Spatio-Temporal In Vivo Imaging av okulære legemiddelleveringssystemer ved hjelp av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi

Summary

Vi presenterer en protokoll for bruk av fiberoptisk konfokal lasermikroendoskopi (CLM) for ikke-invasivt å studere den romlige-temporale fordelingen av liposomer i øyet etter subkonjunktiv injeksjon.

Abstract

Subkonjunktival injeksjon er en attraktiv rute for å administrere okulære legemidler på grunn av enkel trans-scleral tilgang som omgår fremre okulære barrierer, som hornhinnen og konjunktivene. Mens terapeutiske effekter og farmakokinetikk av legemidler ved subkonjunktival injeksjon har blitt beskrevet i noen studier, svært få vurdere okulær distribusjon av narkotika eller narkotika levering systemer (DDS). Sistnevnte er kritisk for optimalisering av intraokulær DDS-design og legemiddelbiotilgjengelighet for å oppnå ønsket okulær lokalisering og virkningsvarighet (f.eks. akutt versus langvarig). Denne studien fastslår bruken av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi (CLM) for å kvalitativt studere okulær fordeling av fluorescerende liposomer i sanntid hos levende mus etter subkonjunktiv injeksjon. Å være designet for in vivo visuell inspeksjon av vev på mikroskopisk nivå, er dette også den første fullstendige beskrivelsen av CLM-avbildningsmetoden for å studere romlig-temporal fordeling av injeksjoner i øyet etter subkonjunktival injeksjon.

Introduction

Blodklarering, vevsfordeling og målbelegg for legemidler i levende systemer er pilarer for å forstå in vivo narkotika disposisjon. I prekliniske dyremodeller vurderes disse parametrene vanligvis ved hyppig blod- og vevsprøvetaking på bestemte tidspunkter etter legemiddeladministrasjon. Imidlertid er disse prosedyrene generelt invasive, inkluderer ofte ikke-overlevelsesmålinger, og nødvendiggjør store dyrekohorter for statistisk kraft. Det kan være ekstra kostnader og tid påløpt, sammen med etiske bekymringer for overdreven bruk av dyr. Som et resultat blir ikke-invasiv avbildning raskt et integrert skritt i biodistribusjonsstudier. Confocal lasermikroendoskopi (^CLM1,2) er velegnet for okulære applikasjoner for ikke-invasivt bilde den romlige-temporale fordelingen av terapeutiske stoffer i øynene til levende dyr med høy følsomhet og høy ^{oppløsning1,3,4}.

CLM har potensial til å legge til rette for robust screening av okulære legemiddelleveringssystemer (DDS), som liposomer, før omfattende kvantifisering av DDS og legemiddelbiotilgjengelighet. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i å justere sine fysisk-kjemiske og biofysiske egenskaper5,6,7,8,9,10,11 for å innkapsle et stort utvalg av terapeutisk last og kontrollere vevsstedet for legemiddelfrigjøring og virkningsvarighet. Liposomer har blitt brukt i okulære applikasjoner for levering av store molekyler, som det monoklonale antistoffet bevacizumab12, og små molekyler som ciklosporin13 og ganciclovir14. Legemiddelbelastede liposomer har lengre biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske effekter sammenlignet med ikke-liposomale “frie legemiddel” formuleringer. Imidlertid er narkotikafordeling i okulært vev vanligvis ekstrapolert fra legemiddelkonsentrasjoner i flytende komponenter i øyet (dvs. blod, vandig humor og glasslegemet humor15,16,17). Som den første in vivo skjebnen til den ladde narkotika lasten er definert av egenskapene til nanocarrier selv, CLM avbildning av fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet for å avsløre vev målretting og in situ vev oppholdstider. Videre kan visuelle bevis på levering med CLM styre DDS-re-design, evaluere terapeutiske fordeler ved stoffet, og kanskje til og med forutsi negative biologiske hendelser (f.eks. vevstoksisitet på grunn av uønsket lokalisering av DDS i lengre perioder).

Heri er en trinnvis prosedyre detaljert om hvordan du studerer okulær biodistribusjon av liposomer hos levende mus med et dual-band CLM-system. Dette spesifikke CLM-systemet kan oppdage tofarget fluorescens (med grønne og røde eksitasjonslasere på 488 nm og 660 nm) i sanntid, med en frekvens på 8 bilder/s. Ved å fysisk plassere deteksjonssonden på øyet, demonstrerer protokollen bildeanskaffelse og analyse av grønn-fluorescerende liposomer ved underleverandøradministrasjon hos mus pre-injisert intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) fargestoff. EB-fargestoff bidrar til å visualisere de vaskulære strukturene i den røde fluorescenskanalen. Vi viser representative resultater fra en studie som vurderer 100 nm nøytrale liposomer sammensatt av fosfolipid POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfocholine) og dopet med fluoresceinmerket fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-tiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glysero-3-fosfoetanolamin) med et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til å fange de grønne fluorescein-taggede liposomene ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral oppløsning ved avgrensning av EB-farget okulære vevsgrenser.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SingHealth (Singapore). Kvinnelige C57BL/6 J-mus (6-8 uker gamle; 18-20 g) ble hentet fra InVivos, Singapore, og ligger i en temperatur og lyskontrollert vivarium av Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr ble behandlet i henhold til retningslinjene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning. MERK: Et flytskjema som fre…

Representative Results

Protokollen demonstrerer nytten av CLM for å vurdere den romlige-temporale okulære fordelingen av grønne fluorescerende liposomer administrert gjennom subkonjunktival injeksjon. For å benytte seg av den doble fargekapasiteten (488 nm og 660 nm eksitasjonsbølgelengder) av CLM-systemet, ble 100 nm nøytrale POPC-liposomer som skulle injiseres dopet med 5% Fl-DHPE (komposisjons- og karakteriseringsdata vises i figur 1B), og EB ble injisert IV for å identifisere landemerker i øyet. Tilste…

Discussion

Som vist fra resultatene, gir CLM en enkel og gjennomførbar metode for å avbilde okulær fordeling av liposomer i øyet. Vi har tidligere demonstrert bruken av CLM for å karakterisere lokaliseringen av ulike liposomale formuleringer i museøyet over ^tid1. For ikke-invasive applikasjoner tillater CLM sanntidsavbildning av den fremre okulære overflaten for innsikt i hvordan liposomer fordeles i øyet fra samme dyr. Dette gjør CLM egnet for pre-screen nanocarrier /DDS før mer omfattende kvantif…

Materials

0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3