Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.
Abstract
הזרקה תת-ימית היא דרך אטרקטיבית למתן תרופות עיניות בשל גישה טרנס-סקלרלית קלה העוקפת מחסומי עיניים קדמיים, כגון הקרנית והלחמית. בעוד השפעות טיפוליות ופרמקוקינטיקה של התרופות על הזרקה תת-כיוונית תוארו במחקרים מסוימים, מעטים מאוד להעריך את ההפצה העין של תרופות או מערכות אספקת תרופות (DDS). זה האחרון הוא קריטי עבור אופטימיזציה של עיצוב DDS תוך עיני וזמינות ביולוגית סמים כדי להשיג את לוקליזציה העין הרצוי ומשך הפעולה (למשל, חריף לעומת ממושך). מחקר זה קובע את השימוש במיקרואנדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן איכותי את התפלגות העין של ליפוזומים פלואורסצנטיים בזמן אמת בעכברים חיים לאחר הזרקת תת-הלחמית. להיות מתוכנן לבדיקה חזותית ויוו של רקמות ברמה המיקרוסקופית, זהו גם התיאור המלא הראשון של שיטת ההדמיה CLM לחקור התפלגות מרחבית-זמנית של הזרקה בעין לאחר הזרקה תת-כיוונית.
Introduction
סיווג הדם, חלוקת הרקמות ותפוסת היעד של תרופות במערכות חיות הם עמודי התווך להבנה בטבע התרופה של vivo. במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, פרמטרים אלה מוערכים בדרך כלל על ידי דגימת דם ורקמות תכופה בנקודות זמן מסוימות לאחר מתן התרופה. עם זאת, הליכים אלה הם בדרך כלל פולשניים, לעתים קרובות כוללים מדידות שאינן הישרדות, ומחייבים קבוצות גדולות של בעלי חיים להנעה סטטיסטית. ייתכנו עלות וזמן נוספים, יחד עם חששות אתיים לשימוש מופרז בבעלי חיים. כתוצאה מכך, הדמיה לא פולשנית הופכת במהירות לצעד אינטגרלי במחקרים על ייחוס ביולוגי. מיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית (CLM1,2) מתאימה היטב ליישומי עיניים כדי לדמיין באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של טיפולים בעיני בעלי חיים חיים בעלי רגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה 1,3,4.
CLM יש פוטנציאל להקל על הקרנה חזקה של מערכות אספקת תרופות עינית (DDS), כגון ליפוזומים, לפני כימות מקיף של DDS וזמינות ביולוגית סמים. ליפוזומים אטרקטיביים עבור הגמישות שלהם כוונון התכונות הפיזיקוכימיות והביופיסיות שלהם5,6,7,7,8,9,10,11 כדי לתמצת מגוון גדול של מטען טיפולי ולשלוט באתר הרקמה של שחרור סמים ומשך הפעולה. ליפוזומים שימשו ביישומים עיניים להעברת מולקולות גדולות, כגון נוגדן חד שבטי אווסטין12, ומולקולות קטנות כמו ציקלוספורין13 ו ganciclovir14. ליפוזומים טעונים בתרופות יש מחצית חיים ביולוגית ארוכה יותר, השפעות טיפוליות ממושכות לעומת ניסוחים “תרופה חופשית” לא ליפוזומית. עם זאת, הפצת סמים ברקמת העין מוערכת בדרך כלל מריכוז סמים ברכיבי נוזלים של העין (כלומר, דם, הומור מימי והומור זגוגי15,16,17). כמו הגורל הראשוני ב vivo של מטען התרופה טעון מוגדר על ידי המאפיינים של nanocarrier עצמו, הדמיה CLM של ליפוזומים פלואורסצנטי יכול לשמש פונדקאית עבור התרופה לחשוף מיקוד רקמות בזמני מגורים רקמה במקום. יתר על כן, ראיות חזותיות של משלוח עם CLM יכול לנווט DDS מחדש עיצוב, להעריך את היתרונות הטיפוליים של התרופה, ואולי אפילו לחזות אירועים ביולוגיים שליליים (למשל, רעילות רקמות עקב לוקליזציה לא רצויה של DDS לתקופות ממושכות של זמן).
להלן, הליך שלב אחר שלב מפורט על איך ללמוד את הייחוס הביולוגי העין של ליפוזומים בעכברים חיים עם מערכת CLM כפולת פסים. מערכת CLM ספציפית זו יכולה לזהות פלואורסצנטיות בשני צבעים (עם לייזרי עירור ירוקים ואדומים ב-488 ננומטר ו-660 ננומטר) בזמן אמת, בתדירות של 8 פריימים לשנייה. על ידי הצבה פיזית של גשושית הזיהוי על העין, הפרוטוקול מדגים רכישת תמונה וניתוח של ליפוזומים ירוקים-פלואורסצנטיים על ניהול תת-קומוניאלי בעכברים שהוזרקו מראש תוך ורידי (IV) עם 2% צבע כחול אוונס (EB). צבע EB מסייע לדמיין את המבנים הסקולריים בערוץ הפלואורסצנטיות האדום. אנו מציגים תוצאות מייצגות ממחקר המעריך 100 ננומטר ליפוזומים ניטרליים המורכבים מ- POPC פוספוליפידי (כלומר, 1-פלמיטואיל-2-אולואיל-גליצרו-3-פוספוצולין) ו מסוממים עם פוספוליפיד Fl-DHPE מתויג פלואורסצין (כלומר, N-(פלואורסצ’ין-5-תיוקרבאמול) -1,2-דיהקסה-דקנויל-גליצרו-3-פוספוטהנולמין) ביחס של 95% POPC: 5% Fl-DHPE (איור 1B ). CLM הוא מסוגל ללכוד את ליפוזומים מתויג פלואורסצ’ין ירוק ברזולוציה צירית 15 מיקרומטר ו 3.30 מיקרומטר לרוחב על ידי תיחום של גבולות רקמת העין מוכתמת EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שמוצג מהתוצאות, CLM מספק שיטה פשוטה וישימה לדמיין את התפלגות העין של ליפוזומים בעין. הדגמנו בעבר את השימוש ב- CLM כדי לאפיין את הלוקליזציה של ניסוחים ליפוזומיים שונים בתוך עין העכבר לאורך זמן1. עבור יישומים לא פולשניים, CLM מאפשר הדמיה בזמן אמת של פני השטח העין הקדמית לקבלת תובנ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מענק NTU-Northwestern של מכון ננו-רפואה (NNIN) שהוענק (ל- SV) ובחלקו על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של סינגפור GRANT AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 וקרן הבריאות והמדעים הביו-רפואיים של סינגפור (HBMS) מענק מימון מקדים למיצוב (IAF-PP) H18/01/a0/018 המנוהל על ידי הסוכנות למדע, טכנולוגיה ומחקר (A*STAR) (A*STAR) (ל- AMC). תודה לחברי מעבדת Duke-NUS להדמיה תרגומית ומולקולרית (LTMI) על הסיוע הלוגיסטי והביצוע של המחקרים וההכשרה על ציוד. תודה מיוחדת לגברת ויסנה נוברה על עזרתה במערכת.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
Riferimenti
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
