Imágenes espacio-temporales in vivo de sistemas oculares de administración de fármacos mediante microendoscopía láser confocal de fibra óptica
Summary
Presentamos un protocolo para el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar de forma no invasiva la distribución espacio-temporal de los liposomas en el ojo tras la inyección subconjuntival.
Abstract
La inyección subconjuntival es una vía atractiva para administrar fármacos oculares debido al fácil acceso transescleral que evita las barreras oculares anteriores, como la córnea y la conjuntiva. Si bien los efectos terapéuticos y la farmacocinética de los fármacos tras la inyección subconjuntival se han descrito en algunos estudios, muy pocos evalúan la distribución ocular de los fármacos o los sistemas de administración de fármacos (DDS). Este último es crítico para la optimización del diseño de DDS intraocular y la biodisponibilidad del fármaco para lograr la localización ocular deseada y la duración de la acción (por ejemplo, aguda versus prolongada). Este estudio establece el uso de la microendoscopía láser confocal de fibra óptica (LMC) para estudiar cualitativamente la distribución ocular de liposomas fluorescentes en tiempo real en ratones vivos después de la inyección subconjuntival. Al estar diseñado para la inspección visual in vivo de tejidos a nivel microscópico, esta es también la primera descripción completa del método de imágenes CLM para estudiar la distribución espacio-temporal de inyectables en el ojo después de la inyección subconjuntival.
Introduction
El aclaramiento sanguíneo, la distribución tisular y la ocupación objetivo de los medicamentos en los sistemas vivos son pilares para comprender la disposición in vivo de los medicamentos. En modelos animales preclínicos, estos parámetros generalmente se evalúan mediante muestreos frecuentes de sangre y tejidos en puntos de tiempo particulares después de la administración del medicamento. Sin embargo, estos procedimientos son generalmente invasivos, a menudo incluyen mediciones de no supervivencia y requieren grandes cohortes de animales para la potencia estadística. Puede haber costos y tiempo adicionales incurridos, junto con preocupaciones éticas por el uso excesivo de animales. Como resultado, las imágenes no invasivas se están convirtiendo rápidamente en un paso integral en los estudios de biodistribuciones. La microendoscopía láser confocal (CLM1,2) es adecuada para aplicaciones oculares para obtener imágenes no invasivas de la distribución espacio-temporal de la terapéutica en los ojos de animales vivos con alta sensibilidad y alta resolución1,3,4.
CLM tiene el potencial de facilitar la detección robusta de los sistemas oculares de administración de fármacos (DDS), como los liposomas, antes de la cuantificación integral del DDS y la biodisponibilidad del fármaco. Los liposomas son atractivos por su flexibilidad para ajustar sus propiedades fisicoquímicas y biofísicas5,6,7,8,9,10,11 para encapsular una gran variedad de carga terapéutica y controlar el sitio tisular de liberación del fármaco y la duración de la acción. Los liposomas se han utilizado en aplicaciones oculares para la entrega de moléculas grandes, como el anticuerpo monoclonal bevacizumab12, y moléculas pequeñas como ciclosporina13 y ganciclovir14. Los liposomas cargados de fármacos tienen vidas medias biológicas más largas y efectos terapéuticos prolongados en comparación con las formulaciones de “fármacos libres” no liposomales. Sin embargo, la distribución de fármacos en el tejido ocular se extrapola típicamente a partir de las concentraciones de fármacos en los componentes fluidos del ojo (es decir, sangre, humor acuoso y humor vítreo15,16,17). Como el destino inicial in vivo de la carga de medicamentos cargada se define por las propiedades del propio nanoportador, las imágenes CLM de los liposomas fluorescentes pueden servir como sustitutos para que el medicamento revele la orientación del tejido y los tiempos de residencia del tejido in situ. Además, la evidencia visual de la administración con CLM puede dirigir el rediseño de DDS, evaluar los beneficios terapéuticos del fármaco y tal vez incluso predecir eventos biológicos adversos (por ejemplo, toxicidad tisular debido a la localización indeseable de DDS durante períodos prolongados de tiempo).
Aquí, se detalla un procedimiento paso a paso sobre cómo estudiar la biodistribución ocular de liposomas en ratones vivos con un sistema CLM de doble banda. Este sistema CLM específico puede detectar fluorescencia bicolor (con láseres de excitación verde y rojo a 488 nm y 660 nm) en tiempo real, con una frecuencia de 8 fotogramas/s. Al colocar físicamente la sonda de detección en el ojo, el protocolo demuestra la adquisición de imágenes y el análisis de liposomas verde-fluorescentes tras la administración subconjuntival en ratones preinyectados por vía intravenosa (IV) con colorante Azul evans (EB) al 2%. El tinte EB ayuda a visualizar las estructuras vascularizadas en el canal de fluorescencia roja. Mostramos resultados representativos de un estudio que evaluó liposomas neutros de 100 nm compuestos por el fosfolípido POPC (es decir, 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) y dopados con fosfolípido fl-DHPE marcado con fluoresceína (es decir, N-(fluoresceína-5-tiocarbamoil)-1,2-dihexa-decanoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina) en una proporción de 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figura 1B ). CLM es capaz de capturar los liposomas marcados con fluoresceína verde a una resolución axial de 15 μm y lateral de 3,30 μm mediante la delineación de los límites del tejido ocular teñido con EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se muestra en los resultados, CLM proporciona un método simple y factible para obtener imágenes de la distribución ocular de los liposomas en el ojo. Anteriormente demostramos el uso de CLM para caracterizar la localización de diversas formulaciones liposomales dentro del ojo de ratón a lo largo del tiempo1. Para aplicaciones no invasivas, CLM permite obtener imágenes en tiempo real de la superficie ocular anterior para obtener información sobre cómo se distribuyen los liposomas en el…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la subvención del NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) otorgada (a SV) y en parte por la subvención AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 de Singapur y la subvención H18/01/018 del Fondo de Alineación de la Industria de Ciencias Biomédicas y de la Salud (HBMS) de Singapur (IAF-PP) H18/01/a0/018 administrada por la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación (A*STAR) (a AMC). Gracias a los miembros del Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) por facilitar la logística y ejecución de los estudios y la formación sobre equipos. Un agradecimiento especial a la Sra. Wisna Novera por su asistencia editorial.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
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