चर डिश को नीचे रखें ताकि पीबीएस पूरी सेल कल्चर डिश को कुल्ला करे।
- पीबीएस निकालें और सेल कल्चर डिश के बीच में ट्राइपसिन का 1 एमएलए डालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- 10% एफसीएस सहित डीएमईएम के 10 एमएल जोड़कर ट्राइपसिनाइजेशन प्रतिक्रिया को रोकें और कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से अलग करने के लिए एक पिपेटर के साथ सेल समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
- एक गिनती कक्ष का उपयोग कर मिलीलीटर प्रति सेल संख्या का विश्लेषण करें।
- 6-अच्छी प्लेट में ग्लास कवर स्लिप पर 2 एमएल मीडियम प्रति अच्छी तरह से बीज 68,000 कोशिकाएं। 6-अच्छी प्लेट के भीतर कोशिकाओं को सावधानी से क्षैतिज और खड़ी प्लेट मिलाते हुए वितरित करें।
नोट: कोशिकाओं को बिखरे हुए झूठ बोलना चाहिए । - कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
2. कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
- दो बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब (पतला डीएनए (ए) के लिए एक और cationic लिपिड ट्रांसफैक्शन (बी)) के लिए पतला अभिकर्द के लिए एक तैयार करें। पिपेट 0.75 नेफ्रिन का माइक्रोग्राम और 0.75 माइक्रोग्राम पोडोसिन सीडीएनए अभिव्यक्ति प्लास्मिड प्रति अच्छी तरह से एक 1.5 एमएल ट्यूब में और इसे कम सीरम माध्यम के 100 माइक्रोन में पतला करें। दूसरे 1.5 एमएल ट्यूब में प्रति अच्छी तरह से 3 माइक्रोन डालें और कम सीरम माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ पतला करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए दोनों प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
- दोनों प्रतिक्रियाओं (ए और बी) को डीएनए-लिपिड परिसर में मिलाएं और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सावधानी से प्रत्येक अच्छी तरह से डीएनए लिपिड परिसर के २०० μL जोड़ें ।
- मध्यम को बदले बिना 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
3. सेलुलर संरचनाओं की इम्यूनोबेलिंग
- पीबीएस में फिक्सिंग सॉल्यूशन (4% (w/v) पैराफॉर्मलडिहाइड, 1 एमएल/वेल), परमीबिलाइजेशन सॉल्यूशन (०.५% (w/v) ट्राइटन एक्स-१०० पीबीएस में, 1 एमएल/वेल) तैयार करें, और पीबीएस में एक ब्लॉकिंग सॉल्यूशन (5% (v/v) बोविन सीरम एल्बुमिन, 1 एमएल/वेल) ।
- एक वैक्यूम डिवाइस के साथ माध्यम निकालें। अतिरिक्त माध्यम को हटाने के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें। पीबीएस को पूरी तरह से आकांक्षी करें।
नोट: PBS के साथ दूर कोशिकाओं को धोने से बचने के लिए, सीधे ग्लास कवर पर्ची पर नहीं PBS पिपेट करने के लिए सुनिश्चित करें । - 4% (w/v) पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें जो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में भंग हो जाते हैं ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, 3% (v/v) ग्लाइकॉक्सल-इथेनॉल18में कोशिकाओं को ठीक करें । - पीएफए और वॉश सेल को दो बार पीबीएस (2 एमएल प्रत्येक) में कांच के कवर स्लिप पर सीधे पिपटिंग से बचाकर छोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में ट्राइटन एक्स-100 0.5% (w/v) के साथ फिक्स्ड कोशिकाओं को पार करें।
- पारमेबिलाइजेशन समाधान निकालें और चरण 3.2 में इंगित पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
- पीबीएस में 5% (v/v) बीएसए के 1 ml को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जोड़कर कोशिकाओं को ब्लॉक करें । प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट (पीबीएस में 1% (v/v) बीएसए में एंटी-पोडोसिन एंटीबॉडी 1:200) रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें। - प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और चरण 3.2 में पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 1:1000 में 1% (v/v) PBS में बीएसए) जोड़ें। एक बॉक्स का उपयोग कर अंधेरे में कोशिकाओं को रखें।
- सेकेंडरी एंटीबॉडी को छोड़ें और तीन बार पीबीएस से धोएं।
- पीबीएस को हटा दें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 1% (v/v) बीएसए में एंटी-नेफ्रिन एंटीबॉडी 1:100 के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। एक बॉक्स का उपयोग कर अंधेरे में कोशिकाओं को रखें।
- पीबीएस निकालें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी गधा विरोधी गिनी सुअर ६३३, 1:200 के साथ इनक्यूबेट । पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। एक बॉक्स का उपयोग कर अंधेरे में कोशिकाओं को रखें।
4. विस्तार माइक्रोस्कोपी
- तैयारी
- जेलेशन चैंबर के लिए स्पेसर्स बनाने के लिए, हीरे के चाकू का उपयोग करके ग्लास कवर स्लिप #1.० और #1.5 को 5 मिमी धारियों (चार प्रत्येक प्रति ग्लास स्लाइड) में काट लें। #1.5 मिमी कवर स्लिप धारियों को रखें ताकि वे एक ग्लास स्लाइड पर 2.5 सेमी लंबाई का एक वर्ग बनाएं और उन्हें एक धुंधला कक्ष(चित्रा 2A1 -C1)में रखें। एक दूसरे को ग्लास कवर स्लिप धारियों का पालन करने के लिए और ग्लास स्लाइड(चित्रा2 A2-C2)के लिए वर्ग के कोनों में डीडीएच2ओ की एक बूंद पिपेट।
नोट: डीडीएच2ओ के पूर्ण सुखाने से बचें क्योंकि आसंजन बल खो जाएगा। यदि आवश्यक हो, तो डीडीएच2O की अधिक बूंदों को लगभग 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें ताकि चरण 4.1.2 से शुरू करने से पहले #1.5 मिमी कवर स्लिप को स्थिर रूप से संलग्न किया जा सके। - #1.5 मिमी कवर स्लिप पर चार #1.0 ग्लास कवर स्लिप रखें। प्रत्येक #1.5 मिमी कवर स्लिप धारी(चित्रा 2A3 -C3)पर एक बूंद को पाइप करके धारियों का पालन करें।
नोट: प्रोटोकॉल की प्रगति में हैंडलिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए जेल की मोटाई कम से कम 0.15 मिमी होनी चाहिए। हालांकि, कोशिकाओं के शीर्ष पर अत्यधिक जेल से बचने के लिए, स्पेसर्स ऊंचाई को सेल सब्सट्रेट के करीब रखें। स्पेसर्स के रूप में #1.5 और #1.0 कवर स्लिप धारियों का उपयोग करके, स्पेसर्स की ऊंचाई लगभग 0.3 मिमी होगी। कोशिकाएं कवर ग्लास (ऊंचाई 0.12 मिमी) का पालन करती हैं। इसलिए, जेल को संभालने के लिए काफी मोटी होगी लेकिन कोशिकाओं के शीर्ष पर अत्यधिक जेल को #1.0 और #1.5 कवर ग्लास धारियों का उपयोग करके टाला जाता है। - जेलेशन चैंबर ढक्कन के लिए, पैराफिन फिल्म के साथ एक कवर ग्लास (#1.5) लपेटें। पैराफिन फिल्म(चित्रा 2A5-C5)पर किसी भी सिलवटों या गंदगी से बचें।
- जेलेशन चैंबर के लिए स्पेसर्स बनाने के लिए, हीरे के चाकू का उपयोग करके ग्लास कवर स्लिप #1.० और #1.5 को 5 मिमी धारियों (चार प्रत्येक प्रति ग्लास स्लाइड) में काट लें। #1.5 मिमी कवर स्लिप धारियों को रखें ताकि वे एक ग्लास स्लाइड पर 2.5 सेमी लंबाई का एक वर्ग बनाएं और उन्हें एक धुंधला कक्ष(चित्रा 2A1 -C1)में रखें। एक दूसरे को ग्लास कवर स्लिप धारियों का पालन करने के लिए और ग्लास स्लाइड(चित्रा2 A2-C2)के लिए वर्ग के कोनों में डीडीएच2ओ की एक बूंद पिपेट।
- एंकरिंग और बहुलीकरण (जेलेशन)
- एंकरिंग बफर तैयार करें (टेबल 1देखें)। लंगर उपचार के लिए, पीबीएस को सीधे ग्लास कवर स्लिप पर प्रति अच्छी तरह से बफर एंकरिंग के 250 माइक्रोन के साथ प्रति- कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एक बॉक्स का उपयोग कर अंधेरे में सब्सट्रेट रखें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट । हर प्रयोग के लिए ताजा प्रस्तोता बफर तैयार करें और 10-15 मिनट तक इंतजार करें जब तक कि यह ठीक से भंग न हो जाए। 6-(एक्रिलॉयल) अमीनो) हेक्सानोइक एसिड, succinimidyl एस्टर (AcX) को हर 4-5 महीने में बदला जाना चाहिए ताकि पर्याप्त एंकरिंग सुनिश्चित की जा सके । - एंकरिंग बफर निकालें और एक बार 1.5 एमएल पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोएं।
- ऐक्टिन फाइबर दाग करने के लिए, एक ExM संगत phalloidin-समाधान गल और phalloidin के 5 μl 1% (v/v) PBS/वेल में बीएसए के μL में पतला phalloidin ) कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए । एक बॉक्स का उपयोग कर अंधेरे में नमूने रखें।
- इस दौरान सरगर्मी डिवाइस का इस्तेमाल करते हुए डीडीएच2ओ में सोडियम ऐक्रेलेट घोलें। बर्फ पर, मोनोमर समाधान तैयार करें (टेबल 1देखें)।
नोट: भंग सोडियम एक्रिलेट एक स्पष्ट और बेरंग समाधान होना चाहिए। यदि समाधान पीला है, तो नए सोडियम एक्रिलेट से बदलें। - बर्फ पर जेलिंग समाधान तैयार करें (तालिका 1देखें)। जेलिंग समाधान को जेलेशन चैंबर पर लागू करने से ठीक पहले जेलिंग समाधान में पिपेट अमोनियपेरॉक्सिड्सल्फेट (एपीएस)।
- कोशिकाओं से पीएलओडिन निकालें और कमरे के तापमान पर दो बार पीबीएस के 1.5 एमएल से धोएं। कांच कवर पर्ची पर नमूने को हटाने की सुविधा के लिए कुएं के भीतर 1.5 एमएल पीबीएस छोड़ दें।
- कवर ग्लास पर कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट से कवर ग्लास स्लिप उठाने के लिए संदंश और एक कैनुला का उपयोग करके जेलिंग कक्ष में रखें।
नोट: कोशिकाओं को कांच कवर पर्ची के शीर्ष पर होना चाहिए । ग्लास कवर स्लिप को स्पेसर्स को नहीं छूना चाहिए। - शीघ्र ही जेलिंग समाधान और भंवर में एपीएस जोड़ें। नमूना (चित्रा 2A4-C4)पर जेलिंग समाधान के पिपेट200माइक्रोनल। जेल(चित्रा 2A5 -C5)के भीतर हवाके बुलबुले से बचने के द्वारा जेलेशन कक्ष को सावधानी से बंद करें।
- गीले धुंधला कक्ष में जेल को पॉलीमराइज करने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जेलिंग कक्ष को इनक्यूबेट करें।
- एंकरिंग बफर तैयार करें (टेबल 1देखें)। लंगर उपचार के लिए, पीबीएस को सीधे ग्लास कवर स्लिप पर प्रति अच्छी तरह से बफर एंकरिंग के 250 माइक्रोन के साथ प्रति- कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एक बॉक्स का उपयोग कर अंधेरे में सब्सट्रेट रखें।
- समरूपता (पाचन)
- स्टेनिंग चैंबर को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। जेलेशन चैंबर ढक्कन खोलने के लिए, ढक्कन और स्पेसर के बीच एक रेजर ब्लेड पेश करें। ढक्कन को सावधानी से हटा दें। रेजर ब्लेड के साथ स्पेसर्स को हटा दें और रेजर ब्लेड से काटकर सभी अतिरिक्त जेल को खत्म करें।
- पीबीएस से भरी डिश में जेल और कवर ग्लास के साथ स्लाइड रखो। धीरे-धीरे हिलाकर, जेल से अलग कवर ग्लास निकालें। आसानी से डिश से जेल को हटाने के लिए, जेल को स्लाइड से अटैच करने के लिए जेल के नीचे स्लाइड डालें।
- स्लाइड पर जेल के साथ, रेजर ब्लेड का उपयोग करके जेल को छोटे टुकड़ों (जेल का चौथाई दो से तीन टुकड़ों में विभाजित किया जाता है) में विभाजित करें। धीरे-धीरे एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में जेल के एक टुकड़े को कांच के नीचे के साथ धक्का दें और इसे तूलिका द्वारा जोड़ें। जेल के निर्जलीकरण से बचने के लिए तूलिका का उपयोग कर पीबीएस की थोड़ी मात्रा के साथ जेल मॉइस्चराइज्ड रखें।
नोट: कोशिकाओं को नीचे की ओर चेहरा । - एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, विस्तार के बाद विस्तार कारक निर्धारित करने के लिए कम संख्यात्मक एपर्चर के साथ अवलोकन छवियों को लें।
- पाचन बफर तैयार करें (तालिका 1देखें)। पाचन समाधान प्राप्त करने के लिए पाचन बफर में 4 यू/एमएल के लिए पतला प्रोटीन के लिए ।
नोट: प्रोटीन के बिना पाचन बफर को 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - प्रत्येक अच्छी तरह से पाचन समाधान के 500 μL जोड़ें और समाधान के भीतर जेल विसर्जित कर दिया। इसे कमरे के तापमान पर रात भर पचाने दें और नमूनों को अंधेरे में रखते हुए ढक्कन बंद कर दें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, इसे 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने दें।
- विस्तार
- पाचन समाधान को पिपेट से निकालकर त्याग दें। डीडीएच 2 ओ के1एमसीएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए डूबे हुए जेल को इनक्यूबेट करें।
- पानी निकालें और ताजा ddH 2 O के1mL जोड़ें 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और विस्तार के एक पठार तक पहुंचने तक हर 10 मिनट में पानी का आदान प्रदान जारी रखें ।
नोट: 4.5 गुना तक नमूना विस्तार प्राप्त किया जा सकता है। जेल ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट हो जाता है।
- इमेजिंग
- जेल से पानी निकालें और सीधे माइक्रोस्कोपी शुरू करें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, मुख्य रूप से पूर्व विस्तार राज्य (चरण 4.3.4) में छवि कोशिकाओं को खोजने के लिए एक वायु उद्देश्य (कम आवर्धन) का उपयोग करें।
- बेहतर संकल्प के लिए 40x (तेल/पानी) और 63x उद्देश्य पर स्विच करें। ब्याज की तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजित करें और कैमरे के माध्यम से छवि लें।
- मान्यता
- नमूने की एक अवलोकन छवि लें। नमूना है कि चरण 4.3.4 में छवि थे के भीतर एक ही संरचनाओं का पता लगाएं और मिलान। सत्यापन के लिए सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात(चित्र 3 ए-बी)के साथ चैनल का उपयोग करें।
नोट: गैर-विस्तारित राज्य (चरण 4.3.4) में अधिग्रहीत छवि के समान चमक प्राप्त करने के लिए इमेजिंग मापदंडों को समायोजित करें। - उन्हें इमेजजे के साथ घुमाकर और स्थानांतरित करके पूर्व और बाद की विस्तार छवियों को ओवरले करें। स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य संरचनाओं के बीच की दूरी को मापने के लिए इमेजजे में दूरी मापने वाले उपकरण का उपयोग करें। कम से कम 10 विभिन्न संरचनाओं को मापें।
नोट: वैकल्पिक रूप से,14में वर्णित दूरी को मापने के लिए एक पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग करें । - विस्तार के बाद के माप को विभाजित करके विस्तार कारक की गणना करें ।
- विकृतियों को निर्धारित करने के लिए, उच्च संख्यात्मक एपर्चर(चित्र 4 ए-बी) केसाथ छवियां लें। इन छवियों को ओवरले करें और इमेजजे के साथ या जैसा कि15में वर्णित है, उनका विश्लेषण करें ।
नोट: विकृतियों का निर्धारण नियमित रूप से किया जाना चाहिए, लेकिन जरूरी नहीं कि हर नमूने पर ।
- नमूने की एक अवलोकन छवि लें। नमूना है कि चरण 4.3.4 में छवि थे के भीतर एक ही संरचनाओं का पता लगाएं और मिलान। सत्यापन के लिए सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात(चित्र 3 ए-बी)के साथ चैनल का उपयोग करें।
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Representative Results
इस प्रोएक्सएम प्रोटोकॉल की अवधारणा और समय को चित्र 1में दर्शाया गया है । 5 दिन, संक्रमित कोशिकाओं को तय किया जाता है और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ ब्याज के प्रोटीन को लक्षित(चित्रा 1A,बी)के साथ दाग रहे हैं । 6 दिन, AcX के साथ उपचार सभी प्रोटीन (फ्लोरोफोरस सहित)(चित्र 1A,बी)12पर अमीन समूहों के गठन की ओर जाता है । हाइड्रोगेल के बहुलीकरण पर, ये अमीन समूह हाइड्रोगेल (दिन 6) को सहसंयोजक रूप से बांधते हैं। जेल के बहुलीकरण के बाद, समरूपता (पाचन) प्रोटीन के साथ किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप कोशिका के संरचनात्मक प्रोटीन (दिन 6, चित्रा 1 ए,बी) का विनाश होताहै। फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी ज्यादातर पाचन के बाद संरक्षित रहते हैं। संरचनात्मक प्रोटीन के व्यवधान के कारण, हाइड्रोजेल के जल डायलिसिस के परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल के भीतर कोशिका का आइसोट्रोपिक विस्तार 7 दिन(चित्रा 1A,बी) होताहै। नमूने की इमेजिंग एक पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 1A)के साथ किया जाता है। विस्तार कारक निर्धारित करने और विकृतियों को बाहर करने के लिए डेटा सत्यापन किया जाना चाहिए(चित्रा 1A)।
कोशिका आइसोट्रोपिक रूप से विस्तार करने के लिए, जेलेशन चरण आवश्यक है। चित्रा 2 एक जेलेशन कक्ष के पार्श्व और शीर्ष दृश्य को दर्शाता है। ग्लास कवर स्लिप जेलेशन चैंबर(चित्रा 2A1-3/C1-3)के स्पेसर्स का निर्माण करते हैं । फिक्स्ड और सना हुआ कोशिकाओं के साथ कवर ग्लास कोशिकाओं के साथ एक ग्लास स्लाइड(चित्रा 2A4-C4)पर ऊपर की ओर तैनात है । जेलेशन चैंबर का ढक्कन पैराफिल्म से लपेटा जाता है और बंदबुलबुला-मुक्त (चित्रा 2A5-C5)है।
यह ExM प्रोटोकॉल चार गुना तक के विस्तार को सक्षम बनाता है। विस्तार कारक निर्धारित करने के लिए, विस्तार से पहले और बाद में छवि कोशिकाओं के लिए आवश्यक है(चित्रा 3A + B)। अपर्याप्त एंकरिंग और समरूपता कोशिकाओं की विकृतियों और टूटना का कारण बन सकती है। चित्रा 4A + B विभिन्न आवर्धन छवियों में उठी कोशिकाओं के प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है।
इस विधि का उपयोग एफ-ऐक्टिन और ऐक्टिन एडाप्टर प्रोटीन, जैसे, पोडोसिन और नेफ्रिन(चित्रा 5)के सह-स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जा सकता है। पोडोसिन को हरे रंग में चित्रित किया गया है जबकि ऐक्टिन को नीले रंग में लेबल किया गया है(चित्रा 5)। नेफ्रिन हरे रंग में चिह्नित है। सफेद क्षेत्र सह-स्थानीयकरण का संकेत देते हैं।
चित्रा 1:इस ExM प्रोटोकॉल की अवधारणा और समय। (A)"प्रोटोकॉल" कॉलम में, प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को रेखांकित किया गया है। (ए + बी) कोशिकाओं को सीडिंग और ट्रांसफेक्ट करने के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंट लेबलिंग (इम्यूनोलाबेलिंग) की जाती है। (ए + बी) छोटे अणु AcX (लाल डॉट) सभी प्रोटीन के लिए बांधता है और उन्हें हाइड्रोगेल (एंकरिंग) के लिए लंगर । (ए + बी) बहुलीकरण के माध्यम से फ्लोरोफोर सहित सभी प्रोटीन को एकेक्स के माध्यम से हाइड्रोजेल (बहुलकीकरण) के माध्यम से सहसंयोजक रूप से बाध्य किया जाता है। (ए + बी) समरूपता से संरचनात्मक मैट्रिक्स प्रोटीन का पाचन होता है। (ए + बी) पानी में डायलिसिस से विस्तार की प्राप्ति होती है। (A)इमेजिंग और इमेजिंग के सत्यापन प्रयोग को अंतिम रूप देता है। (क)पूरे प्रोटोकॉल के लिए 7 दिनों (कॉलम "दिन") की आवश्यकता होती है, जिसमें कई इनक्यूबेशन चरण (कुल समय प्रति दिन कॉलम "कुल समय") होता है, लेकिन वास्तविक बेंच समय संबंधित कॉलम "बेंच समय" में दर्शाया गया है। 14से संशोधित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:जेलेशन चैंबर का निर्माण। चार #1.5 कवर धारियों के साथ एक ग्लास स्लाइड का साइड व्यू(A1)और टॉप व्यू(B1 + C1)। ग्लास स्लाइड और कवर स्लिप धारियों के बीच पानी की एक बूंद जोड़कर, धारियों ग्लास स्लाइड(साइड व्यू A2,शीर्ष दृश्य B2, C2)का पालन करेंगे । #1.5 कवर धारियों पर पानी की बूंदों से #1.5 कवर धारियों(साइड व्यू ए 3, टॉप व्यू बी 3, सी 3)के शीर्ष पर रखी #1.0 कवर धारियों का आसंजन हो जाता है। कवर स्लिप पर नमूना संदंश का उपयोग करके आयत के बीच में रखा जाता है। जेल शीर्ष पर पाइप(साइड व्यू A4, टॉप व्यू बी 4, सी 4)है। (A5) साइड व्यू और असेंबल जेलेशन चैंबर का टॉप व्यू(B5 और C5)जिसमें बंद ढक्कन भी शामिल है जो पैराफिल्म में लिपटे कवर स्लिप से बनाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:विस्तार से पहले और बाद में कोशिकाएं। (ए)विस्तार से पहले कोशिकाएं ऐक्टिन के लिए दागदार होती हैं । बॉक्स इंगित करता है कि चित्रा 3B में विस्तारित कोशिकाएं किस क्षेत्र में झूठ बोलती हैं। (ख)विस्तार के बाद कोशिकाएं हरे रंग में लाल और पोडोसिन में ऐक्टिन के लिए दागदार होती हैं । पोडोसिन सेल परिधि में ऐक्टिन के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन, विस्तार कारक = 2। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:कोशिकाओं की विकृतियां और टूटना। (A + B)कॉस 7 कोशिकाओं की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां एक्टिन (लाल) के लिए इम्यूनो-दाग । कोशिकाओं को तय किया गया, दाग, लंगर, पचा और विस्तारित । (A)कोशिकाओं का टूटना। तीर उठी क्षेत्रों का संकेत दिया। स्केल बार = 5 माइक्रोन, विस्तार कारक = 4। (ख)कोशिकाओं का टूटना और विरूपण। सफेद तीर उठी क्षेत्रों का संकेत दिया। स्केल बार = 5 माइक्रोन, विस्तार कारक = 4। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5:पोडोसिन नेफ्रिन और ऐक्टिन के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। कॉस7 कोशिकाएं इम्यूनोफ्लोरोसेंटली में पोडोसिन, ऐक्टिन और नेफ्रिन के लिए लेबल की जाती हैं। (A)कॉस7 कोशिकाएं एक्सएम के साथ पोडोसिन (ग्रीन), ऐक्टिन (ब्लू) और नेफ्रिन (लाल) के लिए दाग हैं । पोडोसिन एक् समिन और नेफ्रिन के साथ सह-स्थानीयकरण करता है। स्केल बार = 200 एनएम, विस्तार कारक = 4. (ख)(ए),स्केल बार = 40 एनएम में इंगित क्षेत्र का आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| एंकरिंग बफर | अंतिम एकाग्रता | ||
| नाहको3 | 150 एमएमएम | ||
| एक्रिलोइल-एक्स, एसई (AcX) | 0.1 मिलीग्राम/मिलीलीटर | ||
| मोनोमर समाधान | स्टॉक समाधान एकाग्रता जी/100 मिलीलीटर | राशि (एमएल) | अंतिम एकाग्रता (जी/100 मिलीलीटर) |
| सोडियम एक्रिलेट | 38 | 2.25 | 8.6 |
| एक्रिलैमाइड | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-Methylenebisacrylamide | 2 | 0.75 | 0.15 |
| सादा नमक | 29.2 | 4 | 11.7 |
| पीबीएस | 10x | 1 | 1x |
| पानी | 0.75 | ||
| कुल | 9.4 | ||
| गेलिंग समाधान | स्टॉक समाधान एकाग्रता | राशि (माइक्रोन) | अंतिम एकाग्रता (मिलीग्राम/मिलीलीटर) |
| एकामेर समाधान | ना | 190 | ना |
| एपीएस | 10% | 4 | 0.1 |
| टेमेड | >99% | 4 | 0.1 |
| पानी | ना | 2 | ना |
| कुल | 200 | ||
| पाचन समाधान | अंतिम एकाग्रता | ||
| ट्रिस सीएल, पीएच 8.0 | 1 मीटर | ||
| EDTA पीएच 8.0 | 0.5 मीटर | ||
| ट्राइटन एक्स-100 | 0.005% | ||
| ग्वानिडिन एचसीएल | 8 मीटर | ||
| पानी | |||
| प्रोटीनेज कश्मीर | 4 यू/एमएल |
तालिका 1: ExM के लिए समाधान।
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Discussion
प्रस्तुत विधि अन्वेषक को सेलुलर प्रोटीन, जैसे, पोडोसिन, नेफ्रिन और साइटोस्केलेटल घटकों, जैसे एफ-ऐक्टिन की कल्पना करने में सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल के भीतर, संक्रमित cos7 कोशिकाओं को एफ-ऐक्टिन के साथ भट्ठा डायाफ्राम प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। दुर्भाग्य से, अमर पोडोसाइट सेल लाइनें स्लिट डायाफ्राम प्रोटीन19की पर्याप्त अंतर्जात मात्रा व्यक्त नहीं करती हैं।
इस विधि के साथ, पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ सेलुलर प्रोटीन की कल्पना की जा सकती है। प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) AcX के साथ हाइड्रोजेल के लिए प्रोटीन अमीन समूहों की पर्याप्त प्रस्तोता, 2) हाइड्रोजेल का पर्याप्त बहुलीकरण, 3) पाचन के लिए इष्टतम समय और 4) संगत फ्लोरोफोरस का चयन।
विस्तार के दौरान हाइड्रोगेल के भीतर प्रोटीन की स्थिति को बनाए रखने के लिए हाइड्रोगेल के लिए सेलुलर प्रोटीन का प्रस्तोता इस विधि के लिए आवश्यक है। AcX एक छोटा सा अणु है जो कोशिकाओं और ऊतकों के भीतर प्रोटीन के अमीन समूहों को बांधता है। AcX प्रोटीन के साथ एक कार्बन कार्बन डबल बैंड बनाता है, जो बहुलककरण चरण20में हाइड्रोगेल में प्रोटीन को शामिल करने में सक्षम बनाता है। AcX एंटीबॉडी को भी एकीकृत करता है ताकि एक्सएक्स उपचार से पहले इम्यूनोफ्लोरेसेंस एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग की जा सके। अपर्याप्त प्रस्तोता कोशिकाओं के टूटना और विकृतियों का कारण बन सकता है। फिक्सेटिव्स द्वारा अमीन समूहों के संशोधन के कारण, किसी को फिक्सेटिव या निर्धारण के समय को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अपर्याप्त भंडारण या गैर-अनुकूलित एंकरिंग स्थितियों के परिणामस्वरूप टूटना और विकृतियां हो सकती हैं। हमारे अनुभव के आधार पर, AcX 3-4 महीने से अधिक समय तक उपयोग किए जाने पर इसका इष्टतम प्रभाव खो देता है।
जेल का बहुलीकरण तापमान निर्भर है। इसलिए, हम बर्फ पर पॉलीमराइजेशन समाधान रखने की सलाह देते हैं, इससे पहले कि इसे जेलेशन चैंबर में पिपेटिंग करें। इसके अलावा, समय से पहले जेल गठन से बचने के लिए जेलेशन चरण के हैंडलिंग समय को कम (5 मिनट से कम) रखा जाना चाहिए। पॉलीमराइजेशन समाधान का पूरी तरह से मिश्रण असमान बहुलीकरण को रोकता है। हवा के बुलबुले नमूने को छूते समय विस्तार प्रक्रिया को प्रभावित करेंगे और अधिक बहुलकीकरण समाधान जोड़कर रोका जा सकता है।
हाइड्रोजेल के भीतर सेलुलर प्रोटीन के समावेश के बाद, विस्तार सुनिश्चित करने के लिए यांत्रिक समरूपता चरण (या पाचन) की आवश्यकता होती है। विभिन्न तरीकों, जैसे, गर्मी और डिटर्जेंट या एंजाइमेटिक पाचन,मौजूद है और जांच नमूना12, 14,20के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के भीतर, प्रोटीज प्रोटीनेज कश्मीर का उपयोग एंजाइमेटिक पाचन के लिए किया जाता है। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी सहित अधिकांश अन्य प्रोटीन ों को संरक्षित करते हुए संरचनात्मक प्रोटीन को नष्ट करने के लिए पर्याप्त खुराक पर प्रोटीन के रूप में लागू कियाजाताहै। यदि पाचन अधूरा है, तो नमूना विस्तार अपर्याप्त है। इसके अलावा, नमूना विस्तार प्रक्रिया(चित्रा 3)के दौरान फाड़ सकता है। यदि अपर्याप्त नमूना विस्तार हुआ है, तो पानी बदलने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, एंजाइमेटिक पाचन के लिए समय समायोजित किया जा सकता है या प्रोटीनेज कश्मीर का एक नया एलिकोट खोला जा सकता है।
यदि नमूना अधिक पचा जाता है, तो फ्लोरेसेंस सिग्नल कम हो जाएंगे। इस मामले में, पाचन समय को कम किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर एक्सएम में, नमूना14के वॉल्यूमेट्रिक विस्तार के कारण प्रति यूनिट फ्लोरेसेंस सिग्नल तीव्रता कम हो जाती है। इसलिए, इमेजिंग के दौरान लंबे समय तक एक्सपोजर समय पर विचार करने की आवश्यकता है।
एक्सएम संगत फ्लोरोफोरस का चयन करना आवश्यक है। पॉलीमराइजेशन चरण13के दौरान सायनिन रंगों को अपमानित किया जाता है । बैक्टीरियोफाइटोक्रोम्स पर आधारित फ्लोरेसेंस प्रोटीन भी काफी हद तक नष्ट हो जाते हैं13. हालांकि, अधिकांश जीएफपी जैसे प्रोटीनको 13 संरक्षितकिया जाएगा । इसके अलावा, स्ट्रेप्टाविडिन को पूर्व-विस्तार भी लागू किया जा सकता है, जो एक छोटे अणु टैग13के माध्यम से एस-नाइट्रोलिशेशन जैसे पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को लेबल करता है।
फालोइडिन, एक छोटा लेबलिंग अणु, ऐक्टिन साइटोस्केलेटन को लक्षित करने के लिए, ExM21के साथ संगत नहीं है। फालोइडिन के अपर्याप्त प्रस्तोता को दूर करने के लिए, ट्राइवेलेंट एंकरिंग (ट्राइटन)21शुरू किया गया है । यह दृष्टिकोण बायोमॉलिक्यूल्स21के एक साथ लक्ष्यीकरण, लेबलिंग और ग्राफ्टिंग प्रदान करता है।
इस विधि को दाग आरएनए अणुओं (ExFish)22में संशोधित किया जा सकता है। पुनरावर्तक विस्तार माइक्रोस्कोपी (आईएक्सएम) या X10 माइक्रोस्कोपी में, 60-70 एनएम के संकल्प को पहले विस्तारित हाइड्रोगेल के भीतर एक दूसरे सूजन योग्य जेल को लागू करके या एक अलग हाइड्रोगेल15, 16का उपयोग करके लगभग 25 एनएम तक बढ़ाया जा सकता है। अल्ट्रास्ट्रक्चर विस्तार माइक्रोस्कोपी (यू-एक्सएम) प्रोटीन के सुपर रिज़ॉल्यूशन को अल्ट्रास्ट्रक्चरल तत्व (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया, माइक्रोट्यूबल्स)23के लिए अपने एट्रिब्यूशन को संरक्षित करने में सक्षम बनाता है। एक्सफिश (आरएनए और डीएनए) और प्रोएक्सएम विधियों का संयोजन पहले22,24के रूप में भी किया गया है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्लिट डायाफ्राम प्रोटीन की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में संक्रमित cos7 कोशिकाओं का उपयोग करता है । हम उम्मीद करते हैं कि अन्य निवासी सुसंस्कृत गुर्दे की कोशिकाएं, उदाहरण के लिए, HEK293T कोशिकाओं, इसी तरह इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल लाइन के आधार पर, विभिन्न संस्कृति और ट्रांसफेक्शन स्थितियों के लिए समायोजन किए जाने की आवश्यकता हो सकती है।
ExM 70 एनएम13के पार्श्व स्थानिक संकल्प तक पहुंचने के बारे में 4 गुना तक इम्यूनो-दाग नमूनों के संकल्प को बढ़ाता है। अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों की तुलना में, एक्सएम पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप13, 14पर कियाजाताहै। इसलिए, एक्सएम विधि14का संचालन करने के लिए कोई महंगा उपकरण या विशेष रूप से प्रशिक्षित कामक आवश्यक नहीं है। भले ही सभी फ्लोरोफोरस एक्सएम के साथ संगत नहीं हैं, फिर भी सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी14के लिए आवश्यक फोटो-भौतिक गुणों के साथ अनुकूलित फ्लोरोफोरस के साथ आम तौर पर कई उपलब्ध एंटीबॉडी हैं। इस विधि का मुख्य नुकसान यह है कि एक्सएम जीवित नमूनों12,14के साथ असंगत है ।
भविष्य में, हाइड्रोगेल की रासायनिक संरचना में सुधार करने से भी अधिक स्थानिक संकल्प12हो सकता है। विभिन्न प्रोटोकॉलों के संयोजन से इस तरह के उच्च संकल्प12के साथ एक ही नमूने के भीतर परिसरों में प्रोटीन, आरएनए, डीएनए या लिपिड का दृश्य भी सक्षम हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक अपनी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ब्लैंका डुवंजक और निकोला कुहर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
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