Summary
Den presenterade metoden möjliggör visualisering av fluorescerande märkta cellulära proteiner med expansionsmikroskopi som leder till en upplösning på 70 nm på ett konventionellt mikroskop.
Abstract
Störningar av glomerular filtret består av glomerular endotel, glomerular källarmembran och podocyter, resulterar i albuminuria. Podocyt fotprocesser innehåller aktin buntar som binder till cytoskeletal adapter proteiner såsom podocin. Dessa adapterproteiner, såsom podocin, länkar ryggraden i det glomerulära slitsmembranet, såsom nephrin, till aktincytoskeletonet. Att studera lokalisering och funktion av dessa och andra podocytiska proteiner är avgörande för förståelsen av glomerulära filtrets roll i hälsa och sjukdom. Det presenterade protokollet gör det möjligt för användaren att visualisera aktin, podocin och nephrin i celler med superupplösningsavbildning på ett konventionellt mikroskop. För det första färgas celler med en konventionell immunofluorescensteknik. Alla proteiner i provet är sedan kovalst förankrade i en svällbar hydrogel. Genom matsmältningen med proteinas K klyvs strukturella proteiner som möjliggör isotropisk svullnad av gelén i det sista steget. Dialys av provet i vatten resulterar i en 4-4,5-faldig expansion av provet och provet kan avbildas via ett konventionellt fluorescensmikroskop, vilket ger en potentiell upplösning på 70 nm.
Introduction
Albuminuri är en surrogatparameter för kardiovaskulär risk och är resultatet av störningar i glomerulärt filter1. Det glomerulära filtret består av det fenestrerade endotel, det glomerulära källarmembranet och slitsmembranet som bildas av podocyter. Primära och sekundära fotprocesser av podocyter lindas runt den kapillärväggen i glomerulum2. Den känsliga strukturen hos fotprocesser upprätthålls av kortikala aktinbuntar som också fungerar som ankare för flera slitsmembranproteiner och andra adaptorproteiner2. Slitsmembranens ryggradsprotein kallas nephrin och interagerar på ett homofilt sätt med nephrinmolekyler av motsatta podocyter. Via olika adaptorproteiner är nephrin kopplad till aktin cytoskeleton2,3. Mutationer i nephrinkodningsgenen NPHS1 leder till nefrotiskt syndrom av den finska typ4.
Ett av nephrins interagerande proteiner är podocin, ett hårnålsliknande protein i stomatinfamiljen3. Podocin rekryterar nephrin till lipidflottar och länkar den till aktin cytoskeleton5. Podocin kodas av NPHS2-genen. Mutationer i NPHS2 leder till steroidresistent nefrotiskt syndrom6.
För att visualisera och samlokalisering av aktinadapterproteiner kan immunofluorescenstekniker användas. Tyvärr begränsar ljusets diffraktionsbarriär upplösningen av konventionella fluorescensmikroskop till 200-350 nm7. Nya mikroskopitekniker, t.ex. stimulerad utsläppsutarmning (STED)8, fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM)9, stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM eller dSTORM) eller markstatsborttagningsmikroskopi följt av individuell molekylåterkomst (GSDIM)9,10,11, möjliggör en upplösning upp till cirka 10 nm. Dessa superupplösningstekniker kräver dock mycket dyra mikroskop, välutbildad personal och finns därför inte i många laboratorier.
Expansionsmikroskopi (ExM) är en ny och enkel teknik som möjliggör superupplösningsavbildning med konventionella mikroskop och är potentiellt tillgänglig för ett stort forskarsamhälle12. Vid proteinretentionsexpansionmikroskopi (proExM) fixeras och färgas provet av intresse (celler eller vävnad) med fluoroforer13. Proteiner i provet är sedan kovalst förankrade av en liten molekyl (6-(Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, AcX) till en svällbar hydrogel13. Genom enzymatisk matsmältning med proteinas K (ProK) bibehåller proteiner och fluoroforer sin relativa position i gelén efter expansion13. Efter svullnad av gelén expanderar provet upp till 4,5 gånger (90-faldig volymetrisk expansion) vilket leder till en effektiv lateral upplösning på cirka 60-70 nm (300 nm/4,5). Modifieringar av denna teknik kan till och med möjliggöra en 10-faldig expansion (1 000-faldig volymetrisk expansion), vilket ger en upplösning på 20-30 nm på konventionella mikroskop14,15,16.
Glomerulära strukturer av mus och mänskliga njurar har visualiserats via ExM17. I detta dokument presenterar vi ett detaljerat proExM-protokoll för att visualisera superupplösningsbilder av F-aktin och actin-adapterprotein podocin i celler med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Delning och sådd av celler
- Värm upp sterilt Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inklusive 10% fetalt kalvserum (FCS), steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och steril trypsin till 37 °C. Aktivera den rena bänken.
- Förbered en 6-brunnsplatta genom att tillsätta en steril glaskåpa (10 mm) till varje brunn med sterila tångar.
- Lägg en 10 cm cellkulturrätt med Cos7-celler under den rena bänken. Aspirera cellernas medium under den rena bänken med hjälp av en vakuumanordning.
- Håll den kantade cellkulturrätten i ena handen och tillsätt 10 ml steril PBS på sidan av cellkulturrätten för att undvika sköljning av celler. Lägg ner cellkulturskålen så att PBS sköljer hela cellkulturrätten.
- Ta bort PBS och tillsätt 1 ml trypsin i mitten av cellkulturskålen och inkubera i 5 minuter vid 37 °C.
- Stoppa trypsiniseringsreaktionen genom att lägga till 10 ml DMEM inklusive 10% FCS och pipett celllösningen upp och ner med en pipetor för att manuellt separera cellerna.
- Analysera cellnumret per milliliter med hjälp av en räknekammare.
- Frö 68 000 celler i 2 ml medium per brunn på glaslocket glider i 6-brunnsplattan. Fördela cellerna i 6-brunnsplattan genom att försiktigt skaka plattan horisontellt och vertikalt.
OBS: Cellerna ska ligga utspridda. - Inkubera cellerna över natten i en inkubator på 37 °C med 5 % CO2.
2. Transfektion av celler
- Förbered två sterila 1,5 ml-rör (ett för utspädd DNA (A) och ett för utspädd reagens för katjonlipidtransfektion (B)). Pipett 0,75 μg nefräs och 0,75 μg podocin cDNA uttryck plasmid per brunn i ett 1,5 ml rör och späd det till 100 μL reducerat serummedium per brunn. Tillsätt 3 μL katjonlipidtransfection reagens per brunn till det andra 1,5 ml-röret och späd med 100 μL reducerat serummedium. Inkubera båda reaktionerna i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kombinera båda reaktionerna (A och B) till ett DNA-lipidkomplex och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt försiktigt 200 μL av DNA-lipidkomplexet till varje brunn.
- Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 °C med 5 % CO2 i 48 timmar utan att byta medium.
3. Immunolabeling av cellulära strukturer
- Förbered en fixeringslösning (4% (w/v) paraformaldehyd i PBS, 1 ml/brunn), permeabiliseringslösningen (0,5% (w/v) Triton X-100 i PBS, 1 ml/brunn) och en blockeringslösning (5% (v/v) bovin serumalbumin i PBS, 1 ml/brunn).
- Ta bort mediet med en vakuumanordning. Tillsätt 2 ml PBS till varje brunn för att ta bort extra medium. Aspirera PBS helt.
OBS: För att undvika att tvätta bort celler med PBS, se till att pipetten PBS inte glider direkt på glaskåpan. - Fixera celler med 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA) upplöst i PBS i 10 min vid rumstemperatur.
OBS: Alternativt, fixa celler i 3% (v/v) glyoxal-etanol18. - Kassera PFA och tvätta cellerna två gånger i PBS (2 ml vardera) genom att undvika direkt rörning på glaskåpans glidningar. Permeabilisera de fasta cellerna med Triton X-100 0,5% (w/v) i PBS i 10 min vid rumstemperatur.
- Ta bort permeabiliseringslösningen och tvätta två gånger med PBS enligt steg 3.2.
- Blockera cellerna genom att tillsätta 1 ml 5% (v/v) BSA i PBS i 1 timme vid rumstemperatur. Inkubera cellerna med 200 μL av den primära antikroppen (anti-podocinantikropp 1:200 i 1% (v/v) BSA i PBS) över natten vid 4 °C.
OBS: Alternativt kan du inkubera den primära antikroppen i 1 timme vid rumstemperatur. - Ta bort den primära antikroppen och tvätta tre gånger med PBS enligt steg 3.2. Tillsätt den sekundära antikroppen (getantikanin Alexa 488 1:1000 i 1% (v/v) BSA i PBS) i 1 h vid rumstemperatur. Håll cellerna i mörker med hjälp av en ruta.
- Kassera den sekundära antikroppen och tvätta med PBS tre gånger.
- Ta bort PBS och inkubera cellerna med 200 μL anti-nephrinantikropp 1:100 i 1% (v/v) BSA i PBS i 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta med PBS tre gånger. Håll cellerna i mörker med hjälp av en ruta.
- Ta bort PBS och inkubera med den sekundära antikropps åsnan anti-marsvin 633, 1:200, i 1 h vid rumstemperatur. Tvätta med PBS tre gånger. Håll cellerna i mörker med hjälp av en ruta.
4. Expansionsmikroskopi
- Förberedelse
- För att bilda distanserna för geleringskammaren glider det skurna glasskyddet #1,0 och #1,5 i 5 mm ränder (fyra vardera per glasrutschbana) med en diamantkniv. Placera #1,5 mm täckspingbanden så att de bildar en kvadrat på 2,5 cm längd på en glasrutschbana och placera dem i en målningskammare (figur 2A1-C1). Pipett en droppe ddH2O in i hörnen av torget för att fästa glaslockets glidremsor på varandra och på glasrutschbanan (Bild 2A2-C2).
OBS: Undvik fullständig torkning av ddH2O eftersom vidhäftningskraften kommer att gå förlorad. Vid behov applicera fler droppar ddH2O. Vänta i ca 20 min så att #1,5 mm täckslipsar fästs stabilt innan du börjar med steg 4.1.2. - Placera fyra #1,0 glasskyddsband per kåpa på #1,5 mm täckslipsar. Fäst ränderna genom att pipetting en droppe på varje #1,5 mm täckspingremsa(Figur 2A3-C3).
OBS: Gelens tjocklek bör vara minst 0,15 mm för att underlätta hanteringen av protokollets förlopp. Men för att undvika överdriven gel ovanpå cellerna, håll distanserna höjd nära cellsubstratet. Genom att #1,5 #1,0 täcksningband som distanser blir distanshöjden cirka 0,3 mm. Cellerna fäster vid täckglaset (höjd 0,12 mm). Därför kommer gelén att vara tjock nog att hantera men överdriven gel ovanpå cellerna undviks med #1,0 och #1,5 täckglasremsor som distanser. - För gelationskammarens lock, linda in ett täckglas (#1,5) med paraffinfilm. Undvik veck eller smuts på paraffinfilmen(bild 2A5-C5).
- För att bilda distanserna för geleringskammaren glider det skurna glasskyddet #1,0 och #1,5 i 5 mm ränder (fyra vardera per glasrutschbana) med en diamantkniv. Placera #1,5 mm täckspingbanden så att de bildar en kvadrat på 2,5 cm längd på en glasrutschbana och placera dem i en målningskammare (figur 2A1-C1). Pipett en droppe ddH2O in i hörnen av torget för att fästa glaslockets glidremsor på varandra och på glasrutschbanan (Bild 2A2-C2).
- Förankring och polymerisation (gelering)
- Förbereda förankringsbufferten (se tabell 1). För förankring av behandling, ersätt PBS med 250 μL förankringsbuffert per brunn direkt på glaskåpan och inkubera i 3 timmar vid rumstemperatur. Håll underlaget i mörkret med hjälp av en låda.
OBS: Alternativt kan du inkubera över natten vid rumstemperatur. Förbered färsk förankringsbuffert för varje experiment och vänta i 10-15 min tills den är ordentligt upplöst. 6-((Acryloyl)amino)hexanosyra, succinimidylester (AcX) bör bytas ut var 4-5 månader för att säkerställa adekvat förankring. - Ta bort förankringsbufferten och tvätta en gång med 1,5 ml PBS per brunn.
- För att färga aktinfibrer, tina en ExM-kompatibel falloidinlösning och inkubera falloidin (5 μL falloidin utspädd i 195 μL på 1% (v/v) BSA i PBS/brunn) i 45 min vid rumstemperatur. Förvara proverna i mörker med hjälp av en låda.
- Lös under tiden natriumarylat i ddH2O med hjälp av en omrörningsenhet. På is bereder du monomerlösningen (se tabell 1).
OBS: Upplöst natriumarylat ska vara en klar och färglös lösning. Om lösningen är gul, ersätt med ny natriumarylat. - Bered geleringslösningen på is (se tabell 1). Pipett ammoniumperoxidsulfat (APS) i geleringslösningen precis innan geleringslösningen appliceras på gelationskammaren.
- Ta bort falloidin från cellerna och tvätta med 1,5 ml PBS två gånger vid rumstemperatur. Lämna 1,5 ml PBS i brunnen för att underlätta avlägsnandet av provet på glaskåpan.
- Placera cellerna på täckglaset i geleringskammaren med tång och en kanyl för att lyfta täckglaset från 6-brunnsplattan.
OBS: Cellerna ska vara på toppen av glaskåpan. Glaskåpan ska inte vidröra distanserna. - Tillsätt APS till geleringslösningen och virveln inom kort. Pipett 200 μL geleringslösning på provet (figur 2A4-C4). Stäng geleringskammaren försiktigt genom att undvika luftbubblor i gelén (Figur 2A5-C5).
- Inkubera geleringskammaren i minst 1 timme vid 37 °C för att polymerisera gelén i våtfärgkammaren.
- Förbereda förankringsbufferten (se tabell 1). För förankring av behandling, ersätt PBS med 250 μL förankringsbuffert per brunn direkt på glaskåpan och inkubera i 3 timmar vid rumstemperatur. Håll underlaget i mörkret med hjälp av en låda.
- Homogenisering (matsmältning)
- Ta ut färgkammaren ur inkubatorn. För att öppna gelationskammarens lock, introducera ett rakblad mellan locket och distansen. Ta försiktigt bort locket. Ta bort distanserna med rakbladet och eliminera all extra gel genom att skära den med rakbladet.
- Lägg rutschkanan med gelén och täckglaset i en skål fylld med PBS. Genom att skaka försiktigt, ta bort det fristående täckglaset från gelén. För att enkelt ta bort gelén från skålen, sätt glidningen under gelén för att fästa gelén på bilden.
- Med gelén på bilden, dela gelén i små bitar (fjärdedelen av gelén är uppdelad i två till tre stycken) med rakbladet. Tryck försiktigt en bit gel i en brunn av en 6-brunnsplatta med glasbotten och omformka den med en pensel. Håll gelén återfuktad med en liten mängd PBS med pensel för att undvika uttorkning av gelén.
OBS: Cellerna är vända nedåt. - Använd ett inverterat mikroskop och ta översiktsbilder med låg numerisk bländare för att bestämma expansionsfaktorn efter expansionen.
- Förbereda rötningsbufferten (se tabell 1). Späd proteinas K till 4 U/ml i matsmältningsbufferten för att få matsmältningslösningen.
OBS: Rötbuffert utan Proteinas K kan förvaras vid 4 °C i 1-2 veckor. - Tillsätt 500 μL av matsmältningslösningen till varje brunn och sänk ner gelén i lösningen. Låt det smälta över natten vid rumstemperatur och stäng locket och håll proverna i mörkret.
OBS: Alternativt, låt den smälta vid 37 °C i 1 timme.
- Expansion
- Ta bort rötningslösningen med en pipett och kassera den. Tillsätt 1 ml ddH2O. Inkubera den nedsänkta gelén i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort vattnet och tillsätt 1 ml färsk ddH2O. Vänta i 10 min och fortsätt att byta vatten var 10: e minut tills en platå av expansion nås.
OBS: Provexpansion upp till 4,5 gånger kan uppnås. Gelén blir optiskt klar.
- Imaging
- Ta bort vattnet från gelén och starta direkt mikroskopi. Använd ett inverterat mikroskop och använd främst ett luftmål (låg förstoring) för att hitta bildceller i förexpansionstillstånd (steg 4.3.4).
- Byt till ett 40x (olja/vatten) och 63x mål för bättre upplösning. Hetsa upp med våglängden av intresse och ta bilden via kameran.
- Validering
- Ta en översiktsbild av exemplet. Hitta och matcha samma strukturer i exemplet som avbildades i steg 4.3.4. Använd kanalen med det bästa signal-till-brusförhållandet för validering(bild 3 A-B).
OBS: Justera bildparametrarna för att uppnå liknande ljusstyrka som i bilden som förvärvats i icke-expanderat tillstånd (steg 4.3.4). - Överlagra bilder före och efter expansion genom att rotera och flytta dem med ImageJ. Använd avståndsmätningsverktyget i ImageJ för att mäta avstånden mellan tydligt identifierbara strukturer. Mät minst 10 olika strukturer.
Obs: Alternativt kan du använda ett Python-skript för att mäta avstånd enligtbeskrivningen i 14. - Beräkna expansionsfaktorn genom att dividera mätningar efter/före expansion.
- För att bestämma förvrängningar, ta bilder med en högre numerisk bländare (Bild 4A-B). Överlagra dessa bilder och analysera dem med ImageJ eller enligt beskrivningen i15.
OBS: Bestämning av snedvridningar bör utföras rutinmässigt men inte nödvändigtvis på varje prov.
- Ta en översiktsbild av exemplet. Hitta och matcha samma strukturer i exemplet som avbildades i steg 4.3.4. Använd kanalen med det bästa signal-till-brusförhållandet för validering(bild 3 A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konceptet och tidpunkten för detta proExM-protokoll visas i figur 1. Dag 5 är transfekterade celler fixerade och färgade med fluorescerande antikroppar riktade mot det protein som är av intresse(figur 1A,B). Dag 6 leder behandling med AcX till bildandet av amingrupper på alla proteiner (inklusive fluorforer) (figur 1A,B)12. Vid polymerisation av hydrogelen binder dessa amingrupper kovalently till hydrogelen (dag 6). Efter polymerisation av gelén utförs homogenisering (matsmältning) med proteinas K vilket resulterar i destruktion av cellens strukturella proteiner (dag 6, figur 1A,B). Fluorescerande märkta antikroppar förblir mestadels bevarade efter matsmältningen. På grund av störningar av strukturella proteiner resulterar vattendialys av hydrogelen i isotropisk expansion av cellen i hydrogelen dag 7(figur 1A,B). Avbildning av provet utförs med ett konventionellt fluorescensmikroskop (figur 1A). Datavalidering för att fastställa expansionsfaktorn och utesluta snedvridningar bör utföras (figur 1A).
För att utföra expansion av cellen isotropiskt är geleringssteget viktigt. Figur 2 visar den laterala och övre vyn av en gelationskammare. Glaskåpans glidningar bygger geleringskammarens distanser (figur 2A1-3/C1-3). Täckglaset med de fasta och målade cellerna placeras med cellerna uppåt på en glasrutschbana (figur 2A4-C4). Geleringskammarens lock är inslaget med parafilm och är stängt bubbelfritt (Bild 2A5-C5).
Detta ExM-protokoll möjliggör expansion på upp till fyrfaldigt. För att bestämma expansionsfaktorn är det viktigt att bildceller före och efter expansionen (figur 3A + B). Otillräcklig förankring och homogenisering kan leda till förvrängningar och sprängningar av celler. Figur 4A + B visar representativa exempel på brustna celler i olika förstoringsbilder.
Denna metod kan användas för att undersöka samlokalisering av F-aktin- och aktinadapterproteiner, t.ex. podocin och nephrin (figur 5). Podocin avbildas i grönt medan aktin är märkt i blått (Figur 5). Nephrin är markerad i grönt. Vita områden indikerar samlokalisering.
Figur 1: Begrepp och tidpunkt för detta ExM-protokoll. (A) I kolumnen "protokoll" beskrivs varje steg i protokollet. (A + B) Efter sådd och transfecting celler utförs immunofluorescerande märkning (Immunolabeling). (A + B) Den lilla molekylen AcX (röd prick) binder till alla proteiner och förankrar dem till hydrogelen (förankring). (A + B) Via polymerisation binds alla proteiner inklusive fluorforer kovalently via AcX till hydrogelen (Polymerization). (A + B) Homogenisering leder till matsmältning av strukturella matrisproteiner. (A + B) Expansion uppnås genom dialys i vatten. (A) Avbildning och validering av bildbehandling slutför experimentet. (A) Hela protokollet kräver 7 dagar (kolumn "dag") med många inkubationssteg (total tid per dag kolumn "total tid"), men den faktiska bänktiden är mycket mindre som anges i respektive kolumn "bänktid". Ändrad från14. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Bygga gelationskammaren. Sidovy (A1) och övre vyn (B1 + C1) av en glasrutschbana med fyra #1,5 täckband. Genom att tillsätta en droppe vatten mellan glasrutschbanan och täcksprutans ränder kommer ränderna att fastna på glasrutschbanan(sidovy A2, övre vyn B2, C2). Droppar av vatten på #1,5 täckrännorna leder till vidhäftning av #1,0 täckband som läggs ovanpå #1,5 täckband(sidovy A3, övre vyn B3, C3). Provet på täckspjutet placeras i mitten av rektangeln med tång. Gelén är pipetted på toppen (sidovy A4, toppvy B4, C4). (A5) Sidovy och överst(B5 och C5)av den monterade gelationskammaren inklusive det slutna locket som är byggt av en täckslam insvept i parafilm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Celler före ochefter expansion. Rutan anger i vilket område de expanderade cellerna i figur 3B ligger. B)Celler efter expansion färgade för aktin i rött och podocin i grönt. Podocin samlokaliseringar med aktin i cellperiphery. Skalstång = 5 μm, expansionsfaktor = 2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Förvrängningar och sprängningar av celler. (A + B) Representativa mikroskopiska bilder av cos7-celler immunfärgade för aktin (röd). Cellerna var fasta, färgade, förankrade, smälta och expanderade. A)Cellbrister. Pilar indikerade brustna områden. Skalstång = 5 μm, expansionsfaktor = 4. B)Sprängningar och förvrängning av celler. Vita pilar indikerade brustna områden. Skalstång = 5 μm, expansionsfaktor = 4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Podocin samlokaliseringar med nephrin och aktin. Cos7 celler immunofluorescerande märkta för podocin, aktin och nephrin. (A) Cos7 celler färgade för podocin (grön), aktin (blå) och nephrin (röd) med ExM. Podocin samlokaliseringar med aktin och nephrin. Skalstång = 200 nm, expansionsfaktor = 4. B)Förstoring av det angivna området iA,skalstreck = 40 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Förankringsbuffert | slutlig koncentration | ||
| NaHCO3 (på NaHCO3) | 150 mM | ||
| Acryloyl-X, SE (AcX) | 0,1 mg/ml | ||
| Monomerlösning | Koncentration av stamlösning g/100 ml | mängd (ml) | slutlig koncentration (g/100 ml) |
| natrium akrylat | 38 | 2.25 | 8.6 |
| Akrylamid | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-Metylendiakrylamid | 2 | 0.75 | 0.15 |
| Natriumklorid | 29.2 | 4 | 11.7 |
| Pbs | 10x | 1 | 1x |
| Vatten | 0.75 | ||
| Totala | 9.4 | ||
| Gelling lösning | Koncentration av stamlösning | mängd (μl) | slutlig koncentration (mg/ml) |
| monomerlösning | Na | 190 | Na |
| Aps | 10% | 4 | 0.1 |
| TEMED (TEMED) | >99 % | 4 | 0.1 |
| Vatten | Na | 2 | Na |
| Totala | 200 | ||
| Matsmältningslösning | slutlig koncentration | ||
| Tris Cl, pH 8,0 | 1 M | ||
| EDTA pH 8,0 | 0,5 M | ||
| Triton X-100 | 0.005% | ||
| Guanidin HCL | 8 M | ||
| Vatten | |||
| proteinas K | 4 U/ml |
Tabell 1: Lösningar för ExM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade metoden gör det möjligt för prövaren att visualisera cellulära proteiner, t.ex. podocin, nephrin och cytoskeletala komponenter, t.ex. F-aktin. Inom detta protokoll används transfekterade cos7-celler som modell för att studera interaktion mellan slitsmembranproteiner och F-aktin. Tyvärr uttrycker odödliga podocyt cellinjer inte tillräckliga endogena mängder slitsmembranproteiner19.
Med denna metod kan cellulära proteiner visualiseras med nanoskalaupplösning med hjälp av ett konventionellt fluorescensmikroskop. De mest kritiska stegen inom protokollet är: 1) tillräcklig förankring av proteinamingrupper till hydrogelen med AcX, 2) adekvat polymerisation av hydrogelen, 3) optimal timing för matsmältning och 4) val av kompatibla fluorforer.
Förankring av cellulära proteiner till hydrogelen är avgörande för denna metod för att bevara proteinens position i hydrogelen under expansionen. AcX är en liten molekyl som binder till amingrupper av proteiner i celler och vävnader. AcX skapar ett kol-kol dubbelband med proteiner, vilket möjliggör införlivande av proteinerna i hydrogelen i polymerisationssteget20. AcX integrerar också antikroppar så att märkning med immunfluorescensantikroppar kan utföras före AcX-behandling. Otillräcklig förankring kan leda till sprickor och förvrängningar av celler. På grund av modifiering av amingrupper av fixativ måste man optimera fixeringen eller tiden för fixering. Dessutom kan otillräcklig lagring eller icke-optimerade förankringsförhållanden leda till sprickor och snedvridningar. Baserat på vår erfarenhet förlorar AcX sin optimala effekt när den används i mer än 3-4 månader.
Polymerisation av gelén är temperaturberoende. Vi rekommenderar därför att du håller polymerisationslösningarna på is innan du rör in den i gelationskammaren. Dessutom bör geleringssteget hållas kort (mindre än 5 min) för att undvika för tidig gelbildning. Noggrann blandning av polymerisationslösningen förhindrar ojämn polymerisation. Luftbubblor kommer att påverka expansionsprocessen vid beröring av provet och kan förhindras genom att tillsätta mer polymerisationslösning.
Efter införlivande av cellulära proteiner i hydrogelen behövs det mekaniska homogeniseringssteget (eller matsmältningen) för att säkerställa expansion. Olika metoder, t.ex. värme och tvättmedel eller enzymatisk matsmältning, finns och måste anpassas till det undersökta provet12,14,20. Inom detta protokoll används proteasen Proteinase K för enzymatisk matsmältning. Proteinas K appliceras vid en dos som är tillräcklig för att förstöra strukturella proteiner samtidigt som de flesta andra proteiner inklusive fluorescerande antikroppar12. Om matsmältningen är ofullständig är provexpansionen otillräcklig. Dessutom kan provet rivas under expansionsprocessen (figur 3). Om en otillräcklig provexpansion har skett rekommenderas vattenbyte. Alternativt kan tiden för den enzymatiska matsmältningen justeras eller en ny alikvot av Proteinase K öppnas.
Om provet är översmält kommer fluorescenssignalerna att minska. I detta fall bör matsmältningstiden minskas. I ExM i allmänhet minskas fluorescenssignalintensiteten per volymenhet på grund av provets volymetriska expansion14. Därför måste längre exponeringstider under avbildning övervägas.
Det är viktigt att välja ExM-kompatibla fluorforer. Cyaninfärgämnen bryts ned under polymerisationssteget13. Fluorescensproteiner baserade på bakteriofytochromer förstörs också i stor utsträckning13. De flesta GFP-liknande proteiner kommer dock att bevaras13. Dessutom kan streptavidin också appliceras före expansion, märkning efter translationella modifieringar som S-nitrolysation via en liten molekyl tag13.
Phalloidin, en liten märkningsmolekyl för att rikta in sig på aktincytoskeleton, är inte kompatibel med ExM21. För att övervinna otillräcklig förankring av falloidin har trivalent förankring (TRITON) införts21. Detta tillvägagångssätt erbjuder samtidig inriktning, märkning och ympning av biomolekyler21.
Denna metod kan modifieras för att färga RNA-molekyler (ExFish)22. Vid iterativ expansionsmikroskopi (iExM) eller X10-mikroskopi kan upplösningen på 60-70 nm förlängas till cirka 25 nm genom att applicera en andra svällbar gel i den första expanderade hydrogelen eller genomföra ett enda expansionssteg med en annan hydrogel15,16. Ultrastrukturexpansionsmikroskopi (U-ExM) möjliggör superupplösning av proteiner som bevarar deras tillskrivning till ett ultrastrukturellt element (t.ex. mitokondrier, mikrotubuler)23. En kombination av ExFish (RNA och DNA) och proExM-metoder har tidigare utförts samt22,24. Det presenterade protokollet använder transfected cos7 celler som en modell för att undersöka slits membran proteiner. Vi förväntar oss att andra bosatta odlade njurceller, t.ex. HEK293T-celler, kan användas på samma sätt för detta protokoll. Beroende på cellinjen kan justeringar behöva göras för de olika odlings- och transfectionförhållandena.
ExM förbättrar upplösningen av immunfärgade prover genom att ca 4-faldigt nå en lateral rumslig upplösning på 70 nm13. Jämfört med andra superupplösningstekniker utförs ExM på ett konventionellt fluorescensmikroskop13,14. Därför behövs ingen dyr utrustning eller särskilt utbildad personal för att genomföra ExM-metoden14. Även om inte alla fluorforer är kompatibla med ExM, finns det i allmänhet många tillgängliga antikroppar med optimerade fluoroforer med foto-fysiska egenskaper som behövs för superupplösningsmikroskopi14. Den största nackdelen med denna metod är att ExM är inkompatibelt med levandeprover 12,14.
I framtiden kan förbättring av hydrogelens kemiska sammansättning leda till ännu högre rumslig upplösning12. Kombinationen av olika protokoll kan också möjliggöra visualisering av proteiner, RNA, DNA eller lipider i komplex inom samma prov med sådan högupplöst12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Blanka Duvnjak och Nikola Kuhr för deras utmärkta tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al.
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
