Imagerie spatio-temporelle in vivo de systèmes d’administration de médicaments oculaires à l’aide d’une microendoscopie laser confocale à fibre optique
Summary
Nous présentons un protocole pour l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des liposomes dans l’œil après injection sous-conjonctivale.
Abstract
L’injection sous-conjonctivale est une voie attrayante pour administrer des médicaments oculaires en raison de l’accès transscléral facile qui contourne les barrières oculaires antérieures, telles que la cornée et la conjonctive. Bien que les effets thérapeutiques et la pharmacocinétique des médicaments lors de l’injection sous-conjonctivale aient été décrits dans certaines études, très peu évaluent la distribution oculaire des médicaments ou des systèmes d’administration de médicaments (DDS). Ce dernier est essentiel pour l’optimisation de la conception du DDS intraoculaire et de la biodisponibilité du médicament afin d’obtenir la localisation oculaire souhaitée et la durée d’action (par exemple, aiguë ou prolongée). Cette étude établit l’utilisation de la microendoscopie laser confocale à fibre optique (CLM) pour étudier qualitativement la distribution oculaire des liposomes fluorescents en temps réel chez des souris vivantes après injection sous-conjonctivale. Conçu pour l’inspection visuelle in vivo des tissus au niveau microscopique, il s’agit également de la première description complète de la méthode d’imagerie CLM pour étudier la distribution spatio-temporelle des injectables dans l’œil après injection sous-conjonctivale.
Introduction
La clairance sanguine, la distribution tissulaire et l’occupation cible des médicaments dans les systèmes vivants sont des piliers pour comprendre la disposition in vivo des médicaments. Dans les modèles animaux précliniques, ces paramètres sont généralement évalués par des prélèvements sanguins et tissulaires fréquents à des moments particuliers après l’administration du médicament. Cependant, ces procédures sont généralement invasives, incluent souvent des mesures de non-survie et nécessitent de grandes cohortes d’animaux pour l’alimentation statistique. Il peut y avoir des coûts et du temps supplémentaires, ainsi que des préoccupations éthiques pour l’utilisation excessive d’animaux. En conséquence, l’imagerie non invasive devient rapidement une étape essentielle dans les études sur les biodistributions. La microendoscopie laser confocale (CLM1,2) est bien adaptée aux applications oculaires pour imager de manière non invasive la distribution spatio-temporelle des produits thérapeutiques dans les yeux d’animaux vivants avec une sensibilité et une résolution élevées1,3,4.
Le CLM a le potentiel de faciliter le dépistage robuste des systèmes d’administration de médicaments oculaires (DDS), tels que les liposomes, avant la quantification complète du DDS et la biodisponibilité des médicaments. Les liposomes sont attrayants pour leur flexibilité dans le réglage de leurs propriétés physico-chimiques et biophysiques5,6,7,8,9,10,11 pour encapsuler une grande variété de cargaisons thérapeutiques et contrôler le site tissulaire de libération du médicament et la durée d’action. Les liposomes ont été utilisés dans des applications oculaires pour l’administration de grosses molécules, telles que l’anticorps monoclonal bevacizumab12, et de petites molécules comme la cyclosporine13 et le ganciclovir14. Les liposomes chargés de médicaments ont des demi-vies biologiques plus longues et des effets thérapeutiques prolongés par rapport aux formulations non liposomiques de « médicaments libres ». Cependant, la distribution des médicaments dans le tissu oculaire est généralement extrapolée à partir des concentrations de médicaments dans les composants fluides de l’œil (c.-à-d. le sang, l’humeur aqueuse et l’humeur vitrée15,16,17). Comme le devenir initial in vivo de la cargaison de médicament chargée est défini par les propriétés du nanotransporteur lui-même, l’imagerie CLM des liposomes fluorescents peut servir de substitut au médicament pour révéler le ciblage tissulaire et les temps de résidence tissulaire in situ. En outre, les preuves visuelles de l’administration avec CLM peuvent orienter la refonte du DDS, évaluer les avantages thérapeutiques du médicament et peut-être même prédire les événements biologiques indésirables (par exemple, la toxicité tissulaire due à la localisation indésirable du DDS pendant de longues périodes).
Ici, une procédure étape par étape est détaillée sur la façon d’étudier la biodistribution oculaire des liposomes chez les souris vivantes avec un système CLM à double bande. Ce système CLM spécifique peut détecter la fluorescence bicolore (avec des lasers d’excitation vert et rouge à 488 nm et 660 nm) en temps réel, avec une fréquence de 8 images / s. En plaçant physiquement la sonde de détection sur l’œil, le protocole démontre l’acquisition d’images et l’analyse de liposomes fluorescents verts lors de l’administration sous-conjonctivale chez des souris pré-injectées par voie intraveineuse (IV) avec un colorant Evans Blue (EB) à 2%. Le colorant EB aide à visualiser les structures vascularisées dans le canal de fluorescence rouge. Nous montrons les résultats représentatifs d’une étude évaluant des liposomes neutres de 100 nm composés du phospholipide POPC (c.-à-d. 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycero-3-phosphocholine) et dopés avec du phospholipide Fl-DHPE marqué à la fluorescéine (c.-à-d. N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoéthanolamine) à un rapport de 95 % POPC : 5 % Fl-DHPE (Figure 1B ). Le CLM est capable de capturer les liposomes verts marqués à la fluorescéine à une résolution axiale de 15 μm et latérale de 3,30 μm par délimitation des limites des tissus oculaires colorés par EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme le montrent les résultats, CLM fournit une méthode simple et réalisable pour imager la distribution oculaire des liposomes dans l’œil. Nous avons déjà démontré l’utilisation du CLM pour caractériser la localisation de diverses formulations liposomales dans l’œil de la souris au fil du temps1. Pour les applications non invasives, le CLM permet une imagerie en temps réel de la surface oculaire antérieure pour mieux comprendre comment les liposomes sont distribués dans l’œ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par la subvention NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) accordée (à SV) et en partie par la subvention AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 et la subvention H18/01/01/01/01/01/018 de l’Agence pour la science, la technologie et la recherche (A*STAR) de Singapour (A*STAR) (à AMC). Merci aux membres du Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) d’avoir facilité la logistique et l’exécution des études et de la formation sur les équipements. Un merci spécial à Mme Wisna Novera pour son aide éditoriale.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
Riferimenti
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
