Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstituering av msp1-ekstraksjonsaktivitet med fullstendig rensede komponenter

Published: August 10, 2021 doi: 10.3791/62928
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Toledo

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll for rekonstituering av Msp1 utvinning aktivitet med fullt rensede komponenter i definerte proteoliposomer.

Abstract

Som senter for oksidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en viktig rolle i menneskers helse. Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust kvalitetskontrollsystem for å opprettholde protein homeostase (proteostase). Nedgang i mitokondrieproteostase har vært knyttet til kreft, aldring, nevrodegenerasjon og mange andre sykdommer. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ytre mitokondriemembranen som opprettholder proteostase ved å fjerne feilaliserte hale-forankrede proteiner. Ved hjelp av rensede komponenter rekonstituert i proteoliposomer, har vi vist at Msp1 er nødvendig og tilstrekkelig til å trekke ut et modell hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vårt forenklede rekonstituerte system overvinner flere av de tekniske barrierene som har hindret detaljert studie av membranproteinutvinning. Her gir vi detaljerte metoder for generering av liposomer, membranproteinrekonstituering og Msp1-ekstraksjonsanalysen.

Introduction

Riktig cellulær funksjon avhenger av en prosess som kalles proteostase, som sikrer at funksjonelle proteiner er i riktig konsentrasjon og cellulær plassering1. Feil i proteostase fører til kompromittert organellefunksjon og er forbundet med mange nevrodegenerative sykdommer2,3,4. Membranproteiner gir unike utfordringer for proteostasenettverket, da de må målrettes mot riktig membran samtidig som de unngår aggregering fra de hydrofobe transmembrandomenene (TMDs)5. Følgelig har spesialiserte maskiner utviklet seg for å beskytte den hydrofobe TMD fra cytosolen og lette målretting og innsetting i riktig cellulær membran6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Mitokondrier er cellens metabolske nav og er involvert i mange viktige cellulære prosesser som: oksidativ fosforylering, jern-svovelklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organellene inneholder to membraner, referert til som den indre mitokondriemembranen (IMM) og den ytre mitokondriemembranen (OMM). Over 99% av de 1500 humane mitokondrieproteinene er kodet i atomgenomet og må omfordeles over en eller to forskjellige membraner18,19. Riktig mitokondriefunksjon avhenger derfor av et robust proteostasenettverk for å korrigere eventuelle feil i proteinmålretting eller translokasjon.

Laboratoriet vårt fokuserer på en undergruppe av mitokondriemembranproteiner kalt hale-forankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomene ved selve C-terminus20,21,22,23,24. TA-proteiner er involvert i en rekke essensielle prosesser, for eksempel apoptose, vesicle transport og proteintranslokasjon25. Den unike topologien til TA-proteiner krever post-translasjonell innsetting, som forekommer i endoplasmic retikulum (ER) ved guided entry of Tail-anchored (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veier eller inn i OMM av en dårlig karakterisert sti20,26,27,28. De biofysiske egenskapene til TMD er nødvendige og tilstrekkelige til å lede TA-proteiner til riktigmembran 29. Anerkjennelsen av biofysiske egenskaper i stedet for et definert sekvensmotiv begrenser gjengivelsen av målrettingsveiene5. Dermed er feillokalisering av TA-proteiner et vanlig stress for proteostasenettverkene. Cellulært stress, som hemming av GET-banen, forårsaker en økning i protein feillokalisering til OMM og mitokondrie dysfunksjon med mindre disse proteinene fjernes raskt30,31.

Et vanlig tema i membranproteostase er bruken av AAA+ (ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner for å fjerne gamle, skadede eller feillokaliserte proteiner fra lipidbilayeren1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA+ proteiner er molekylære motorer som danner heksameriske ringer og gjennomgår ATP-avhengige bevegelser for å ombygge et substrat, ofte ved omplassering gjennom en smal aksial pore39,40. Selv om det har vært lagt stor innsats for å studere utvinning av membranproteiner av AAA + ATPases, er rekonstitueringene komplekse eller involverer en blanding av lipider og vaskemiddel41,42, som begrenser den eksperimentelle kraften til å undersøke mekanismen for substratutvinning fra lipidbilayeren.

Msp1 er en høyt bevart AAA + ATPase forankret i OMM og peroksisomer som spiller en kritisk rolle i membranproteostase ved å fjerne feilaliserte TA-proteiner43,44,45,46,47. Msp1 ble også nylig vist å lindre mitokondrieproteinimportstress ved å fjerne membranproteiner som stopper under translokasjon over OMM48. Tap av Msp1 eller den menneskelige homologEN ATAD1 resulterer i mitokondriefragmentering, svikt i oksidativ fosforylering, anfall, økt skade etter hjerneslag og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.

Vi har vist at det er mulig å co-rekonstituere TA-proteiner med Msp1 og oppdage utvinningen fra lipidbilayeren57. Dette forenklede systemet bruker fullt rensede proteiner rekonstituert i definerte liposomer som etterligner OMM (figur 1)58,59. Dette nivået av eksperimentell kontroll kan adressere detaljerte mekanistiske spørsmål om substratutvinning som er eksperimentelt intractable med mer komplekse rekonstitueringer som involverer andre AAA + proteiner. Her tilbyr vi eksperimentelle protokoller som beskriver våre metoder for liposompreparat, membranproteinrekonstituering og ekstraksjonsanalysen. Det er vårt håp at disse eksperimentelle detaljene vil lette videre studier av den essensielle, men dårlig forståtte prosessen med membranproteostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Liposom forberedelse

  1. Kombiner kloroformlagre av lipider i passende forhold for å etterligne den ytre mitokondriemembranen.
    1. Forbered 25 mg lipidblanding. Vi bruker en tidligere etablert blanding av lipider som etterligner mitokondriemembraner, bestående av en 48:28:10:10:4 molar forholdet mellom kyllingeggfosfatidyl kolin (PC), kyllingeggfosfatidyl etanolamin (PE), bovin leverfosfatidyl inositol (PI), syntetisk 1,2-dioleoyl--sn-glysero-3-fosfo-L-serin (DOPS) og syntetisk 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo]-glyserol (TOCL)58,59. Eksempelberegninger vises i Tabell 1.
    2. Ta alle lipidlagrene til romtemperatur før åpning, da dette vil begrense kondens. Siden de fleste laboratorier ikke har en presis måte å måle konsentrasjonen av lipidene, vil noe vann absorbert av kloroformbestanden endre konsentrasjonen av lipidbestanden og dermed forholdet mellom lipider som brukes i analysen.
    3. Når lipidlagre kommer i glassampler, overfør den nødvendige mengden lipid til et hetteglass med en 1 ml sprøyte. Tilsett 2 mg dithiothreitol (DTT) i hetteglasset for å forhindre lipidoksidasjon. Arbeid raskt som fordampning av kloroform vil endre konsentrasjonen av lipiden.
    4. Overfør eventuell gjenværende lipid til et separat hetteglass i glass og monter det med en PFTE septa. Tilsett 2 mg DTT i hetteglasset, pakk med parafilm og oppbevar ved -20 °C for å forhindre lipidoksidasjon. Prøv å bruke lipidene innen 3 måneder etter overføring til hetteglassene. For å forhindre potensiell kontaminering av kloroformlagrene ved markøravrenning, overfør klistremerkene fra de originale ampullene til hetteglassene i glass i stedet for etikett med markør.
  2. Fordamp kloroform under en svært skånsom strøm av nitrogen mens du spinner hetteglasset i glass kontinuerlig for hånd i en avtrekkshette, som i hovedsak fungerer som en manuell rotovap. Snurr hetteglasset med jevn hastighet (20-40 o/min) for hånd for å holde lipidene i bevegelse. Målet er å fordampe all kloroformen og få et jevnt belegg av lipider over hele hetteglasset i glass.
    FORSIKTIG: Kloroform er nevrotoksisk, og dette trinnet skal utføres i avtrekkshetten.
    1. Fest en fersk Pasteur pipette til nitrogenrøret. Ikke la noen av lipidene sprute ut av hetteglasset eller på Pasteur-pipetten. Sikt spissen på bunnen av hetteglasset slik at luften spretter av bunnen og skyver lipidene opp mot midten av hetteglasset. Få et jevnt belegg over hele hetteglasset samtidig som du unngår akkumulering i hjørnene eller ved hetten. Hele denne prosessen tar omtrent 5 minutter.
    2. Når blandingen tykner inn i en "perle" av lipider, kan du lede den inn i midten av hetteglasset ved å endre vinkelen på hetteglasset. Når perlen begynner å bli mindre, skru opp nitrogenstrømmen litt for å spre perlen, og sørg for at ingen av lipidene blåser ut av hetteglasset.
  3. Fjern eventuell gjenværende kloroform under vakuum.
    1. Sett hetteglasset i glass på en husvakuum- eller membranvakuumpumpe i 1 time for å fjerne mesteparten av gjenværende kloroform. Disse støvsugerne er generelt ikke sterke nok til å fjerne alle kloroformene, men de kan tolerere små mengder løsningsmiddel bedre enn roterende vakuum.
    2. Sett hetteglasset på et sterkt vakuum (<1 mTorr) i 12-16 timer for å fjerne all gjenværende kloroform. Pass på at du ikke støter på hetteglasset under denne prosessen.
  4. Resuspend lipidene i 1,25 ml liposombuffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15% glyserol, 1 mM DTT). Som vi startet med 25 mg lipider, resulterer dette i en konsentrasjon på 20 mg / ml. Resuspend lipidene helt uten synlige biter. Hvis lipidene samlet seg i hjørnet av hetteglasset, kan dette være en langvarig prosess.
    1. Virvel hetteglasset kraftig til prøven er melkeaktig glatt. Vi finner at hvis kloroformfordampning ble gjort riktig kvelden før, tar denne prosessen ca 5-10 minutter.
    2. For å sikre fullstendig resuspension av lipidene, roter på et hjul ved romtemperatur i 3 timer ved ~ 80 rpm. Fjern hetteglasset fra hjulet en gang i timen i 1 minutt med virveling for å sikre jevn blanding.
  5. Overfør lipider forsiktig til et rent 1,5 ml mikrosenterrør. Utfør 5 fryse-tine sykluser ved hjelp av flytende nitrogen for å fryse og en 30 °C varmeblokk for å tine. Dette trinnet bidrar til å konvertere multilamellar vesicles til unilamellar vesicles.
  6. Ekstruder lipidene.
    1. Under fryse tining sykluser, forberede mini-ekstruderen. Monter miniekstruderen med 10 mm filterstøtter og en polykarbonatmembran av ønsket porestørrelse (vi bruker 200 nm). Størrelsen på filteret vil påvirke størrelsen på liposomet, noe som vil påvirke konsentrasjonen av proteiner som kreves for rekonstituering (Trinn 2.3).
    2. Plasser miniekstruderen på en varm plate og ta med ekstrudertemperaturen opp til 60 °C.
    3. Trekk lipidene opp i en 1 ml gasstett glasssprøyte og legg dem forsiktig i den ene enden av miniekstruderen. Plasser den tomme gasstette sprøyten i den andre siden av miniekstruderen. La lipidene likevekte til ekstruderstativtemperaturen i 5-10 minutter.
    4. Overfør lipidene til den alternative sprøyten ved å skyve stempelet på den fylte sprøyten forsiktig. Skyv oppløsningen fra den alternative sprøyten inn i den originale sprøyten. Gjenta denne frem og tilbake-prosessen 15 ganger, slik at lipidene ender i den alternative sprøyten ved 15-tiden. Overvåk volumet i hvert pass for å sikre at det ikke er noen lekkasjer.
  7. Forbered engangs aliquots av lipidene, blitsfrysing i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C. Liposomene er stabile ved -80 °C i flere måneder. Rekonstitueringene krever 10 μL liposomer om gangen (Trinn 2.3.4), så det er praktisk å forberede 10 μL eller 20 μL aliquots.

2 Rekonstituering av Msp1 og Model TA protein

  1. Forbered rekonstitueringsbufferen: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM kaliumacetat, 7 mM magnesiumacetat, 2 mM DTT, 10 % sukrose, 0,01 % natriumazid, 0,2-0,8 % deoksy big chaps (DBC).
    1. Optimaliser rekonstitueringsbetingelser for den nye batchen av liposomer. Konsentrasjonen av DBC og biober som kreves for optimal rekonstituering varierer avhengig av batchen av liposomer som brukes. Hvis du vil begrense klargjøringen til klargjøringsvariabiliteten, bruker du samme mengde DBC for alle eksperimenter. Når du endrer mye DBC, gjenta optimaliseringsprosessen.
    2. Sett opp en rekke rekonstitueringer med forskjellige konsentrasjoner av DBC (0,2% - 0,8%) og biober (25 mg - 100 mg) hver gang en ny batch liposomer er forberedt. Det er viktig å ikke slippe DBC under den kritiske micellekonsentrasjonen (CMC) på ~ 0,12%. Når forholdene er optimalisert, anbefaler vi at du samler inn alle data ved hjelp av samme liposomeforberedelse og rekonstitueringsforhold.
    3. Analyser effektiviteten av de ulike rekonstitueringsbetingelsene ved å bruke ekstraksjonsanalysen som er beskrevet i trinn 3.
  2. Forbered biober ved en endelig konsentrasjon på 250 mg / ml.
    1. Vei ut 2,7 g tørkede biober og resuspend i et 50 ml sentrifugerør på 100% metanol (ca. 45 ml) for å våte perlene. I utgangspunktet våt biobeadene i metanol for å forhindre at luft blir fanget i perlenes porer. En gang i metanol, hold biobeadene våte, da all luft fanget av biobeadene vil endre deres evne til å absorbere vaskemiddel.
    2. Fjern metanol ved å vaske perlene 8x med ca 45 ml ultrapure vann (18,2 mΩ), heretter referert til som ddH2O. Pellet perler ved å spinne på 3200 x g i 1 minutt. Dekanter væsken og resuspend i ddH2O.
    3. Etter vask, resuspend i 10 ml ddH2O med 0,02% natriumazid og oppbevar ved 4 °C. Biober kan lagres ved 4 °C i flere måneder. Denne bestanden er 250 mg / ml, da det antas ~ 0,2 g går tapt under vasketrinnene.
  3. Beregn størrelsen på liposomet og ønsket antall molekyler av TA-protein og Msp1 per liposom. Dette vil bestemme konsentrasjonen av Msp1 og TA protein som kreves for rekonstituering.
    1. Først beregner du antall lipidmolekyler per unilamellar liposom (Ntotalt) ved hjelp av ligningen Equation 1 der d er liposomets diameter, h er tykkelsen på bilayeren, og a er lipidhodegruppeområdet.
      1. Mål liposomediameteren med DLS. I vårt eksempel ble det oppnådd en verdi på 70 nm for liposomdiameteren (d).
      2. Bruk en verdi på 5 nm for t og 0,71 nm2 for a, som er hodegruppestørrelsen for fosfatidylkolin. I denne spesielle situasjonen er Ntotalt 37.610.
    2. Deretter beregner du molarkonsentrasjonen av lipid MLipid ved hjelp av den gjennomsnittlige molekylvekten til lipidene i blandingen. I dette eksemplet er konsentrasjonen av lipider 20 mg/ml (trinn 1,4) og gjennomsnittlig molekylvekt på lipider er 810 g/mol (Tabell 1). Dette resulterer i en verdi på 0,0247 M for MLipid.
    3. Deretter beregner du molarkonsentrasjonen av liposomer, MLiposome, ved hjelp av ligningen Equation 2 der M Lipid er molarkonsentrasjonen av lipid fra trinn 2.3.2, og Ntotalt er det totale antallet lipider per liposom beregnet i trinn 2.3.1. I dette eksemplet er 20 mg / ml lagerkonsentrasjonen av liposomer ca. 660 nM.
    4. Beregn mengden Msp1- og TA-protein som kreves for en 100 μL rekonstitueringsreaksjon.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av lipider i rekonstitueringen er 2 mg/ml, som er en 10x fortynning av liposomet. Dette gir en endelig liposomkonsentrasjon på 66 nM. Den endelige konsentrasjonen av Msp1 er 792 nM, som gir et gjennomsnitt på 12 totale kopier (2 funksjonelle heksamere) per liposom. Den endelige konsentrasjonen av TA-protein er 660 nM, noe som gir et gjennomsnitt på 10 eksemplarer per liposom.
  4. Bland sammen renset Msp1, TA-protein og liposomer i rekonstitueringsbuffer i et PCR-rør. Rekkefølgen på tilsetningen er buffer, proteiner og liposomer varer. Det totale volumet er 100 μL. La blandingen sitte på is i 10 minutter. Rens Msp1- og TA-proteinet som tidligere beskrevet57.
    1. Bruk den godt karakteriserte modellen TA protein His-Flag-Sumo-Sec22 som et positivt kontrollsubstrat når du først etablerer analysen. Denne konstruksjonen har en His-tag for enkel rensing, 3x-Flag tag for deteksjon av vestlig blot, et Sumo-domene for økt løselighet, og TMD av ER-TA-proteinet Sec22 for rekonstituering og anerkjennelse av Msp1.
    2. Forsikre deg om at lagerløsninger av både Msp1 og TA-proteinet er ca. 100 μM for å minimere effekten av N-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) fra proteinrensingen på rekonstitueringen. Renset Msp1 er i 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM natriumklorid, 0,1 mM Tris(2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid (TCEP), 0,05% DDM mens det rensede TA-proteinet er i 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid, 10 mM magnesiumklorid, 5 mM β-mercaptoetanol, 10% glyserol, 0,1% DDM. Lagerløsninger på ca. 100 μM TA-protein og Msp1 monomer sikrer at disse komponentene vil utgjøre < 5% av det endelige rekonstitueringsvolumet, noe som resulterer i en fortynning av DDM under CMC.
  5. Tilsett ønsket mengde biober i prøven for å fjerne vaskemiddel.
    1. Klipp spissen av en p200 pipettespiss til ca.1/8 tomme i diameter slik at perler kan passe gjennom spissen. Vortex biobeads røret grundig for å oppnå en jevn blanding og raskt fjerne lokket og pipette opp volumet før biobeadene legger seg. Overfør biobeadene til et tomt PCR-rør.
    2. Når rekonstitueringen er ferdig med sin 10-minutters inkubasjon på is, bruk en uklippet pipettespiss for å fjerne all væsken fra biobeadene. Overfør deretter 100 μL rekonstituering inn i røret med biobeadene. Dette må gjøres raskt slik at biobeadene ikke fanger luft, noe som vil føre til at perlene flyter.
  6. La rekonstitueringen rotere på et hjul ved ~80 o/min i 16 timer ved 4 °C.
  7. Fjern rekonstituert materiale fra biober. Gjør et raskt spinn i en picofuge for å pellet biobeadene, og bruk deretter en uklippet pipetspiss for å overføre det rekonstituerte materialet til et rent PCR-rør. Gjenta denne prosessen 1-2 ganger til det ikke er noen biober igjen i prøven. Hold rekonstituering på is.
  8. Forhåndsklarer det rekonstituerte materialet for å fjerne proteiner som ikke klarte å rekonstituere i liposomene.
    1. Klargjør ekstraksjonsbuffer: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM kaliumacetat, 7 mM magnesiumacetat, 2 mM DTT, 100 nM kalsiumklorid.
    2. Likevekt glutathione spinn kolonner med Extraction Buffer i henhold til produsentens retninger. Dette innebærer vanligvis 3-runders vasking med 400 μL buffer og deretter sentrifugering ved 700 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å fjerne bufferen.
    3. Tilsett 5 μM av hver anstand (GST-SGTA og GST-Calmodulin) i det rekonstituerte materialet. Disse anstandene vil binde seg til TMD av proteiner som ikke klarte å rekonstituere inn i liposomene. Rensing av anstander ble beskrevet tidligere6,57.
      MERK: Disse anstandene er kommersielt tilgjengelige, men vi foretrekker å rense internt for å kontrollere for kostnad og kvalitet. Begge proteinene er i 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM natriumklorid og 0,1 mM TCEP, og har en lagerkonsentrasjon rundt 160 μM. SGTA gjenkjenner substrater med en svært hydrofob TMD mens Calmodulin binder TMDer med moderat hydrofobitet6,29. Sammen kan denne anstandscocktailen gjenkjenne et bredt spekter av substrater.
    4. Tilsett 100 μL ekstraksjonsbuffer til det rekonstituerte materialet, og bringer volumet opp til 200 μL. Legg dette til de likevektede glutathione-spinnkolonnene. Vær oppmerksom på at glutathione-spinnkolonnene gir den høyeste prøvegjenopprettingen når forhåndsavregningsvolumet er 200 - 400 μL.
    5. Koble til spinnkolonnene og roter ved ~ 80 rpm ved 4 °C i 30 minutter slik at anstander kan binde seg til harpiks.
    6. Snurr kolonnene på 700 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Gjennomstrømningen er forhåndsklarert materiale som er utarmet av aggregerte proteiner. Hold materialet på is og fortsett direkte med ekstraksjonsanalyse.

3. Ekstraksjonsanalyse

  1. Klargjør rør for SDS PAGE-analyse. Hver reaksjon vil ha 4 rør: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) og ELUTE (E).
    1. Tilsett 45 μL ddH2O-prøve i INPUT-røret, 40 μL ddH2O i FLOW THROUGH-røret og 0 μL til WASH- og ELUTE-rørene.
      MERK: Det beste signal-til-støy-forholdet i denne analysen oppnås når WASH- og ELUTE-prøvene er 5x konsentrert i forhold til INPUT- og FLOW THROUGH-prøvene. På grunn av fortynningene under analysen, krever dette å ta 5 μL prøve for INPUT-prøven, 10 μL prøve for FLOW THROUGH-prøven og 50 μL prøve for WASH- og ELUTE-prøvene.
    2. Tilsett 16,6 μL 4x SDS PAGE-lastebuffer i hvert rør. Det totale volumet for hver prøve er 50 μL før SDS PAGE Loading Buffer. Det endelige volumet er 66,6 μL (50 μL prøve + 16,6 μL 4x SDS PAGE-lastebuffer).
  2. Monter ekstraksjonsanalysen.
    1. Forbered ekstraksjonsreaksjonen som inneholder 60 μL forhåndsklarerte proteoliposomer, 5 μM GST-SGTA, 5 μM GST-Calmodulin og 2 mM ATP. Kombiner alle reagenser unntatt ATP, som brukes til å initiere reaksjonen. Ta med til et endelig volum på 200 μL med ekstraksjonsbuffer.
      MERK: Ettersom 60 μL prøve brukes til hver ekstraksjonsanalyse, kan en rekonstituering brukes til tre forskjellige ekstraksjonsanalyser. Utfør positive og negative kontroller (+ATP og -ATP) på materiale fra samme rekonstituering.
    2. Forvarm ekstraksjonsanalyse i 30 °C varmeblokk i 2 minutter.
  3. Start ekstraksjonsanalysen ved å legge ATP til endelig konsentrasjon på 2 mM og start timer.
    1. Gi et 5 sekunders spinn i en picofuge for å blande ATP inn i reaksjonen. Inkuber reaksjonen ved 30 °C i 30 minutter.
    2. Under inkubasjonen, ta 5 μL av reaksjonen og legg til INPUT-røret. Tidspunktet for dette er fleksibelt.
    3. I løpet av denne inkubasjonsperioden likevekter du en glutathione spinnkolonne for hver prøve i ekstraksjonsanalysen.
  4. Utfør trekk ned på anstander for å isolere ekstrahert materiale.
    1. Når den 30-minutters inkubasjonen er ferdig, tilsett 200 μl ekstraksjonsbuffer til røret for å bringe totalt volum til 400 μL. Legg til likevektet glutathioneharpiks og la det binde seg på hjulet ved 4 ° C i 30 minutter.
    2. Snurr kolonnene på 700 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å samle gjennom gjennomstrømningen. Ta 10 μL for FLOW THROUGH-røret. Denne prøven inneholder substrater som fortsatt er integrert i lipidbilayeren.
    3. Vask harpiks to ganger med 400 μL ekstraksjonsbuffer, og kast gjennom strømmen. På den tredje vasken, hold gjennomstrømningen og ta 50 μL for WASH-røret.
    4. Forbered 5 ml elutionbuffer ved å tilsette redusert glutathione til en endelig konsentrasjon på 5 mM i ekstraksjonsbuffer. Forbered denne bufferen frisk hver gang.
    5. Legg til 200 μL Elution Buffer i spinnkolonnen. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Spinn på 700 x g i 2 minutter ved romtemperatur for å unnslippe. Hold flyten gjennom. Gjenta prosessen en gang til slik at det totale elutionvolumet er 400 μL.
    6. Ta 50 μL prøve fra Elution-prøven og legg den til ELUTE-røret.
  5. Analyser utvinningsaktivitet ved hjelp av SDS-PAGE og vestlig flekk.
    MERK: Siden en vestlig blot er en ganske standard prosedyre, er det gitt en grunnleggende protokoll som fremhever noen få av detaljene som er unike for denne analysen.
    1. Legg prøver i en flekkfri polyakrylamidgel (4 % stabling, 15 % separasjon) og kjør ved 200 V i 50 minutter i Tris-glycinbuffer. Hvis plass tillater det, bruk både en ubegrunnet og farget stige for å tillate visualisering på henholdsvis flekkfri gele imager og overføring til PVDF-membran. Den flekkfrie gelen tillater kvantitativ visualisering av tryptofan som inneholder proteiner ved aktivering med ultrafiolett lys, samtidig som gelen kan brukes til en vestlig blott.
    2. Bilde den flekkfrie gelen for å bekrefte at det er lik lasting på tvers av alle prøver. Dette er en viktig kontroll som sikrer at eventuelle endringer i signal oppdaget av vestlig blot ikke er et resultat av variabel proteinbelastning. Det skal bare være synlige bånd for anstandene (GST-calmodulin og GST-SGTA) i INPUT- og ELUTION-prøvene. Husk at ELUTE-prøven vil være mer konsentrert enn INPUT-prøven.
    3. Monter en vestlig flekkkassett ved hjelp av en PVDF-membran på 45 μm. Overføring med en konstant strøm på 300 mA i 60 minutter.
    4. Etter å ha blokkert membranen, bind til det primære antistoffet i 16 timer ved 4 °C med skånsom risting ~15 o/min. Blot for substrat med kanin Anti-FLAG på en 1:1,000 fortynning.
      MERK: De primære og sekundære antistoffene som brukes vil være substratspesifikke, og konsentrasjonen for bruk må kanskje optimaliseres.
    5. Vask membran og inkuber med sekundært antistoff, geit anti-kanin ved en 1:10.000 fortynning, med mild risting i 1 time ved romtemperatur.
    6. Vask membran og bilde for analyse ved hjelp av vestlig blotting deteksjonsmiddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å tolke resultatene riktig, må den flekkfrie gelen og den vestlige blot ses sammen. Den flekkfrie gelen sikrer lik lasting på tvers av alle prøver. Når du ser på den flekkfrie gelen, vil anstandene (GST-calmodulin og GST-SGTA) være synlige i INNGANGS- (I) og ELUTE (E)-banene. Dobbeltsjekk at intensiteten til disse båndene er jevn på tvers av alle INPUT-prøvene. På samme måte må du sørge for at intensiteten er jevn på tvers av ELUTE-prøvene. ELUTE er 5x mer konsentrert enn INPUT, og denne forskjellen i intensitet vil være synlig i gelene.

Etter å ha brukt flekkfri gel for å bekrefte riktig lasting, undersøk den vestlige bloloten for å bestemme utvinningsaktiviteten. Mål utvinningsaktiviteten ved å sammenligne mengden substrat i ELUTE (E)-brøken i forhold til INPUT (I)-brøken. Signalet i Flow Through (FT) viser en viss variasjon, men ligner vanligvis på INPUT-brøken. Det skal ikke være noe signal i WASH (W)-fraksjonen. Vanligvis er det ~ 10% utvinning effektivitet for positiv kontroll og 1-2% utvinning effektivitet i negativ kontroll (Figur 2). Husk at ELUTE-fraksjonen er 5x så intens som INPUT-fraksjonen, så dette må tas i betraktning når du dømmer utvinningseffektivitet. Hvis rekonstitueringsbetingelsene ikke optimaliseres, er det vanligvis sammenlignbare utvinningsnivåer i både + ATP- og - ATP-utvalgene (figur 3). Dette resultatet tilskrives en svikt i Msp1 for effektivt å rekonstituere, noe som resulterer i mange proteoliposomer uten en funksjonell Msp1 hexamer.

Lipid Mole % MW Gj.snittlig MW μmol i 25 mg mg i 25 mg Klor lager (mg/ml) μL i 25 mg
PC 48% 770 369.6 14.82 11.41 25 456.4
PE 28% 746 208.88 8.64 6.45 25 258.0
PI 10% 902 90.2 3.09 2.78 10 278.5
DOPS 10% 810 81 3.09 2.50 10 250.1
TILCL 4% 1502 60.08 1.23 1.85 25 74.2
Kons. corr gj.snittlig MW 809.76
μmol i 25 mg 30.87

Tabell 1: Prøveberegninger for liposompreparat. Hovedmålene med denne tabellen er å beregne konsentrasjonen korrigert gjennomsnittlig molekylvekt av lipidblandingen og volumet av hver lipidbestand som kreves for å lage liposomer. MW og lagerkonsentrasjon kommer fra produktetiketter. Lipider og mole % velges av brukeren.

Figure 1
Figur 1: Tegneserie for ekstraksjonsanalyse og liste over viktige trinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative data som viser en fungerende analyse. Utvinningseffektivitet bestemmes ved å sammenligne mengden substrat i ELUTE-fraksjonen med INPUT-fraksjonen. Husk at gelen har 5x høyere lasting av ELUTE-fraksjonen i forhold til INPUT-fraksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative data for en mislykket rekonstituerings- og utvinningsanalyse. Her er aktiviteten i + ATP-eksemplet sammenlignbar med aktiviteten i - ATP-eksemplet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Riktig mitokondriefunksjon avhenger av et robust proteinkvalitetskontrollsystem. På grunn av iboende grenser i gjengivelsen av TA-proteinmålrettingsveiene, er feillokaliserte TA-proteiner en konstant kilde til stress for mitokondrier. En nøkkelkomponent i mitokondrieproteostasenettverket er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase som fjerner feillokaliserte TA-proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet hvordan du lager proteoliposomer, korekonstituerer Msp1 og et modell TA-protein, og utfører en ekstraksjonsanalyse. Vi har tidligere brukt denne analysen til å demonstrere at Msp1 direkte gjenkjenner feillokaliserte TA-proteiner og er i stand til å trekke ut disse proteinene fra en lipidbilayer uten tilbehørsproteiner eller kofaktorer57.

En ulempe med analysen er at det er en viss variasjon i rekonstitueringsprosessen. For å kontrollere for prep-to-prep variabilitet, inkluderer vi alltid en positiv og negativ kontroll på samme gel / western blot for å sikre at analysen vår fungerer som den skal. Vi unngår å gjøre sammenligninger mellom rekonstitueringer som ble gjort på forskjellige dager eller tegningssammenligninger mellom forskjellige vestlige flekker. De eneste sammenligningene vi gjør er for prøver rekonstituert parallelt og kjører på samme gel / vestlige blot. Vi er også ganske konservative i vår datatolkning. Selv om det er mulig å kvantifisere utvinningseffektivitet ved hjelp av ImageJ, beskriver vi vanligvis eksperimentene våre som å ha full aktivitet, mellomaktivitet eller ingen aktivitet.

En kilde til variasjon er den totale mengden protein rekonstituert. Mens flertallet av ikke-korporerte proteiner fjernes av forryddingsprosessen, kan den mindre enn perfekte rekonstitueringseffektiviteten til Msp1 ha en outsized effekt på den observerte effektiviteten av substratutvinning. Denne effekten oppstår fra det faktum at Msp1 fungerer som en homohexamer, men renser som en monomer57. Liposomer som inneholder noe annet enn 6x kopier av Msp1 vil være inaktive. For eksempel vil et liposom med bare 5 kopier av Msp1 være inaktivt. Den eneste måten å danne stabile msp1-heksamere i full lengde er å inaktivere ATPase-aktivitet med ikke-hydrolyserbare ATP-analoger (ATPγS) eller den inaktiverende E193Q Walker B-mutanten, som ingen av dem er kompatible med en aktivitetsanalyse. Å overvinne dette tekniske hinderet er et område med aktiv forskning i laboratoriet vårt.

Et annet område med aktiv forskning fokuserer på å gjøre utvinningsanalysen mer kvantitativ. Den nåværende metoden er avhengig av pull downs og vestlig blotting for signaldeteksjon, som begge bare er semi-kvantitative og viser analyse for å analysevariabilitet. Kovalente modifikasjoner av ekstraherte substrater ville eliminere variasjonen som oppstår fra nedtrekkene. På samme måte vil bruk av radioaktive eller fluorescerende etiketter på substrater eliminere behovet for vestlige flekker og tilhørende variasjon.

En stor styrke ved analysen er at systemet er fullstendig definert. Membranproteinene er rekombinant uttrykt og renset, og det er mulig å lage definerte mutanter i både Msp1 og substratet for å studere spesifikke aspekter av reaksjonen. Lipidmiljøets rolle i proteostase har i stor grad blitt ignorert på grunn av de tekniske utfordringene ved å studere dette på en detaljert måte. Fordi analysen vår bruker liposomer med en definert lipidsammensetning, gir dette full eksperimentell kontroll over lipidmiljøet. Vi kan enkelt modulere faktorer som: lipidvæske, bilayertykkelse, hodegruppeidentitet og liposomestørrelse. Vi jobber aktivt med å bruke analysen vår til å undersøke lipidmiljøets rolle på Msp1-aktiviteten. Det er vårt håp at in vitro rekonstituering og ekstraksjonsanalyse beskrevet her kan tjene som et forenklet modellsystem for å studere den vanlige cellulære prosessen med AAA + ATPase mediert utvinning av membranproteiner fra en lipid bilayer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

MLW utviklet en del av denne protokollen under sine postdoktorstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.

Dette arbeidet er finansiert av NIH grant 1R35GM137904-01 til MLW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, New York, N.Y. (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, New York, NY. 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, Copenhagen, Denmark. 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, New York, NY. 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, Copenhagen, Denmark. 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, New York, NY. 3099 (2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR - a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, New York, NY. (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Tags

Biokjemi utgave 174
Rekonstituering av msp1-ekstraksjonsaktivitet med fullstendig rensede komponenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fresenius, H. L., Wohlever, M. L.… More

Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter