Summary

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Published: September 27, 2021
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Summary

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Abstract

Die subkonjunktivale Injektion ist ein attraktiver Weg zur Verabreichung von Augenmedikamenten aufgrund des einfachen transskleralen Zugangs, der anteriore Augenbarrieren wie Hornhaut und Bindehaut umgeht. Während therapeutische Wirkungen und Pharmakokinetik der Arzneimittel bei subkonjunktivaler Injektion in einigen Studien beschrieben wurden, beurteilen nur sehr wenige die Augenverteilung von Arzneimitteln oder Drug Delivery Systems (DDS). Letzteres ist entscheidend für die Optimierung des intraokularen DDS-Designs und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels, um die gewünschte Okularlokalisation und Wirkungsdauer (z. B. akut versus verlängert) zu erreichen. Diese Studie etabliert die Verwendung der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) zur qualitativen Untersuchung der Augenverteilung von fluoreszierenden Liposomen in Echtzeit in lebenden Mäusen nach subkonjunktivaler Injektion. Konzipiert für die visuelle In-vivo-Inspektion von Geweben auf mikroskopischer Ebene, ist dies auch die erste vollständige Beschreibung der CLM-Bildgebungsmethode zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Verteilung von Injektionsmitteln im Auge nach subkonjunktivaler Injektion.

Introduction

Die Blutclearance, die Gewebeverteilung und die Zielbelegung von Medikamenten in lebenden Systemen sind Säulen für das Verständnis der In-vivo-Wirkstoffdisposition. In präklinischen Tiermodellen werden diese Parameter typischerweise durch häufige Blut- und Gewebeentnahmen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verabreichung des Arzneimittels beurteilt. Diese Verfahren sind jedoch im Allgemeinen invasiv, beinhalten oft Nicht-Überlebensmessungen und erfordern große Tierkohorten für die statistische Auswertung. Es können zusätzliche Kosten und Zeit anfallen, zusammen mit ethischen Bedenken für übermäßigen Gebrauch von Tieren. Infolgedessen wird die nicht-invasive Bildgebung schnell zu einem integralen Schritt in Bioverteilungsstudien. Die konfokale Lasermikroendoskopie (CLM1,2) eignet sich gut für okuläre Anwendungen, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Therapeutika in den Augen lebender Tiere mit hoher Empfindlichkeit und hoher Auflösung nicht-invasiv abzubilden1,3,4.

CLM hat das Potenzial, ein robustes Screening von okulären Drug Delivery Systemen (DDS) wie Liposomen vor einer umfassenden Quantifizierung des DDS und der Bioverfügbarkeit des Arzneimittels zu erleichtern. Liposomen sind attraktiv für ihre Flexibilität bei der Abstimmung ihrer physikalisch-chemischen und biophysikalischen Eigenschaften5,6,7,8,9,10,11, um eine Vielzahl von therapeutischen Ladungen zu verkapseln und die Gewebestelle der Wirkstofffreisetzung und die Wirkungsdauer zu kontrollieren. Liposomen wurden in okulären Anwendungen zur Abgabe großer Moleküle wie dem monoklonalen Antikörper Bevacizumab12 und kleinen Molekülen wie Cyclosporin13 und Ganciclovir14 eingesetzt. Arzneimittelbeladene Liposomen haben längere biologische Halbwertszeiten und verlängerte therapeutische Wirkungen im Vergleich zu nicht-liposomalen “freien Arzneimittel” -Formulierungen. Die Arzneimittelverteilung im Augengewebe wird jedoch typischerweise aus arzneimittelkonzentrationen in flüssigen Komponenten des Auges (d. H. Blut, Kammerwasser und Glaskörper) extrapoliert15,16,17). Da das anfängliche In-vivo-Schicksal der beladenen Wirkstoffladung durch die Eigenschaften des Nanocarriers selbst definiert wird, kann die CLM-Bildgebung der fluoreszierenden Liposomen als Surrogat für das Medikament dienen, um Gewebe-Targeting und In-situ-Gewebeverweilzeiten aufzudecken. Darüber hinaus kann der visuelle Nachweis der Verabreichung mit CLM das DDS-Redesign steuern, den therapeutischen Nutzen des Arzneimittels bewerten und möglicherweise sogar unerwünschte biologische Ereignisse vorhersagen (z. B. Gewebetoxizität aufgrund unerwünschter Lokalisation von DDS über einen längeren Zeitraum).

Hierin wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben, wie die okuläre Bioverteilung von Liposomen in lebenden Mäusen mit einem Dual-Band-CLM-System untersucht werden kann. Dieses spezielle CLM-System kann zweifarbige Fluoreszenz (mit grünen und roten Anregungslasern bei 488 nm und 660 nm) in Echtzeit mit einer Frequenz von 8 Bildern/s erkennen. Durch die physische Platzierung der Nachweissonde auf dem Auge demonstriert das Protokoll die Bilderfassung und Analyse von grün fluoreszierenden Liposomen bei subkonjunktivaler Verabreichung in Mäusen, die intravenös (IV) mit 2% Evans Blue (EB) Farbstoff vorinjiziert wurden. EB-Farbstoff hilft, die vaskularisierten Strukturen im roten Fluoreszenzkanal sichtbar zu machen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse aus einer Studie, in der 100 nm neutrale Liposomen untersucht wurden, die aus dem Phospholipid POPC (d.h. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin) bestehen und mit Fluorescein-markiertem Phospholipid Fl-DHPE (d.h. N-(Fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamin dotiert sind) im Verhältnis von 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Abbildung 1B ). CLM ist in der Lage, die grünen Fluorescein-markierten Liposomen mit 15 μm axialer und 3,30 μm lateraler Auflösung durch Abgrenzung von EB-gefärbten Augengewebegrenzen zu erfassen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bei SingHealth (Singapur) genehmigt. Weibliche C57BL/6 J-Mäuse (6-8 Wochen alt; 18-20 g) wurden aus InVivos, Singapur, gewonnen und in einem temperatur- und lichtkontrollierten Vivarium der Duke-NUS Medical School, Singapur, untergebracht. Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung behandelt….

Representative Results

Das Protokoll zeigt den Nutzen von CLM zur Beurteilung der räumlich-zeitlichen Augenverteilung von grün fluoreszierenden Liposomen, die durch subkonjunktivale Injektion verabreicht werden. Um die zweifarbige Fähigkeit (488 nm und 660 nm Anregungswellenlängen) des CLM-Systems zu nutzen, wurden 100 nm neutrale POPC-Liposomen, die injiziert werden sollten, mit 5% Fl-DHPE dotiert (Zusammensetzungs- und Charakterisierungsdaten sind in Abbildung 1B dargestellt), und EB wurde IV injiziert, um L…

Discussion

Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, bietet CLM eine einfache und praktikable Methode, um die Augenverteilung von Liposomen im Auge abzubilden. Wir haben zuvor die Verwendung von CLM demonstriert, um die Lokalisation verschiedener liposomaler Formulierungen im Mausauge im Laufe der Zeit zu charakterisieren1. Für nicht-invasive Anwendungen ermöglicht CLM die Echtzeit-Bildgebung der vorderen Augenoberfläche, um Erkenntnisse darüber zu erhalten, wie Liposomen vom selben Tier im Auge verteilt sind….

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch den Zuschuss des NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) (an SV) und zum Teil durch den Grant der Singapore National Research Foundation AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 und den Singapore Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) Grant H18/01/a0/018 finanziert, der von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A * STAR) (an AMC) verwaltet wird. Vielen Dank an die Mitglieder des Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) für die Erleichterung der Logistik und Durchführung der Studien und Schulungen an Geräten. Besonderer Dank geht an Frau Wisna Novera für ihre redaktionelle Unterstützung.

Materials

0.08 µm polycarbonate filter Whatman, USA 110604
0.22 µm syringe filter Fisherbrand, Ireland 09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe Hamilton, USA 65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti, USA 850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) Hamilton, USA 7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) WPI, USA ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) Mauna Kea Technologies, France Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform Sigma Aldrich, USA 472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar WPI, USA 500233 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue Sigma Aldrich, USA E2129
Fusidic acid eye drop LEO Pharma, Denmark
ImageJ National Institutes of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical, UK
Methanol Sigma Aldrich, USA 179337
Mini Extruder Avanti, USA 610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) Invitrogen, USA F362
Phosphate Buffered Saline Gibco, USA 10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand Olympus, Tokyo, Japan SZ51 & SZ2-STU3

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Citazione di questo articolo
Chaw, S. Y., Wong, T. T. L., Venkatraman, S., Chacko, A. Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy. J. Vis. Exp. (175), e62685, doi:10.3791/62685 (2021).

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