التصوير المكاني الصدغي في الجسم الحي لأنظمة توصيل الأدوية العينية باستخدام المجهر الليزري البؤري الليفي البصري
Summary
نقدم بروتوكولا لاستخدام المجهري بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة التوزيع المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية في العين بشكل غير جراحي بعد الحقن تحت الملتحمة.
Abstract
الحقن تحت الملتحمة هو طريق جذاب لإدارة أدوية العين بسبب سهولة الوصول عبر الصلبة التي تتجاوز حواجز العين الأمامية ، مثل القرنية والملتحمة. في حين تم وصف الآثار العلاجية والحركية الدوائية للأدوية عند الحقن تحت الملتحمة في بعض الدراسات ، فإن عددا قليلا جدا منها يقيم التوزيع العيني للأدوية أو أنظمة توصيل الدواء (DDS). هذا الأخير أمر بالغ الأهمية لتحسين تصميم DDS داخل العين والتوافر البيولوجي للأدوية لتحقيق التوطين العيني المطلوب ومدة العمل (على سبيل المثال ، الحادة مقابل الطويلة). تثبت هذه الدراسة استخدام المجهر بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة نوعية للتوزيع العيني للجسيمات الشحمية الفلورية في الوقت الفعلي في الفئران الحية بعد الحقن تحت الملتحمة. كونها مصممة للفحص البصري في الجسم الحي للأنسجة على المستوى المجهري ، وهذا هو أيضا أول وصف كامل لطريقة التصوير CLM لدراسة التوزيع المكاني والزماني للحقن في العين بعد الحقن تحت الملتحمة.
Introduction
إن إزالة الدم وتوزيع الأنسجة والإشغال المستهدف للعقاقير في الأنظمة الحية هي ركائز لفهم التصرف في الأدوية في الجسم الحي. في النماذج الحيوانية قبل السريرية ، يتم تقييم هذه المعلمات عادة عن طريق أخذ عينات الدم والأنسجة بشكل متكرر في نقاط زمنية معينة بعد إعطاء الدواء. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات غازية بشكل عام ، وغالبا ما تتضمن قياسات عدم البقاء على قيد الحياة ، وتتطلب مجموعات كبيرة من الحيوانات للتشغيل الإحصائي. قد تكون هناك تكلفة إضافية ووقت متكبد ، إلى جانب المخاوف الأخلاقية للاستخدام المفرط للحيوانات. ونتيجة لذلك ، أصبح التصوير غير الجراحي بسرعة خطوة أساسية في دراسات التوزيعات الحيوية. يعد التنظير المجهري بالليزر البؤري (CLM1,2) مناسبا تماما للتطبيقات العينية لتصوير التوزيع المكاني والزماني للعلاجات بشكل غير جراحي في عيون الحيوانات الحية ذات الحساسية العالية والدقة العالية1,3,4.
لدى CLM القدرة على تسهيل الفحص القوي لأنظمة توصيل الأدوية العينية (DDS) ، مثل الجسيمات الشحمية ، قبل التحديد الكمي الشامل ل DDS والتوافر البيولوجي للأدوية. الجسيمات الشحمية جذابة لمرونتها في ضبط خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية5،6،7،8،9،10،11 لتغليف مجموعة كبيرة ومتنوعة من البضائع العلاجية والتحكم في موقع الأنسجة لإطلاق الدواء ومدة العمل. تم استخدام الجسيمات الشحمية في تطبيقات العين لتوصيل جزيئات كبيرة ، مثل الجسم المضاد أحادي النسيلة bevacizumab12 ، والجزيئات الصغيرة مثل السيكلوسبورين13 و ganciclovir14. الجسيمات الشحمية المحملة بالأدوية لها عمر نصف بيولوجي أطول وتأثيرات علاجية طويلة الأمد مقارنة بتركيبات “الدواء الحر” غير الشحمية. ومع ذلك ، عادة ما يتم استقراء توزيع الدواء في أنسجة العين من تركيزات المخدرات في المكونات السائلة للعين (أي الدم ، والفكاهة المائية ، والفكاهة الزجاجية 15،16،17). نظرا لأن المصير الأولي في الجسم الحي لشحنة الدواء المحملة يتم تحديده من خلال خصائص الناقل النانوي نفسه ، فإن تصوير CLM للجسيمات الشحمية الفلورية يمكن أن يكون بمثابة بديل للدواء للكشف عن استهداف الأنسجة وأوقات إقامة الأنسجة في الموقع. علاوة على ذلك ، يمكن للأدلة المرئية على التسليم باستخدام CLM توجيه إعادة تصميم DDS ، وتقييم الفوائد العلاجية للدواء ، وربما حتى التنبؤ بالأحداث البيولوجية الضارة (على سبيل المثال ، سمية الأنسجة بسبب التوطين غير المرغوب فيه ل DDS لفترات طويلة من الزمن).
هنا ، يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة حول كيفية دراسة التوزيع الحيوي للجسيمات الشحمية في العين في الفئران الحية باستخدام نظام CLM ثنائي النطاق. يمكن لنظام CLM المحدد هذا اكتشاف التألق بلونين (مع ليزر الإثارة الأخضر والأحمر عند 488 نانومتر و 660 نانومتر) في الوقت الفعلي ، بتردد 8 إطارات / ثانية. من خلال وضع مسبار الكشف جسديا على العين ، يوضح البروتوكول الحصول على صورة وتحليل الجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء عند تناولها تحت الملتحمة في الفئران التي تم حقنها مسبقا عن طريق الوريد (IV) مع صبغة إيفانز بلو (EB) بنسبة 2٪. تساعد صبغة EB على تصور الهياكل الوعائية في قناة التألق الحمراء. نعرض نتائج تمثيلية من دراسة تقيم الجسيمات الشحمية المحايدة 100 نانومتر المكونة من الفوسفوليبيد POPC (أي 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين) والمنشطات مع الفوسفوليبيد Fl-DHPE الموسوم بالفلوريسين (أي N-(فلوريسين-5-ثيوكاربامويل) -1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine) بنسبة 95٪ POPC: 5٪ Fl-DHPE (الشكل 1B ). CLM قادر على التقاط الجسيمات الشحمية الخضراء الموسومة بالفلوريسين عند 15 ميكرومتر محوري و 3.30 ميكرومتر جانبي عن طريق ترسيم حدود أنسجة العين الملطخة ب EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو موضح من النتائج ، يوفر CLM طريقة بسيطة ومجدية لتصوير التوزيع العيني للجسيمات الشحمية في العين. لقد أظهرنا سابقا استخدام CLM لتوصيف توطين التركيبات الشحمية المختلفة داخل عين الفأر بمرور الوقت1. بالنسبة للتطبيقات غير الغازية ، يسمح CLM بالتصوير في الوقت الفعلي لسطح العين الأ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل منحة NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) الممنوحة (إلى SV) وجزئيا من قبل منحة مؤسسة سنغافورة الوطنية للبحوث AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 ومنحة صندوق محاذاة الصناعة للصحة والعلوم الطبية الحيوية (HBMS) في سنغافورة H18/01/a0/018 التي تديرها وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (إلى AMC). شكرا لأعضاء من مختبر Duke-NUS للتصوير الانتقالي والجزيئي (LTMI) لتسهيل الخدمات اللوجستية وتنفيذ الدراسات والتدريب على المعدات. شكر خاص للسيدة ويسنا نوفيرا على مساعدتها التحريرية.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
Riferimenti
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
