광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징
Summary
우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
수축기 주사는 각막및 결막과 같은 전방 안구 장벽을 우회하는 쉬운 트랜스 경피성 접근으로 인해 안구 약물을 투여하는 매력적인 경로입니다. 구축 주사 시 약물의 치료 효과 및 약동학은 일부 연구에서 설명되었지만 약물 또는 약물 전달 시스템 (DDS)의 안구 분포를 평가하는 것은 거의 없습니다. 후자는 원하는 안구 국소화 및 작용 기간(예: 급성 대 장시간)을 달성하기 위해 내구 DDS 설계 및 약물 생체 이용률의 최적화에 매우 중요합니다. 이 연구는 섬유섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)를 사용하여 항결체 주입 후 살아있는 마우스에서 실시간으로 형광 리포좀의 안구 분포를 질적으로 연구합니다. 현미경 수준에서 조직의 생체 내육검사를 위해 설계되고, 이것은 또한 수축 주사 후 눈에 주사의 주체의 현수체 분포를 연구하는 CLM 이미징 방법의 첫 번째 전체 설명이다.
Introduction
혈액 정리, 조직 분포 및 살아있는 시스템에서 약물의 표적 점유율은 생체 내 약물 처분에 대한 이해를 위한 기둥입니다. 전임상 동물 모델에서, 이러한 매개 변수는 전형적으로 약물 투여 후 특정 시점에서 빈번한 혈액 및 조직 샘플링에 의해 평가된다. 그러나, 이 절차는 일반적으로 침략적입니다, 수시로 비 생존 측정을 포함하고, 통계적인 전원을 위한 큰 동물 집단을 필요로 합니다. 동물의 과도한 사용에 대한 윤리적 우려와 함께 추가 비용과 시간이 발생할 수 있습니다. 그 결과, 비침습적 이미징은 빠르게 바이오 유통 연구에서 필수적인 단계가 되고 있습니다. 공초점 레이저 미세 내시경검사(CLM1,2)는 높은 감도와 고해상도를 가진 살아있는 동물의 눈에 치료제의 스파티오-측두형 분포를 비침습적으로 이미지화하기 위해 안구 응용 분야에 적합합니다1,3,4.
CLM은 DDS 및 약물 생체 이용률의 포괄적 인 정량화 전에 리포솜과 같은 안구 약물 전달 시스템 (DDS)의 강력한 선별을 촉진 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 리포솜은 물리화학적 및 생물학적 특성5,6,7,8,9,10,11을 조정하여 다양한 치료화물을 캡슐화하고 약물 방출 및 작용 기간의 조직 부위를 제어하는 유연성에 매력적입니다. 리포솜은 단일클론 항체 bevacizumab12와 같은 대형 분자의 전달을 위한 안구 응용 분야에서 사용되어 왔으며, 사이클로스포린13 및 간시클로비르14와 같은 작은 분자가 사용되어 왔다. 약물로 적재된 리포솜은 비리포소말 “무료 약물” 제형에 비해 생물학적 반감기와 장기간치료 효과가 있습니다. 그러나, 안구 조직의 약물 분포는 전형적으로 눈의 유체 성분에 있는 약물 농도에서 추정됩니다 (즉, 혈액, 수성 유머 및 유리체 humor15,16,17). 적재된 약물 화물의 초기 생체 내 운명은 나노캐리어 자체의 특성에 의해 정의되기 때문에, 형광 리포솜의 CLM 이미징은 조직 표적화 및 시투 조직 거주 시간에 대한 약물의 대리역할을 할 수 있다. 더욱이, CLM을 가진 납품의 시각적 증거는 DDS 재설계를 조종하고, 약의 치료 이득을 평가하고, 아마 불리한 생물학 사건을 예측할 수 있습니다 (예를 들어, 시간의 연장된 기간 동안 DDS의 바람직하지 않은 현지화로 인한 조직 독성).
본원에서, 단계별 절차는 이중 대역 CLM 시스템을 가진 살아있는 마우스에서 리포솜의 안구 생체 분포를 연구하는 방법에 대해 상세하게 설명된다. 이 특정 CLM 시스템은 8 프레임 / s의 주파수와 함께 실시간으로 2 색 형광 (488 nm 및 660 nm에서 녹색 및 빨간색 여기 레이저 포함)을 감지 할 수 있습니다. 검출 프로브를 눈에 물리적으로 배치함으로써, 프로토콜은 2%의 에반스 블루(EB) 염료를 가진 마우스에 있는 정맥 내(IV)에서 하반수 투여 시 녹색 형광 리포좀의 이미지 수집 및 분석을 보여줍니다. EB 염료는 적색 형광 채널에서 혈관 구조를 시각화하는 데 도움이됩니다. 우리는 인지질 POPC (즉, 1-팔미토일-2-올레오일-글리페로-3-인포콜린)로 구성된 100 nm 중성 리포솜을 평가하는 연구에서 대표적인 결과를 보여주고 형광에 태그된 인지질 Fl-DHPE (즉, 1.e., doped)를 보여줍니다. N-(플루오레세인-5-티오카바모일)-1,2-디헥사-데카노일센-글리케로-3-인포에탄놀라민) 95% POPC의 비율: 5% Fl-DHPE (그림 1B ). CLM은 EB 염색 안구 조직 경계의 묘사에 의해 15 μm 축 및 3.30 μm 측삭 분해능에서 녹색 형광 태그 리포솜을 캡처할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
결과에서 볼 수 있듯이 CLM은 눈에서 리포솜의 안구 분포를 이미지화하는 간단하고 실행 가능한 방법을 제공합니다. 앞서 CLM의 사용을 통해 시간이 지남에 따라 마우스 눈 내의 다양한 리포소말 제형의 국소화를 특징으로 하는 것을 입증하였다1. 비침습적 응용 프로그램의 경우 CLM은 리포솜이 동일한 동물의 눈에 어떻게 분포되는지에 대한 통찰력을 위해 전방 안구 표면의 실시?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NTU-노스웨스턴 나노의학 연구소(NNIN)가 (SV에) 수여하고 싱가포르 국립 연구 재단 보조금 AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2및 싱가포르의 보건 생물 의학 과학(HBMS) 산업 정렬 사전 포집(IAF-PP) 보조금 H18/01/01/01에 의해 지원되었습니다. 기술 및 연구(A*STAR) (AMC). 듀크-NUS 번역 및 분자 이미징 연구소(LTMI)의 회원덕분에 장비에 대한 연구 및 교육의 물류 및 실행을 용이하게 합니다. 그녀의 편집 지원에 대한 위스타 노파 양에게 특별한 감사.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
Riferimenti
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