Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

Published: August 10, 2021 doi: 10.3791/62928
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Toledo

Summary

여기에서 정의 된 프로테오올리포솜의 완전히 정제 된 구성 요소로 Msp1 추출 활동을 재구성하기위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

산화 인산화 및 세포제 조절의 중심지인 미토콘드리아는 인간의 건강에 중요한 역할을 합니다. 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 항상성(proteostasis)을 유지하기 위한 견고한 품질 관리 시스템에 달려 있습니다. 미토콘드리아 프로테오스타증의 감소는 암, 노화, 신경 변성 및 기타 많은 질병과 관련이 있습니다. Msp1은 잘못 지역화된 꼬리 고정 단백질을 제거하여 프로테오스타시스를 유지하는 외부 미토콘드리아 막에 고정된 AAA+ ATPase입니다. 프로테오올리푸좀으로 재구성된 정제 성분을 사용하여, 우리는 Msp1이 지질 이중층에서 모형 꼬리 고정 단백질을 추출하는 데 필요하고 충분하다는 것을 보여주었습니다. 우리의 단순화 된 재구성 시스템은 막 단백질 추출의 상세한 연구를 방해 한 기술적 장벽의 몇 가지 극복. 여기서, 우리는 리포솜, 막 단백질 재구성 및 Msp1 추출 분석의 생성을 위한 상세한 방법을 제공합니다.

Introduction

적절한 세포 기능은 프로테오스타시스라는 공정에 따라 달라지며, 이는 기능성 단백질이 올바른 농도 및 세포 위치1에있는지 확인합니다. 프로테오스타증의 실패는 손상된 세포간 기능으로 이어지며 많은 신경 퇴행성질환2,3,4와연관된다. 멤브레인 단백질은 소수성 막 도메인(TMDs)5로부터응집되는 것을 피하면서 올바른 멤브레인을 대상으로 해야 하기 때문에 프로테오스타증 네트워크에 고유한 과제를 제시한다. 따라서, 특수기계는 사이토솔으로부터 소수성 TMD를 보호하고 적절한 세포막6,7,8,9,10,11,12,13,14,15에대한 표적화 및 삽입을 용이하게 하기 위해 진화하였다.

미토콘드리아는 세포의 대사 허브이며 산화 인산화, 철황 클러스터 생성 및 세포세포조절(16,17)과같은 수많은 필수 세포 과정에 관여한다. 이러한 내시비골 세포기관은 내부 미토콘드리아 막(IMM) 및 외부 미토콘드리아 막(OMM)이라고 하는 두 개의 멤브레인을 함유하고 있다. 1,500개의 인간 미토콘드리아 단백질의 99% 이상이 핵 게놈에 인코딩되며 하나 또는 두 개의 다른 멤브레인18,19를통해 전이되어야 합니다. 따라서 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 표적화 또는 전좌의 오류를 교정하기 위해 강력한 프로테오스타증 네트워크에 의존합니다.

우리 실험실은 매우 C-terminus20,21,22,23,24에서단일 막 도메인을 갖는 꼬리 고정 (TA) 단백질이라고 불리는 미토콘드리아 막 단백질의 하위 집합에 초점을 맞추고 있습니다. TA 단백질은 아포토시스, 소포 수송 및 단백질전좌(25)와같은 여러 필수 공정에 관여한다. TA 단백질의 독특한 토폴로지는20,26,27,28에의해 꼬리 고정(GET) 또는 내피성 망상 막 단백질 복합체(EMC) 경로 또는 OMM로 의 유도 진입에 의해 내피성 망상(ER)에서 발생하는 번역 후삽입이필요합니다. TMD의 생물학적 특성은 TA 단백질을 올바른멤브레인(29)으로유도하기에 충분하고 충분하다. 정의된 서열 모티브가 아닌 생물물리학적 특성의 인식은 표적 통로5의충실도를 제한한다. 따라서, TA 단백질의 오현지화는 프로테오스타증 네트워크에 대한 일반적인 스트레스이다. GET 통로의 억제와 같은 세포 스트레스는 이러한 단백질이 즉시제거되지않는 한 OMM 및 미토콘드리아 기능 장애에 대한 단백질 오현지화의 증가를 일으킨다30,31.

막 프로테오스타증의 일반적인 주제는 AAA+(세포 Activities로 분리된 TPase A)단백질을 사용하여 지질 이중층1, 32,33,34,35,36,37,38에서 오래된, 손상또는 잘못 지역화된 단백질을 제거하는것입니다. . AAA+ 단백질은 hexameric 링을 형성하고 ATP 의존적인 움직임을 거쳐 기판을 리모델링하는 분자 모터이며, 종종 좁은 축 모공을 통해 전좌로39,40을한다. AAA+ ATPases에 의해 막 단백질의 추출을 연구하는 데 큰 노력이 전념되었지만, 재구성은 복잡하거나 지질 양성자로부터 기판 추출 메커니즘을 검사하는 실험력을 제한하는 지질 및 세제41,42의혼합물을 포함합니다.

Msp1은 OMM 및 peroxisomes에 고정된 매우 보존된 AAA+ ATPase로, 잘못 지역화된 TA 단백질43,44,45,46,47을제거하여 막 프로테오스타시스에서 중요한 역할을 한다. Msp1은 또한 최근에 OMM48을가로질러 전가되는 막 단백질을 제거하여 미토콘드리아 단백질 수입 스트레스를 완화하는 것으로 나타났다. Msp1 또는 인간 호모로그 ATAD1의 손실은 미토콘드리아 단편화, 산화 인산화, 발작, 뇌졸중 후 부상 증가, 조기 사망31,49,50,51,52,53,54,55, 56을초래한다.

우리는 Msp1과 TA 단백질을 공동 재구성하고 지질이중층(57)으로부터추출을 검출할 수 있음을 보여주었다. 이러한 단순화된 시스템은 OMM(도1)58,59를모방한 정의된 리포솜으로 재구성된 완전 정제 된단백질을사용합니다. 실험 적인 대조의이 수준은 다른 AAA+ 단백질을 관련시키는 더 복잡한 재구성으로 실험적으로 난치성 기판 추출의 상세한 기계론적 질문을 해결할 수 있습니다. 여기서, 우리는 리포솜 제제, 막 단백질 재구성 및 추출 분석법을 위한 우리의 방법을 상세히 설명하는 실험 프로토콜을 제공합니다. 이러한 실험적 세부 사항이 멤브레인 프로테오스타증의 필수적이지만 제대로 이해되지 않은 과정에 대한 추가 연구를 용이하게 할 수 있기를 바랍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 리포솜 준비

  1. 지질의 클로로폼 스톡을 적절한 비율로 결합하여 외부 미토콘드리아 막을 모방합니다.
    1. 지질 혼합물 25 mg을 준비합니다. 미토콘드리아 막을 모방한 지질의 이전에 확립된 혼합물을 사용하고, 48:28:10:10:4 닭고기 계란 인산단 콜린 콜린 (PC), 치킨 계란 인파디딜 에탄올라민 (PE), 소 간 인파디올 이노 시 톨 (PI), 합성 1,2-디오의 어금니 비율 [sn-glycero-3-phospho-L-serine] 및 합성 1',3'-비스[1,2-디오레오틸-센-글리세로-3-인포]-글리세롤(TOCL)58,59. 샘플 계산은 표 1에표시됩니다.
    2. 이 응축을 제한하기 때문에 열기 전에 모든 지질 주식을 실온에 가져. 대부분의 실험실은 지질의 농도를 측정하는 정확한 방법이 없기 때문에 클로로폼 스톡에 흡수되는 모든 물은 지질 재고의 농도를 변화시키고 따라서 분석에 사용되는 지질의 비율을 변화시합니다.
    3. 지질 재고가 유리 앰플에 들어오면 필요한 양의 지질을 1mL 주사기를 사용하여 유리 유리 병으로 옮기습니다. 지질 산화를 방지하기 위해 유리병에 디티오스레이톨(DTT)2 mg을 추가합니다. 클로로폼의 증발이 지질의 농도를 변화시킬 때 신속하게 작동합니다.
    4. 남은 지질을 별도의 유리 바이알로 옮기고 PFTE 셉타에 맞습니다. 유리병에 DTT 2 mg을 넣고 파라필름으로 감싸고 -20°C에 보관하여 지질 산화를 방지합니다. 바이알로 옮겨간 후 3개월 이내에 지질을 사용해 보십시오. 마커 유출에 의해 클로로폼 주식의 잠재적 오염을 방지하기 위해, 마커가 있는 라벨이 아닌 원래 앰플에서 유리 바이알로 스티커를 전송합니다.
  2. 연기 후드에서 유리 유리병을 손으로 연속회전시키면서 질소의 매우 부드러운 스트림에서 엽록체를 증발시켜 본질적으로 수동 로토바프로 작용합니다. 유리병을 일체형 속도(20-40rpm)로 스핀하여 지질을 계속 움직입니다. 목표는 모든 클로로폼을 증발시키고 유리 병부 전체에 지질코팅을 하는 것입니다.
    주의: 클로로폼은 신경독성이며, 이 단계는 연기 후드에서 수행해야 합니다.
    1. 질소 튜브에 신선한 파스퇴르 파이펫을 부착합니다. 유리병이나 파스퇴르 파이펫에 지질이 튀지 않도록 하십시오. 유리병 의 바닥에 끝을 조준하여 공기가 바닥에서 튀어 나와 지질을 유리병 의 중심으로 밀어 넣습니다. 모서리 또는 캡에 축적되는 것을 피하면서 전체 유리병에 균일한 코팅을 받으십시오. 이 전체 프로세스는 약 5분이 소요됩니다.
    2. 혼합물이 지질의 "구슬"로 두꺼워지므로 유리병의 각도를 변경하여 유리병의 중심으로 안내하십시오. 비드가 작아지기 시작하면 질소 스트림을 약간 올려 비드를 분산시켜 지질이 유리병에서 불어나오지 않도록 합니다.
  3. 진공 상태에서 남은 클로로폼을 제거합니다.
    1. 유리 유리병을 집 진공 또는 다이어프램 진공 펌프에 1시간 동안 올려 놓고 대부분의 잔류 클로로폼을 제거합니다. 이러한 진공청소기는 일반적으로 모든 클로로폼을 제거할 만큼 강하지는 않지만, 회전식 헛된 진공청소기보다 소량의 용매를 더 잘 견딜 수 있다.
    2. 유리병을 12-16h의 강한 진공(<1 mTorr)에 넣어 모든 잔류 클로로폼을 제거합니다. 이 과정에서 바이알의 충돌을 피하십시오.
  4. 리포솜 완충제 1.25mL에서 지질을 재연한다(50m HEPES KOH pH 7.5, 15% 글리세롤, 1mM DTT). 우리가 시작 으로 25 지질의 mg, 이 의 농도 결과 20 mg/mL. 눈에 보이는 덩어리없이 지질을 완전히 다시 중단합니다. 유리병 의 구석에 풀리있는 지질경우, 이것은 긴 과정이 될 수 있습니다.
    1. 유리병은 시료가 유백색이 부드러워질 때까지 힘차게 소용돌이합니다. 우리는 클로로폼 증발이 전날 밤에 제대로 수행된 경우,이 과정은 약 5-10 분 이 필요하다는 것을 발견했습니다.
    2. 지질의 완전한 재서스펜션을 보장하려면 실온에서 ~80 rpm에서 3시간 동안 휠을 회전하십시오. 1분 동안 1분마다 휠에서 유리병을 제거하여 믹싱을 보장합니다.
  5. 깨끗한 1.5 mL 마이크로 센세이스립지 튜브에 지질을 조심스럽게 옮기십시오. 액체 질소를 사용하여 동결 해동 사이클 5회, 해동시 30°C 열블록을 수행합니다. 이 단계는 다발성 멜라 소포를 유니라멜라 소포로 변환하는 데 도움이됩니다.
  6. 지질을 돌출합니다.
    1. 동결 해동 주기 동안 미니 압출기준비합니다. 10mm 필터 지지대와 원하는 모공 크기의 폴리 카보네이트 멤브레인(200nm 사용)으로 미니 압출기조립. 필터의 크기는 리포솜의 크기에 영향을 미치며, 이는 재구성에 필요한 단백질의 농도에 영향을미칩니다(2.3단계).
    2. 미니 압출기를 핫 플레이트에 놓고 압출기 온도를 최대 60 °C까지 가져옵니다.
    3. 지질을 1mL 가스가 단단한 유리 주사기로 끌어올려 미니 압출기의 한쪽 끝에 조심스럽게 배치하십시오. 빈 가스가 단단한 주사기를 미니 압출기의 반대편에 놓습니다. 지질이 압출기 스탠드 온도에 5-10 분 동안 평형화되도록 합니다.
    4. 충전된 주사기의 플런저를 부드럽게 밀어 대체 주사기로 지질을 옮기습니다. 대체 주사기에서 용액을 원래 주사기로 밀어 넣습니다. 이 전후 과정을 15번 반복하여15번 패스에서 지질이 대체 주사기로 끝나게 됩니다. 각 패스의 볼륨을 모니터링하여 누출이 없는지 확인합니다.
  7. 지질의 일회용 알리쿼트, 액체 질소에 플래시 동결 및 -80 °C에 저장하십시오. 리포솜은 몇 달 동안 -80°C에서 안정적입니다. 재구성은 한 번에 10 μL의리포솜(2.3.4단계)이필요하므로 10 μL 또는 20 μL 알리쿼트를 준비하는 것이 편리합니다.

2 Msp1 및 모델 TA 단백질의 재구성

  1. 재구성 버퍼 준비: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM 칼륨 아세테이트, 7 mM 마그네슘 아세테이트, 2 mM DTT, 10% 자당, 0.01% 나트륨 아지드, 0.2-0.8% Deoxy 빅채스(DBC).
    1. 리포솜의 새로운 배치에 대한 재구성 조건을 최적화합니다. 최적의 재구성에 필요한 DBC 및 바이오비드의 농도는 사용되는 리포솜의 배치에 따라 다릅니다. 준비 를 준비하여 가변성을 제한하려면 모든 실험에 동일한 DBC를 많이 사용합니다. 많은 DBC를 변경할 때 최적화 프로세스를 반복합니다.
    2. 새로운 리포솜 배치가 준비될 때마다 DBC(0.2% - 0.8%) 및 바이오비드(25 mg - 100 mg)의 다양한 농도로 일련의 재구성을 설정한다. DBC를 ~0.12%의 임계 미셀 농도(CMC) 이하로 떨어뜨리지 않는 것이 중요합니다. 조건이 최적화되면 동일한 리포솜 준비 및 재구성 조건을 사용하여 모든 데이터를 수집하는 것이 좋습니다.
    3. 3단계에서기재된 추출 분석체를 이용하여 다양한 재구성 조건의 효과를 분석한다.
  2. 250 mg/mL의 최종 농도에서 바이오비드를 준비하십시오.
    1. 말린 바이오비드 2.7g의 무게를 측정하고 구슬을 적시하기 위해 100 % 메탄올 (약 45 mL)의 50 mL 원심 분리 튜브에서 재연합니다. 처음에는 공기가 구슬의 모공에 갇히는 것을 방지하기 위해 메탄올에 바이오비드를 적시고 있습니다. 메탄올에 들어가면 바이오비드에 갇힌 공기가 세제 흡수 능력을 변화시키기 때문에 바이오비드를 젖게 하십시오.
    2. 구슬8x를 약 45mL(18.2mΩ)로 세척하여 메탄올을 제거하길, 그 후 1분 동안 3,200 x g에서 회전하여 ddH2O. 펠릿 구슬로 지칭한다. 액체를 데산하고 ddH2O로 다시 중단합니다.
    3. 세척 후, 0.02% 나트륨 아지드로 ddH2O 10ml로 재차 주중단하고 4°C에 보관하십시오. 바이오비드는 몇 달 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 이 스톡은 세척 단계에서 ~0.2g이 손실된 것으로 가정되기 때문에 250 mg/mL입니다.
  3. 리포솜 당 리포솜 및 원하는 수의 분자를 계산합니다. 이것은 재구성에 필요한 Msp1 및 TA 단백질의 농도를 결정합니다.
    1. 먼저, d가 리포솜의 직경인 방정식을 이용하여, Equation 1 h는 이중층의 두께이고, 지질 헤드그룹 영역인 유니라멜라 지질당 지질 분자의 수를 계산한다.
      1. DLS로 리포솜 직경을 측정합니다. 본보기에서, 리포솜직경(d)에대한 70nm의 값을 얻었다.
      2. h용 5nm, 인산염의 헤드그룹 크기인0.71 nm2의 값을 사용합니다. 이 특별한 상황에서 N합계는 37,610입니다.
    2. 다음으로, 지질M 지질의 어금니 농도를 혼합물내지질의 평균 분자량을 사용하여 계산한다. 이 예에서, 지질의 농도는 20 mg/mL(1.4단계)이고 지질의 평균 분자량은 810 g/mol(표1)이다. 이로 인해 MLipid의값은 0.0247 M입니다.
    3. 다음으로, 지질성, MLiposome의어금니 농도를 Equation 2 계산하여 M지질이 2.3.2 단계로부터지질의 대구체 농도인 방정식을 이용하여, N합계는 2.3.1단계로계산된 지질당 지질의 총 수이다. 이 예에서, 리포솜의 20 mg/mL 재고 농도는 약 660 nM이다.
    4. 100 μL 재구성 반응에 필요한 Msp1 및 TA 단백질의 양을 계산합니다.
      참고: 재구성에 지질의 최종 농도는 2 mg/mL, 리 포 육 수의 10 배 희석. 이것은 66 nM의 최종 리포솜 농도를 제공합니다. Msp1의 최종 농도는 792 nM이며, 리포솜 당 평균 12부(기능성 hexamers)를 제공합니다. TA 단백질의 최종 농도는 660 nM이며, 이는 리포솜 당 평균 10 사본을 제공합니다.
  4. PCR 튜브에서 정제된 Msp1, TA 단백질 및 리포솜을 재구성 버퍼에 함께 섞습니다. 첨가순서는 완충, 단백질, 리포솜이 지속된다. 총 부피는 100 μL입니다. 혼합물이 얼음 위에 10분 동안 앉도록 합니다. 이전에 설명된57과같이 Msp1 및 TA 단백질을 정화합니다.
    1. 잘 특징적인 모델 TA 단백질 His-Flag-Sumo-Sec22를 먼저 분석서를 확립할 때 양성 대조군 기판으로 사용하십시오. 이 구조는 쉽게 정화하기 위한 히스트 태그, 서쪽 블롯에 의한 검출을 위한 3x-Flag 태그, 용해도 향상을 위한 스모 도메인, MSP1에 의한 재구성 및 인식을 위한 ER-TA 단백질 Sec22의 TMD를 가지고 있습니다.
    2. Msp1과 TA 단백질의 스톡 솔루션이 약 100 μM이되어 재구성에 대한 단백질 정제로부터 N-Dodecyl β-D-maltoside(DDM)의 효과를 최소화합니다. 정제 된 Msp1은 20m HEPES pH 7.5, 100 mM 염화 나트륨, 0.1 mM Tris (2-carboxyethyl)인 포스핀 염산염 (TCEP), 0.05 % DDM 반면 정제 된 TA 단백질은 50 mM Tris pH 7.4, 150mM 나트륨 염화, 10m mm 마그네슘 염화나트륨, 5m β-메르카페탄 0.0% 약 100μM TA 단백질 및 Msp1 단량의 스톡 솔루션은 이러한 구성 요소가 최종 재구성 량의 < 5%를 구성하여 CMC 보다 DDM이 희석되도록 합니다.
  5. 원하는 양의 바이오비드를 시료에 추가하여 세제를 제거합니다.
    1. p200 파이펫 팁의 끝을 직경 약 1/8인치로 잘라 서 구슬이 끝을 통해 들어갈 수 있도록 합니다. 바이오비드 튜브를 철저히 소용돌이쳐 균일한 혼합물을 얻고 바이오비즈가 정착하기 전에 뚜껑과 피펫을 빠르게 제거합니다. 바이오비드를 빈 PCR 튜브로 옮기습니다.
    2. 재구성이 얼음에 10 분 배양을 완료한 경우, 비컷 파이펫 팁을 사용하여 바이오 비드에서 모든 액체를 제거하십시오. 그런 다음 100 μL 재구성을 바이오비드와 함께 튜브로 옮킨다. 바이오비드가 공기를 함정에 빠뜨리지 않도록 신속하게 수행해야 하며, 이로 인해 구슬이 떠 있습니다.
  6. 4°C에서 16시간 동안 ~80rpm에서 휠에서 재구성을 회전시키십시오.
  7. 바이오비드에서 재구성된 물질을 제거합니다. 피카푸지에서 빠른 스핀을 하여 바이오비드를 펠릿한 다음 절단되지 않은 파이펫 팁을 사용하여 재구성된 재료를 깨끗한 PCR 튜브로 옮길 수 있습니다. 샘플에 바이오비드가 남아있을 때까지이 과정을 1-2 번 반복하십시오. 얼음에 재구성을 유지합니다.
  8. 리포솜으로 재구성하지 못한 단백질을 제거하기 위해 재구성된 물질을 미리 치웁울 수 있습니다.
    1. 추출 버퍼 준비: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM 칼륨 아세테이트, 7 mM 마그네슘 아세테이트, 2 mM DTT, 100 nM 칼슘 염화칼슘.
    2. 제조업체의 지시에 따라 추출 버퍼로 글루타티온 스핀 컬럼을 평형화합니다. 이것은 일반적으로 버퍼의 400 μL와 세척의 3 라운드를 포함하고 버퍼를 제거하기 위해 실온에서 2 분 동안 700 x g에서 원심 분리.
    3. 각 보호자(GST-SGTA 및 GST-칼모둘린)의 5μM을 재구성된 재료에 추가합니다. 이 chaperones는 리포솜으로 재구성하는 데 실패한 어떤 단백질의 TMD에 결합할 것입니다. 샤페론의 정화는 이전에 설명되었다6,57.
      참고 : 이러한 보호자는 시판되게 사용할 수 있지만, 우리는 비용과 품질을 제어하기 위해 집에서 정화하는 것을 선호합니다. 두 단백질모두 20m Tris pH 7.5, 100mMM염화 나트륨 및 0.1 mM TCEP에 있으며, 약 160 μM의 재고 농도를 갖습니다. SGTA는 매우 소수성 TMD를 가진 기판을 인식하는 반면 칼모둘린은 중간 소수성6,29로TMD를 묶는다. 이 샤페론 칵테일은 다양한 기판을 인식할 수 있습니다.
    4. 재구성된 재료에 100μL의 추출 버퍼를 추가하여 최대 200μL의 부피를 가져온다. 평형 글루타티온 스핀 컬럼에 이 것을 추가합니다. 글루타티온 스핀 컬럼은 사전 클리어링 부피가 200 ~ 400 μL일 때 가장 높은 샘플 복구를 제공합니다.
    5. 스핀 컬럼을 연결하고 4°C에서 ~80rpm에서 30분간 회전하여 보호자가 수지에 결합할 수 있도록 합니다.
    6. 실온에서 2분 동안 700 x g의 열을 회전시합니다. 관통하는 흐름은 골재단백질의 고갈되는 미리 지워진 물질이다. 얼음에 재료를 유지하고 추출 분석으로 직접 진행합니다.

3. 추출 분석

  1. SDS PAGE 분석을 위한 튜브를 준비합니다. 각 반응에는 입력(I), FLOW THROUGH(FT), WASH(W), ELUTE(E)의 4개의 튜브가 있습니다.
    1. 입력 튜브에 ddH2O 샘플 45 μL, 튜브를 통해 서투에 ddH2O의 40 μL, WASH 및 ELUTE 튜브에 0 μL을 추가합니다.
      참고: 이 분석에서 가장 좋은 신호 대 잡음 비율은 WASH 및 ELUTE 샘플이 입력 및 흐름을 통해 샘플에 비해 5배 집중될 때 얻어진다. 분석 중 희석으로 인해 입력 샘플5 μL, FLOW through 샘플용 샘플 10 μL, WASH 및 ELUTE 샘플에 대한 50 μL 샘플을 복용해야 합니다.
    2. 각 튜브에 4배 SDS PAGE 로딩 버퍼의 16.6 μL을 추가합니다. 각 샘플의 총 부피는 SDS 페이지 로드 버퍼 전에 50 μL입니다. 최종 부피는 66.6 μL(50 μL 샘플 + 4배 SDS 페이지 로딩 버퍼의 16.6 μL)입니다.
  2. 추출 분석서를 조립합니다.
    1. 미리 클리어된 프로테오이포솜 60μL, GST-SGTA 5μM, GST-칼모둘린 5μM, 2mM ATP를 포함하는 추출 반응을 준비한다. 반응을 시작하는 데 사용되는 ATP를 제외한 모든 시약을 결합합니다. 추출 버퍼를 사용하여 200 μL의 최종 부피를 가져옵니다.
      참고: 각 추출 분석에 대해 60 μL의 샘플이 사용되기 때문에 3개의 다른 추출 분석에 한 번의 재구성을 사용할 수 있습니다. 동일한 재구성의 자료에 대해 양수 및 음수 컨트롤(+ATP 및-ATP)을 수행합니다.
    2. 30°C 열 블록에서 2분간 미리 따뜻한 추출 분석.
  3. ATP를 2mM의 최종 농도에 추가하고 타이머를 시작하여 추출 분석서를 시작합니다.
    1. 반응에 ATP를 혼합하는 피카푸지에 5 초 스핀을 제공합니다. 30°C에서 30분간 반응을 배양한다.
    2. 인큐베이션 중에 반응의 5 μL을 취하고 입력 튜브에 추가하십시오. 이 것의 타이밍은 유연합니다.
    3. 이 잠복기 동안 추출 분석에서 각 샘플에 대해 글루타티온 스핀 컬럼 1개를 평형화합니다.
  4. 추출된 물질을 분리하기 위해 샤페론을 아래로 당깁니다.
    1. 30분 배양이 완료되면 튜브에 200μl의 추출 버퍼를 추가하여 총 부피를 400μL로 가져옵니다. 평형 글루타티온 수지에 추가하고 30 분 동안 4 ° C에서 바퀴에 바인딩 할 수 있습니다.
    2. 열을 700 x g로 실온에서 2분 동안 회전하여 흐름을 수집합니다. 튜브를 통해 흐르는 데 10 μL을 가져 가라. 이 샘플에는 지질 이중층에 여전히 통합된 기판이 포함되어 있습니다.
    3. 400 μL의 추출 버퍼로 수지를 두 번 세척하여 흐름을 폐기합니다. 세 번째 세척에서 흐름을 유지하고 워시 튜브에 대해 50 μL을 복용하십시오.
    4. 추출 버퍼에서 5mMM의 최종 농도에 감소된 글루타티온을 추가하여 5mL의 용출 버퍼를 준비하십시오. 이 버퍼는 매번 새로 준비합니다.
    5. 스핀 컬럼에 200 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 실온에서 2분간 700xg로 회전하여 엘ute로 이동합니다. 흐름을 유지합니다. 총 용출 부피가 400 μL이 되도록 프로세스를 두 번째로 반복합니다.
    6. 용출 샘플에서 50 μL의 샘플을 받아 ELUTE 튜브에 추가하십시오.
  5. SDS 페이지 및 서부 블롯을 사용하여 추출 활동을 분석합니다.
    참고: 서부 얼룩은 상당히 표준 절차이기 때문에 이 분석기고유의 몇 가지 세부 사항을 강조하는 기본 프로토콜이 제공됩니다.
    1. 샘플을 얼룩이 없는 폴리아크릴아미드 젤(4% 스태킹, 15% 분리)에 적재하고 트리스 글리신 버퍼에서 50분 동안 200V에서 실행합니다. 공간이 허락하는 경우 얼룩이 없는 사다리와 스테인드 래더를 사용하여 얼룩이 없는 젤 이미저에 대한 시각화를 허용하고 각각 PVDF 멤브레인으로 이송하십시오. 얼룩 없는 젤은 자외선으로 활성화시 단백질을 함유한 트립토판의 정량적 시각화를 허용하면서도 젤을 서부 블롯에 사용할 수 있게 합니다.
    2. 모든 샘플에 동일한 로딩이 있는지 확인하기 위해 얼룩이없는 젤을 이미지합니다. 이것은 서양 얼룩에 의해 검출된 신호에 있는 어떤 변경든지 가변 단백질 적재의 결과지 않다는 것을 보장하는 필수적인 통제입니다. 입력 및 ELUTION 샘플에는 샤페론(GST-칼모둘린 및 GST-SGTA)에 대해서만 가시밴드가 있어야 합니다. ELUTE 샘플이 입력 샘플보다 더 집중될 것이라는 점을 기억하십시오.
    3. 45 μm PVDF 멤브레인을 사용하여 서쪽 블롯 카세트를 조립합니다. 60 분 동안 300 mA의 일정한 전류로 전송합니다.
    4. 멤브레인을 차단한 후, 1차 항체에 4°C에서 부드러운 흔들림 ~15 rpm으로 결합한다. 1:1,000 희석에서 토끼 안티 플래그와 기판에 대한 얼룩.
      참고: 사용되는 1차 및 이차 항체는 기판 특이적이며 사용 집중도가 최적화되어야 할 수도 있다.
    5. 세척 막과 이차 항체, 염소 안티 토끼 1:10,000 희석, 실온에서 1 시간 동안 부드러운 흔들림.
    6. 서체 블로팅 검출제를 사용하여 분석을 위한 멤브레인 및 이미지를 세척합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

결과를 제대로 해석하려면 얼룩이없는 젤과 서부 얼룩을 함께 보아야합니다. 얼룩없는 젤은 모든 샘플에 걸쳐 동일한 로딩을 보장합니다. 얼룩 없는 젤을 볼 때, 샤페론(GST-칼모둘린 및 GST-SGTA)은 입력(I) 및 ELUTE(E) 레인에서 볼 수 있습니다. 이러한 대역의 강도가 모든 입력 샘플에서 균일한지 다시 확인합니다. 마찬가지로 ELUTE 샘플에서 강도가 균일하게 유지되도록 합니다. ELUTE는 입력보다 5배 더 농축되어 있으며 강도의 차이는 젤에서 볼 수 있습니다.

얼룩 없는 젤을 사용하여 적절한 하중을 확인한 후, 서풍 블롯을 검사하여 추출 활성을 결정합니다. 입력(I) 분획에 비해 ELUTE(E) 분획의 기판 양을 비교하여 추출 활동을 측정합니다. 유량 통과(FT)의 신호는 일부 가변성을 나타내지만 일반적으로 입력 분획과 유사합니다. WASH(W) 분획에는 신호가 없어야 합니다. 전형적으로, 음수 제어에 대한 양수 제어 및 1-2% 추출 효율에 대한 추출 효율이 ~10%(도2)가있다. ELUTE 분수는 입력 분수만큼 5배 나 강렬하므로 추출 효율을 판단할 때 이를 고려해야 합니다. 재구성 조건이 최적화되지 않으면 일반적으로 + ATP 및 -ATP 샘플(그림 3)모두에서 유사한 추출 수준이있습니다. 이 결과는 Msp1이 효율적으로 재구성되지 않아 기능적인 Msp1 hexamer가 없는 수많은 프로테오올리푸좀을 생성하여 발생합니다.

지질 두더지 % MW 평균 MW 25 mg의 μmol mg 에서 25 mg 염분(mg/mL) 25 mg용 μL
개인용 컴퓨터 48% 770 369.6 14.82 11.41 25 456.4
PE 28% 746 208.88 8.64 6.45 25 258.0
원주율 10% 902 90.2 3.09 2.78 10 278.5
독스 (DOPS) 10% 810 81 3.09 2.50 10 250.1
토클 (토클) 4% 1502 60.08 1.23 1.85 25 74.2
콘크 코르 Avg MW 809.76
25 mg의 μmol 30.87

표 1: 리포솜 준비를 위한 샘플 계산입니다. 이 표의 주요 목표는 지질 혼합물의 평균 분자량과 리포솜을 만드는 데 필요한 각 지질 육수의 부피를 보정한 농도를 계산하는 것입니다. MW 및 재고 농도는 제품 라벨에서 비롯됩니다. 지질과 두더지 %는 사용자가 선택합니다.

Figure 1
그림 1: 추출 분석 및 주요 단계 목록의 만화.

Figure 2
그림 2: 제대로 작동하는 분석서를 보여주는 대표 데이터. 추출 효율은 ELUTE 분획의 기판 양을 입력 분획과 비교하여 결정됩니다. 젤은 입력 분획에 비해 ELUTE 분획의 5배 더 높은 로딩을 가지고 있음을 기억하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 실패한 재구성 및 추출 분석의 대표 데이터. 여기서+ ATP 샘플의 활동은 ATP 샘플의 활동과 비슷합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

적절한 미토콘드리아 기능은 강력한 단백질 품질 관리 시스템에 따라 달라집니다. TA 단백질 표적화 경로의 충실도에 내재된 한계로 인해 잘못 지역화된 TA 단백질은 미토콘드리아에 대한 지속적인 스트레스 원천입니다. 미토콘드리아 프로테오스테아증 네트워크의 핵심 성분은 OMM에서 잘못 국산화된 TA 단백질을 제거하는 멤브레인 고정 AAA+ ATPase인 Msp1입니다. 여기에서, 우리는 proteoliposomes를 준비하는 방법을 설명했습니다, 공동 재구성 Msp1 및 모형 TA 단백질, 추출 분석기를 능력을 발휘합니다. 우리는 이전에 Msp1이 잘못 된 TA 단백질을 직접 인식하고 어떤 액세서리 단백질이나 공동 요인없이 지질 이중 층에서 이러한 단백질을 추출 할 수 있음을 증명하기 위해이 분석기를 사용했다57.

분석의 단점은 재구성 과정에서 약간의 가변성이 있다는 것입니다. 준비-준비 가변성을 제어하기 위해, 우리는 항상 우리의 분석이 의도 한대로 작동하는지 확인하기 위해 동일한 젤 / 웨스턴 블롯에 긍정적이고 부정적인 제어를 포함한다. 우리는 다른 날에 행해진 재구성을 비교하거나 다른 서부 얼룩 사이의 비교를 그리는 것을 피합니다. 우리가 만드는 유일한 비교는 병렬로 재구성된 견본을 위한 이고 동일 젤/서쪽 얼룩에서 실행됩니다. 우리는 또한 데이터 해석에서 매우 보수적입니다. ImageJ를 사용하여 추출 효율성을 정량화할 수는 있지만 일반적으로 실험을 전체 활동, 중간 활동 또는 활동이 없는 것으로 설명합니다.

가변성의 한 공급원은 재구성된 단백질의 총 양입니다. 대부분의 비법인 단백질은 사전 청산 공정에 의해 제거되지만, Msp1의 완벽한 재구성 효율이 적어 기판 추출의 관찰된 효율에 큰 영향을 미칠 수 있다. 이 효과는 Msp1이 호모사기로 작동하지만 단조량57로정화한다는 사실에서 비롯됩니다. Msp1의 6배 사본 이외의 것을 포함하는 리포솜은 비활성 상태입니다. 예를 들어 Msp1 의 복사본이 5부만 있는 리포솜은 비활성 상태가 됩니다. 안정적인 전체 길이 Msp1 hexamers를 형성하는 유일한 방법은 비 가수분해성 ATP 유사체 (ATPγS) 또는 활성화 E193Q 워커 B 돌연변이와 ATPase 활동을 비활성화하는 것입니다, 어느 쪽도 활동 분석과 호환되지 않습니다. 이 기술적 장애물을 극복하는 것은 실험실에서 활발한 연구 분야입니다.

활성 연구의 또 다른 영역은 추출 분석더 정량적 만들기에 초점을 맞추고 있습니다. 현재 방법은 신호 감지를 위해 풀 다운및 서부 블로팅에 의존하며, 둘 다 반정량일 뿐 분석가 가변성을 보여 준다. 추출된 기판의 공유 변형은 풀 다운에서 발생하는 가변성을 제거합니다. 마찬가지로, 기판에 방사성 또는 형광 라벨을 사용하면 서쪽 얼룩과 관련 가변성에 대한 필요성이 제거됩니다.

분석의 주요 강점은 시스템이 완전히 정의된다는 것입니다. 멤브레인 단백질은 재조합적으로 표현되고 정제되며, 반응의 특정 측면을 연구하기 위해 Msp1 및 기판 모두에서 정의된 돌연변이를 만들 수 있습니다. proteostasis에 있는 지질 환경의 역할은 상세한 방식으로 이것을 공부의 기술적인 도전 때문에 크게 무시되었습니다. 우리의 분석은 정의된 지질 조성물을 가진 지질을 사용하기 때문에, 이것은 지질 환경의 완전한 실험 통제를 허용합니다. 지질 유동성, 양층 두께, 헤드그룹 정체성 및 리포솜 크기와 같은 요인을 쉽게 조절할 수 있습니다. 우리는 Msp1 활동에 지질 환경의 역할을 검사하기 위해 우리의 분석기를 사용하기 위해 적극적으로 노력하고 있습니다. 여기에 설명된 체외 재구성 및 추출 분석체가 지질 이중층에서 막 단백질의 일반적인 세포 과정을 연구하는 단순화된 모델 시스템으로 작용할 수 있기를 바랍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

없음

Acknowledgments

MLW는 시카고 대학의 로버트 키넌 박사와 함께 박사 후 연구 를 하는 동안이 프로토콜의 일부를 개발했습니다.

이 작업은 MLW에 NIH 보조금 1R35GM137904-01에 의해 투자된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, New York, N.Y. (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, New York, NY. 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, Copenhagen, Denmark. 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, New York, NY. 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, Copenhagen, Denmark. 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, New York, NY. 3099 (2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR - a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, New York, NY. (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Tags

생화학 제174
완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fresenius, H. L., Wohlever, M. L.… More

Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter