Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

माउस में डिम्बग्रंथि रिजर्व के विकासशील डिम्बग्रंथि रिजर्व के मात्रात्मक 3 डी विश्लेषण के लिए पूरे अंडाशय Immunofluorescence, समाशोधन, और Multiphoton माइक्रोस्कोपी

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

यहां, हम पूरे-माउंट इम्युनोस्टेनिंग, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी और 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण का उपयोग करके मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए पूरे अंडाशय की इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल उच्च-थ्रूपुट, विश्वसनीय और दोहराने योग्य प्रसंस्करण को समायोजित करता है जो विष विज्ञान, नैदानिक निदान और डिम्बग्रंथि समारोह के जीनोमिक assays के लिए लागू होता है।

Abstract

महिला प्रजनन क्षमता और प्रजनन जीवनकाल डिम्बग्रंथि ओसाइट रिजर्व की गुणवत्ता और मात्रा पर निर्भर करता है। Meiotic prophase मैं प्रवेश महिला रोगाणु कोशिकाओं का एक अनुमान 80% भ्रूण ओसाइट एट्रिशन (एफओए) और प्रसवोत्तर जीवन के पहले सप्ताह के दौरान समाप्त कर रहे हैं। तीन प्रमुख तंत्र विकास के दौरान जीवित रहने वाले ओसाइटों की संख्या को विनियमित करते हैं और यौवन में प्रवेश करने वाली महिलाओं में डिम्बग्रंथि रिजर्व स्थापित करते हैं। ओसाइट हानि की पहली लहर में, प्रारंभिक एफओए के दौरान 30-50% ओसाइट को समाप्त कर दिया जाता है, एक ऐसी घटना जिसे उच्च लंबे समय तक अंतर्निहित परमाणु तत्व -1 (LINE-1) अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। ओसाइट हानि की दूसरी लहर एक अर्धसूत्रीविभाजन जांच चौकी द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन दोषों के साथ ओसाइटों का उन्मूलन है। ओसाइट हानि की तीसरी लहर आदिम कूप गठन के दौरान प्रसवकालीन रूप से होती है जब कुछ ओसाइट रोम बनाने में विफल रहते हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि ओसाइट हानि की इन तीन तरंगों में से प्रत्येक को क्या नियंत्रित करता है और वे चूहों या मनुष्यों में डिम्बग्रंथि रिजर्व को कैसे आकार देते हैं।

Immunofluorescence और 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन ने कम जानकारीपूर्ण 2 डी वर्गों के बजाय पूरे अंडाशय के संदर्भ में ओसाइट विकास की छवि और विश्लेषण करने के लिए एक नया एवेन्यू खोला है। यह लेख पूरे अंडाशय immunostaining और ऑप्टिकल समाशोधन के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी और 3 डी मॉडलिंग का उपयोग करके इमेजिंग के लिए तैयारी करता है। यह दिखाता है कि इस विधि का उपयोग C57BL / 6J चूहों में डिम्बग्रंथि के विकास के दौरान ओसाइट एट्रिशन की गतिशीलता को दिखाने के लिए कैसे किया जा सकता है और ओसाइट उन्मूलन की तीन तरंगों के दौरान ओसाइट हानि को निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को ओसाइट विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण के साथ-साथ अन्य मात्रात्मक दृष्टिकोणों के लिए प्रसवपूर्व और प्रारंभिक प्रसवोत्तर अंडाशय पर लागू किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, प्रोटोकॉल को रणनीतिक रूप से उच्च-थ्रूपुट, विश्वसनीय और दोहराने योग्य प्रसंस्करण को समायोजित करने के लिए विकसित किया गया था जो विष विज्ञान, नैदानिक निदान और डिम्बग्रंथि समारोह के जीनोमिक assays में आवश्यकताओं को पूरा कर सकता है।

Introduction

अधिकांश स्तनधारी मादाएं आदिम रोम के भीतर संग्रहीत अर्धसूत्रीविभाजनित रूप से गिरफ्तार ओसाइट्स की एक सीमित संख्या के साथ पैदा होती हैं, जो डिम्बग्रंथि रिजर्व (OR)1,2 का गठन करती हैं। OR समग्र महिला प्रजनन जीवनकाल और स्वास्थ्य3 निर्धारित करता है। OR आमतौर पर उम्र बढ़ने के साथ आकार में गिरावट आती है और कुछ genotoxic एजेंटों (विकिरण / कीमोथेरेपी) और पर्यावरणीय तनाव (कुपोषण) के संपर्क में आने पर समय से पहले समाप्त हो सकती है, जिससे बांझपन 4,5,6 हो सकता है। अज्ञातहेतुक महिला बांझपन को अक्सर ओआर से विकसित होने वाले अंडे की आनुवंशिक और शारीरिक गुणवत्ता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है और खराब रूप से समझा जाताहै 7,8। क्योंकि महिला कूप बंदोबस्ती काफी हद तक जन्म से पूर्व निर्धारित है, इसलिए ओआर स्थापना और रखरखाव में शामिल नियामक तंत्र को समझना आवश्यक है।

चूहों में, या गठन भ्रूण दिवस (ई) 7.5 2 के आसपास आदिम रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) के विनिर्देश के साथ शुरू होताहै। PGCs जननांग लकीरें, जहां वे लगभग E10.59 द्वारा निवास करेंगे करने के लिए माइग्रेट। निम्नलिखित व्यापक प्रसार अपूर्ण साइटोकिनेसिस के साथ होता है जिसके परिणामस्वरूप अल्सर का गठन होता है जो बाद में विकास10,11 में टूट जाएगा। लगभग E12.5 पर, गोनाडल सेक्स निर्धारित किया जाता है, और पीजीसी प्रसार अंडाशय में रुक जाता है। महिलाओं में, PGCs, अब ocytes, लगभग E13.512,13 पर meiotic prophase I (MPI) दर्ज करें। विस्तारित एमपीआई के माध्यम से ओसाइट प्रगति करते हैं और जन्म के समय के आसपास डिक्टिएट चरण में गिरफ्तारी करते हैं। जन्म के बाद पहले सप्ताह के दौरान, प्रत्येक गिरफ्तार ओसाइट ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से घिरा होता है, जिससे एक आदिम कूप बनता है।

एक महिला के OR में आदिम follicles की संख्या इस बात पर निर्भर करती है कि एपोप्टोसिस, ऑटोफैगी, या नेक्रोसिस14,15 के माध्यम से एमपीआई गिरफ्तारी से पहले और दौरान होने वाली ओसाइट उन्मूलन की तरंगों से कितने ओसाइट बच गए। पहली लहर भ्रूण के विकास के दौरान होती है और इसे एफओए के रूप में जाना जाता है। एफओए मादाओं (स्तनधारी और गैर-स्तनधारी) में एक विकासवादी रूप से संरक्षित प्रक्रिया है, जिससे अनुमानित 50-80% ओसाइटों को मादा प्रजातियों 16,17,18,19 के आधार पर समाप्त कर दिया जाता है। चूहों में, FOA E15.5 से E18.5 के दौरान होता है और इसे रेट्रोट्रांसपोसन LINE-1 अनुक्रमों के पुनर्सक्रियन और अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है जिससे20,21 की मृत्यु हो जाती है। ओसाइट उन्मूलन की दूसरी लहर एक अर्धसूत्रीविभाजन चेकपॉइंट के माध्यम से होती है जो अर्धसूत्रीविभाजन के साथ ओसाइट को समाप्त करती है जैसे कि अनपेयर्ड डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) 22,23। ओसाइट उन्मूलन की अगली लहर पुटी टूटने के दौरान होती है, जो आदिम रोम के गठन के दौरान समाप्त होती है, जिनमें से प्रत्येक में एक एकल ओसाइट10,11,24,25 होता है।

चूहों में, आदिम कूप रिजर्व काफी हद तक यौवन द्वारा स्थापित किया जाता है, जिसके बाद यह कम हो जाता है क्योंकि नियमित प्रजनन चक्र के दौरान विकास के लिए आदिम रोम सक्रिय होते हैं। OR आकार व्यक्तिगत महिलाओं के बीच और चूहों के विभिन्न आनुवंशिक उपभेदों के बीच भिन्न होता है; फिर भी, या आकार के आनुवंशिक विनियमन को अच्छी तरह से 26,27,28,29 नहीं समझा गया है। या विनियमन के आनुवांशिक अध्ययन ों को प्रसवपूर्व और प्रसवोत्तर विकास के दौरान ओसाइट उन्मूलन की तरंगों का अध्ययन करने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी से बाधित किया जाता है। चूहों में कई ओसाइट परिमाणीकरण के तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें सबसे आम और व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है हिस्टोलॉजिकल वर्गों30,31 के हिस्टोमोर्फोमेट्रिक मूल्यांकन। इस तकनीक में, हिस्टोलॉजिकल दाग के साथ सीरियल वर्गों पर ओसाइटों की पहचान की जाती है, जैसे कि हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) और आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) या फ्लोरोसेंट मार्कर। यह तकनीक विश्वसनीय है यदि सभी स्थितियां स्थिर रहती हैं, जिसमें अनुभाग मोटाई, अंडाशय में सभी वर्गों की कुशल वसूली और व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं की गिनती की योजनाएं शामिल हैं। हालांकि, विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा रिपोर्ट की गई संख्याएं अक्सर काफी भिन्न होती हैं और इस प्रकार आसानी से तुलनीय नहीं होती हैं।

इसके अलावा, आनुवांशिक अंतर को देखते हुए, विभिन्न माउस उपभेदों का उपयोग भी ओसाइट गिनती को प्रभावित कर सकता है। हिस्टोमोर्फोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए अतिरिक्त कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं और इसमें फ्रैक्शनेटर दृष्टिकोण का उपयोग करके ओसाइटों का स्वचालित पता लगाना, कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम का उपयोग करके स्वचालित गणना, और एक ही ओसाइट 31,32,33,34,35,36 की कई गिनती को रोकने के लिए हिस्टोलॉजिकल छवियों का 3 डी पुनर्निर्माण शामिल है। . हिस्टोमोर्फोमेट्रिक मूल्यांकन में इन सुधारों को जोड़ने के साथ भी, तकनीक अपेक्षाकृत श्रम-गहन है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर और उच्च-थ्रूपुट अध्ययनों के लिए। एकत्र किए गए डेटा गणना योजनाओं, कंप्यूटर एल्गोरिदम और उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर में अंतर के कारण अध्ययनों के बीच पुनरुत्पादक और तुलनीय नहीं हो सकते हैं।

हाल ही में, नए मध्यम-रिज़ॉल्यूशन मल्टीफोटॉन और लाइट शीट माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल ऊतक समाशोधन विधियों के विकास से त्वरित, बरकरार अंडाशय के लिए 3 डी मॉडलिंग और विश्लेषण तकनीकें ओसाइट संख्याओं को कुशलतापूर्वक मापने और प्रोटीन स्थानीयकरण और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए पसंद की विधि बन रही हैं37,38। ये 3 डी विधियां आमतौर पर हिस्टोलॉजिकल विधियों की तुलना में फायदेमंद होती हैं क्योंकि ऊतकों और अंगों को बेहतर ढंग से संरक्षित किया जाता है और बरकरार रखा जाता है। इसके अलावा, 3 डी विश्लेषण और मॉडलिंग अंग के भीतर और उसके भीतर सेल niches या substructures के बीच समारोह और इंटरैक्शन में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो 2 डी विश्लेषण में याद किया जा सकता है।

पूरे अंगों के 3 डी विश्लेषण के लिए ऊतक विरूपण या क्षति के बिना, अंडाशय जैसे व्यक्तिगत अंगों के लिए निर्धारण, इम्यूनोस्टेनिंग और ऑप्टिकल क्लियरिंग प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इमेजिंग के लिए नमूना बढ़ते का अतिरिक्त अनुकूलन उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है और उपलब्ध इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म पर निर्भर हो सकता है। अंत में, पूरे बरकरार अंडाशय की इमेजिंग बाद के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए बड़ी मात्रा में डेटा उत्पन्न करती है। इसलिए, तुलनात्मक अध्ययन के लिए और विकास के चरणों में ओसाइटों की गिनती के लिए मानकीकृत 3 डी विधियों को विकसित करने की आवश्यकता है।

यह प्रोटोकॉल मानक इम्यूनोस्टेनिंग और पहले रिपोर्ट किए गए समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, जो एक सरल, उपयोगकर्ता के अनुकूल और उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण 38,39,40,41 पर ध्यान केंद्रित करता है। प्रोटोकॉल को प्रसवोत्तर दिन 28 (पी 28) तक बड़ी संख्या में प्रसवपूर्व और प्रसवोत्तर अंडाशय और विभिन्न माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि से अंडाशय के अलग-अलग आकारों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इम्यूनोस्टेनिंग चरण सभी चरणों के लिए समान हैं; हालांकि, समाशोधन प्रोटोकॉल अपने बड़े आकार के कारण प्यूबर्टल अंडाशय के लिए भिन्न होते हैं, स्केलएस 4 (0) और छोटे और बड़े अंडाशय के लिए क्यूबिक, क्रमशः40,41। इसके अलावा, रक्त कोशिकाओं से ऑटोफ्लोरेसेंस को रोकने के लिए निर्धारण से पहले P28 चूहों में पूरे शरीर परफ्यूजन का प्रदर्शन किया जाता है। छवियों को प्राप्त करने के लिए लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के विकल्प के रूप में Leica DIVE /4Tune प्लेटफ़ॉर्म पर एक मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप बनाया गया था, और इस प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक उपकरणों के साथ IMARIS 3D विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को चुना गया था। यह प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए सरल है और कम हाथों पर है, इसलिए समय की बचत। इसके अलावा, अंडाशय के आकार और ओसाइट की व्यवस्था के आधार पर ओसाइट परिमाणीकरण अपेक्षाकृत त्वरित है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

उपयोग किए जाने वाले सभी चूहे आनुवंशिक तनाव C57BL / 6J के थे ( सामग्री की तालिका देखें)। इस तनाव को पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है और डिम्बग्रंथि संरचना और कार्य पर कई अध्ययनों के लिए मानक है। चूहों को एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार रखा गया था, और की गई प्रक्रियाओं को जैक्सन प्रयोगशाला की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों और रचनाओं को क्रमशः सामग्री की तालिका और तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. Fixative: 1x PBS में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (PFA) तैयार करें। उदाहरण के लिए, 24 नमूनों के लिए (0.5 mL/ नमूना = 12 mL कुल मात्रा), 1x PBS के 9 mL में 16% PFA इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी-ग्रेड के 3 mL जोड़ें।
  2. परमीबिलाइज़ेशन बफ़र
    1. एक 250 मिलीलीटर प्लास्टिक बीकर में पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) को मापें जिसमें 1x पीबीएस होता है, इससे पहले कि परमेबिलाइजेशन बफर की आवश्यकता होती है। पीवीए को पूरी तरह से भंग करने की अनुमति देने के लिए समाधान को रात भर हिलाएं।
    2. भंग पीवीए में सोडियम बोरोहाइड्राइड जोड़ें और मिश्रण को लगभग 3-5 मिनट के लिए homogenize करने की अनुमति दें। फोम के लिए समाधान की उम्मीद है.
    3. समाधान के लिए Triton X-100 जोड़ें और एक बार Triton X-100 भंग हो जाने के बाद बफ़र का उपयोग करें।
      नोट: पीवीए को भंग करने में लंबा समय लगता है (कम से कम 3 ज), और एंटीबॉडी का प्रवेश इस बात पर निर्भर करता है कि यह कितनी अच्छी तरह से भंग हो जाता है। बड़े अंडाशय के लिए, पीवीए को पूरी तरह से भंग करना महत्वपूर्ण है।
  3. अवरोधित बफर
    1. गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) को 1x पीबीएस के साथ बीकर में मापें। समाधान को तब तक हिलाएं जब तक कि बीएसए भंग न हो जाए।
    2. ग्लाइसिन, ट्राइटन एक्स -100, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और सोडियम एज़ाइड जोड़ें। तब तक हिलाएं जब तक कि समाधान homogenizes. बफर को एक बोतल में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने से पहले सामान्य बकरी सीरम जोड़ें।
  4. धुलाई बफर: 1x PBS युक्त एक बीकर में पीवीए को मापें। पीवीए को भंग करने की अनुमति देने के लिए समाधान को रात भर हिलाएं। Triton X-100 और सोडियम azide जोड़ें। एक बार बफर मिश्रित हो जाने के बाद, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. स्केलएस 4 (0) समाधान (पीएच 8.1): पीबीएस में डी-सोर्बिटोल को ≤100 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी के साथ एक बीकर में भंग करें। समाधान में यूरिया जोड़ें, और एक बार यूरिया भंग हो जाने के बाद, गर्मी को बंद कर दें और समाधान को पूरी तरह से भंग होने तक हिलाने की अनुमति दें। ग्लिसरॉल और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड जोड़ें, और तब तक हिलाएं जब तक कि समाधान homogenizes न हो जाए। समाधान को अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: ScaleS4 (0) समाधान अंडाशय समाशोधन के पहले दिन पर ताजा किया जाना चाहिए।
  6. स्केलक्यूबआईसी -1 समाधान
    1. ≤100 डिग्री सेल्सियस तापमान पर सरगर्मी के साथ पीबीएस युक्त बीकर में यूरिया को भंग करें। एक अलग बीकर में एन, एन, एन', एन'-टेट्राकिस (2-हाइड्रॉक्सीप्रोपिल) एथिलीनेडियामाइन को मापें, फिर भंग यूरिया जोड़ें, और अभिकर्मकों के पूरी तरह से भंग होने तक ≤100 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर हलचल करें। एक बार जब सभी अभिकर्मक समाधान में होते हैं, तो गर्मी को बंद कर दें, और कमरे के तापमान पर ठंडा करें। अंधेरे में स्टोर करें।
    2. इसे एक फ़िल्टरिंग फ्लास्क में स्थानांतरित करके समाधान degas. फ्लास्क को टयूबिंग के साथ एक वैक्यूम में संलग्न करें, फ्लास्क को कवर करें, और समाधान में बुलबुले गायब होने तक वैक्यूम को चालू करें। इस degassing के बाद समाधान का उपयोग करें।
      नोट: समाधान को एक महीने तक उपयोग करने के लिए अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. सुक्रोज समाधान: 1x PBS में सुक्रोज भंग; फिर उपयोग करने से पहले समाधान degas.
    नोट: उपयोग करने से पहले समाधान को ताजा तैयार करें।
  8. स्केलक्यूबआईसी -2 समाधान
    1. pbs युक्त बीकर में सुक्रोज को ≤100 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर सरगर्मी के साथ भंग करें। यूरिया जोड़ें और ≤100 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर हिलाएं जब तक कि यूरिया भंग न हो जाए। आंच बंद कर दें।
    2. triethanolamine और Triton X-100 जोड़ें। तब तक हिलाएं जब तक कि समाधान homogenizes. समाधान को कमरे के तापमान पर ठंडा करने और अंधेरे में स्टोर करने की अनुमति दें। उपयोग करने से पहले समाधान degas.
      नोट: समाधान को एक महीने तक उपयोग करने के लिए अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है।

2. विच्छेदन और प्रसवपूर्व अंडाशय का निर्धारण (चित्रा 1A)

  1. मेट वयस्क महिलाओं (≥8 सप्ताह) और अनुमोदित संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार पुरुष। हर सुबह योनि प्लग के लिए जाँच करें।
    नोट: एक योनि प्लग की सुबह 0.5 दिन के बाद coitum (d.p.c) या E0.5 के रूप में नामित किया गया है।
  2. विच्छेदन के दिन, माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) और एलीकोट ~ 0.5 एमएल तैयार करें, जिसे बेंच साइड (~ 4 प्रति गर्भवती महिला) पर रखा गया है।
    नोट: पीएफए एक खतरनाक पदार्थ है और इसे रासायनिक हुड के तहत संभाला जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक गर्भवती महिला के लिए 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के ~ 10 मिलीलीटर युक्त तीन 100 मिमी प्लेटें तैयार करें (गर्भाशय की कटाई के लिए, मेसोनेफ्रॉस-अंडाशय परिसर को विच्छेदन करने के लिए, और अंडाशय को अलग करने के लिए)।
  4. गर्भवती महिलाओं को euthanize करें जो पसंदीदा विकास चरण के भ्रूण को ले जाते हैं और विच्छेदन के लिए आगे बढ़ते हैं। Euthanize एक समय में 1-2 से अधिक महिलाओं को नहीं। गर्भवती चूहों की इच्छामृत्यु के लिए एक अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, सीओ2 जोखिम ग्रीवा अव्यवस्था के बाद)।
  5. एक बार जब एक महिला euthanized है, 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे. संदंश का उपयोग करके, पेट की त्वचा को उठाएं और पेट और शरीर की दीवार के माध्यम से वी-आकार चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। चीरा के दो किनारों के साथ काटें और गर्भाशय में आंतरिक अंगों और भ्रूण को उजागर करने के लिए त्वचा को वापस छील लें।
  6. संदंश और कैंची के साथ, पेट की चर्बी और डिम्बग्रंथि धमनियों और नसों से भ्रूण के साथ गर्भाशय को काटें और अलग करें। गर्भाशय को हटा दें और इसे 1x PBS युक्त 100 मिमी प्लेट में रखें। गर्भाशय की दीवार को काटकर और जर्दी की थैली को पंक्चर करके भ्रूण को पीबीएस में छोड़ दें। गर्भनाल को काट लें।
    नोट: गर्भावस्था में 15 दिनों से कम उम्र के भ्रूण के लिए, मां की इच्छामृत्यु और गर्भाशय से हटाने से भ्रूण की तेजी से मृत्यु सुनिश्चित होती है। जन्म से लेकर गर्भ में 15 दिनों से अधिक उम्र के भ्रूणों को विच्छेदन द्वारा euthanized किया जाना चाहिए।
  7. ताजा 1x PBS के साथ एक नई प्लेट में एक भ्रूण हस्तांतरण। एक E15.5 भ्रूण को नष्ट करने के लिए, भ्रूण को स्थिर करने के लिए संदंश के साथ प्लेट पर दो हिंडलिंब्स को नाजुक रूप से पिन करें। प्रमुख हाथ में आयोजित संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करते हुए, संदंश के बीच गर्दन को पकड़ें और भ्रूण के सिर को काटने के लिए निचोड़ें, या गर्दन को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  8. प्रमुख हाथ संदंश के साथ, अग्रभाग के नीचे काटें और धीरे से ऊपरी शरीर को दूर खींचें। अगला, उदर क्षेत्र के उद्घाटन में पेरिटोनियल गुहा में प्रमुख हाथ संदंश के एक समापन बिंदु को लंबवत रूप से डालें, जबकि संदंश का दूसरा समापन बिंदु बाहर रहता है। संदंश को बंद करें, इसे काटने के लिए शरीर की दीवार को चुटकी लें, और आंतरिक अंगों को उजागर करें।
  9. एक ही संदंश के साथ, धीरे से अंगों को हटा दें, जिसमें आंतों और यकृत शामिल हैं, जब तक कि गुर्दे और प्रजनन अंग दिखाई न दें। भ्रूण के लिंग का निर्धारण करें: E15.5 पर, अंडाशय में एक लम्बी सॉसेज जैसी आकृति होती है जबकि वृषण अंडाकार होते हैं।
    नोट: पहले के चरणों में, लिंग को निर्धारित करने के लिए जीनोटाइपिंग की आवश्यकता हो सकती है।
  10. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, मादा भ्रूण को नीचे रखें और प्रत्येक मेसोनेफ्रॉस-अंडाशय परिसर को समझने के लिए अन्य संदंश का उपयोग करें और धीरे से इसे गुर्दे और मुलरियन नलिकाओं से अलग करें। अंडाशय को 1x PBS के साथ एक नई प्लेट में रखें, मेसोनेफ्रोस को संलग्न छोड़ दें, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए आसपास के ऊतकों को हटा दें कि अंडाशय उजागर हो रहे हैं। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 4% पीएफए के ~ 0.5 मिलीलीटर में दोनों अंडाशय रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। अगले दिन, पीएफए को 70% इथेनॉल के साथ बदलें।
  11. E18.5 अंडाशय के विच्छेदन और निर्धारण के लिए, गर्भाशय से भ्रूण को अलग करें जैसा कि ऊपर वर्णित है और फिर अनुभाग 3 (चित्रा 1 बी) में वर्णित प्रीप्युबरटल पिल्लों के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें।

3. विच्छेदन और prepubertal अंडाशय के निर्धारण (चित्रा 1B)

  1. 4% पीएफए और एलीकोट ~ 0.5 एमएल को 1.5 एमएल ट्यूबों में तैयार करें और उन्हें बेंच साइड (~ प्रति पिल्ला एक ट्यूब) पर रखें। 1x PBS के साथ 35 मिमी प्लेटें तैयार करें (~ एक पिल्ला प्रति)। अनुमोदित संस्थागत प्रोटोकॉल का उपयोग करके पिल्लों को euthanize.
    नोट: Decapitation 8 दिन या उससे कम उम्र के चूहों के लिए इच्छामृत्यु की पसंदीदा विधि है। नवजात चूहों को या तो 3-4 "विच्छेदन कैंची या 5-7" मेयो कैंची का उपयोग करके विघटित किया जा सकता है।
  2. एनोजेनिटल दूरी को मापकर पिल्लों के लिंग का निर्धारण करें, जो महिलाओं की तुलना में पुरुषों में अधिक है। मादा पिल्लों को नष्ट करने के लिए तेज विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। रक्त (~ 5-10 एस) को निकालने के लिए एक पेपर तौलिया पर शरीर, ओपन-कट साइड डाउन, रखें।
  3. प्रत्येक पैर के पंजा पैड में एक पिन रखकर अपनी पीठ पर पिल्ला को सुरक्षित करें। पेट में 70% इथेनॉल का छिड़काव करें। पिल्ले की त्वचा को शरीर से दूर रखने के लिए संदंश का उपयोग करें और निचले पेट की त्वचा में एक छोटे से वी-आकार का चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  4. कैंची को त्वचा के नीचे चीरा में डालें और पेट के दोनों किनारों के साथ काटें। संदंश का उपयोग धीरे से त्वचा को वापस छीलने और पेट के निचले हिस्से को प्रकट करने के लिए करें। धीरे से आंत को ऊपर ले जाएं और मूत्राशय के बगल में गर्भाशय के सींगों का पता लगाएं। गुर्दे की ओर प्रत्येक गर्भाशय सींग का पालन करें और प्रत्येक गुर्दे के नीचे आसपास के वसा ऊतक के साथ अंडाशय का पता लगाएं।
  5. अंडाशय को विच्छेदित करने के लिए, अंडाशय के नीचे गर्भाशय सींग को पकड़ें और संदंश की एक जोड़ी (संदंश ए, चित्रा 1 बी) के साथ अंडाशय और ओविडक्ट के नीचे रखें और धीरे से इसे शरीर से दूर उठाएं। संदंश (संदंश बी) की एक और जोड़ी का उपयोग करते हुए, धीरे-धीरे संदंश की पहली जोड़ी के नीचे पकड़ो ताकि वसा पैड में अंडाशय और ओविडक्ट संदंश की दूसरी जोड़ी के ऊपर दिखाई दे। फिर, कैंची के साथ संदंश की दूसरी जोड़ी के नीचे काटें या अंडाशय और संलग्न ऊतकों को अलग करने के लिए सावधानीपूर्वक खींचें।
  6. अलग अंगों को 1x PBS के साथ एक प्लेट में रखें। अंडाशय को साफ करने और अलग करने के लिए अतिरिक्त वसा ऊतक, ओविडक्ट और गर्भाशय सींग को दूर ट्रिम करें। नाजुक अंडाशय के चारों ओर bursa खोलें और पूरे अंडाशय को बेनकाब.
  7. अंडाशय को नुकसान पहुंचाए बिना बर्सा झिल्ली को ट्रिम करें और अंडाशय को संभालने के लिए हिलम (अंडाशय और प्रजनन पथ के बीच स्नायुबंधन जैसी संरचना) के चारों ओर ऊतक छोड़ दें, जैसा कि चित्रा 1 बी, पी 5 में दिखाया गया है। एक बार अंडाशय छंटनी कर रहे हैं, उन्हें 4% पीएफए में जगह है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अंडाशय ठीक है. अगले दिन, 70% इथेनॉल के साथ 4% पीएफए को बदलें और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल चरण तक अंडाशय को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. परफ्यूजन, विच्छेदन, और pubertal अंडाशय के निर्धारण (चित्रा 1C)

  1. एक रासायनिक धुएं हुड में गहरी संज्ञाहरण के तहत माउस के साथ संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों perfuse. परफ्यूजन उपकरण और अभिकर्मकों को तैयार करें। विस्तृत प्रोटोकॉल 42 पर देखें।
    नोट: परफ्यूजन एक टर्मिनल इच्छामृत्यु प्रक्रिया है जो पूरे संवहनी प्रणाली में रक्त को ऊतक फिक्सेटिव के साथ बदल देती है।
  2. एक प्यूबर्टल मादा माउस (P28) का वजन करें और माउस के वजन को रिकॉर्ड करें (आमतौर पर 13 ग्राम से 15 ग्राम के बीच)। उपयोग किए जाने वाले अनुमोदित संज्ञाहरण एजेंट की मात्रा की गणना करें।
    नोट: यहाँ, इस प्रोटोकॉल में शरीर के वजन के प्रति 10 ग्राम tribromoethanol के 0.35 mL का उपयोग किया गया था।
  3. अनुमोदित एनेस्थेटिक एजेंट के साथ सिरिंज को भरने के लिए 20 जी सुई के साथ 10 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करें। 20 G सुई को 26 G x 3/8 सुई से बदलें।
  4. एक हाथ से पृष्ठीय गर्दन की त्वचा को स्क्रूफ करके माउस को सावधानीपूर्वक रोकें। पेट को उजागर करने के लिए माउस को पलटें। पेरिटोनियल गुहा में एनेस्थेटिक की पहले से गणना की गई मात्रा को इंजेक्ट करें। माउस को एक कवर के साथ एक कंटेनर में रखें जब तक कि संज्ञाहरण प्रभावी न हो जाए (यानी, माउस अब नहीं चलता है)।
  5. एक बार जब माउस चलना बंद कर देता है, तो धीरे से अपने पैरों को यह जांचने के लिए चुटकी लें कि कोई प्रतिक्रिया नहीं है और यह सुनिश्चित करें कि माउस परफ्यूजन शुरू करने से पहले पूरी तरह से एनेस्थेटिक है। रखें और एक बोर्ड पर पंजा पैड के माध्यम से धीरे से सभी चार पैरों को पिन करके माउस को अपनी पीठ पर सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि पैरों को आराम की स्थिति में पिन किया गया है, न कि अतिरंजित।
  6. चूहे को पेट से छाती क्षेत्र तक 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। धीरे से चुटकी लेने और पेट की त्वचा को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें और फिर त्वचा और शरीर की दीवार के माध्यम से एक छोटे से वी-आकार के कट बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  7. शरीर गुहा से त्वचा फ्लैप को दूर उठाएं और त्वचा और शरीर की दीवार के नीचे कैंची डालें। उरोस्थि पर वक्ष गुहा के किनारे तक सिर की ओर सीधे त्वचा और शरीर की दीवार को काटें।
  8. उरोस्थि के दोनों किनारों पर पसलियों को सावधानीपूर्वक काटकर वक्ष गुहा को स्कैपुला के ठीक नीचे तक खोलें। ध्यान रखें कि रिब पिंजरे के नीचे फेफड़ों को पंचर न करें। संदंश के साथ त्वचा / रिब फ्लैप को पकड़ो और आंतरिक अंगों को उजागर करने के लिए उन्हें पिन करें।
  9. धीरे से किसी भी ऊतक को ट्रिम करें, जैसे थाइमस, जो हृदय तक स्पष्ट पहुंच को बाधित कर सकता है। जठरांत्र संबंधी मार्ग सहित सभी अंगों को उजागर करें, ताकि दृश्य पुष्टि की जा सके कि पूरे शरीर को पेट के निचले हिस्से सहित संक्रमित किया गया है।
  10. हृदय के दाहिने आलिंद को स्निप करने और सिस्टम से रक्त छोड़ने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। धीरे से संदंश के साथ दिल को पकड़ो और बाएं वेंट्रिकल में एक परफ्यूजन सुई (एक पेरिस्टाल्टिक पंप नियंत्रक से जुड़ा हुआ) डालें।
  11. पंप ~ पीबीएस के 10 मिलीलीटर, कोमल लेकिन निरंतर दबाव के साथ, जब तक कि जिगर, गुर्दे और प्रजनन पथ (चित्रा 1 ई, एफ) जैसे ऊतक गुलाबी से सफेद में बदल जाते हैं। इसके बाद, पीबीएस को ताजा 1% पीएफए के साथ बदलें और पीएफए के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ परफ्यूजन जारी रखें या जब तक माउस के निचले शरीर (जैसे, पूंछ) में ट्विचिंग न हो जाए।
    नोट: ये निर्धारण झटके सफल परफ्यूजन का संकेत देते हैं।
  12. एक बार जब परफ्यूजन पूरा हो जाता है, तो गुर्दे के नीचे अंडाशय के साथ वसा पैड का पता लगाएं और धीरे-धीरे वसा पैड, अंडाशय और गर्भाशय के सींगों सहित पूरे प्रजनन पथ को विच्छेदित करें, और 4% पीएफए के साथ एक शीशी में पथ को रखें। रात भर कमरे के तापमान पर अंडाशय को ठीक करें (~ 16-24 घंटे)। फिर, कम से कम एक दिन के लिए 70% इथेनॉल के साथ 4% पीएफए को बदलें और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले अंडाशय (चित्रा 1ई, एफ) को ट्रिम करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।

5. पूरे माउंट अंडाशय immunostaining (चित्रा 2A)

नोट: immunostaining प्रोटोकॉल के दौरान बाँझ तकनीकों का अभ्यास करें, खासकर जब buffers बदलते हैं, विस्तारित इनक्यूबेशन अवधि के दौरान संदूषण को रोकने के लिए।

  1. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में सभी immunostaining चरणों का प्रदर्शन करें, जैसा कि चित्र 2A में दिखाया गया है। अन्य स्वरूपों के लिए अभिकर्मक वॉल्यूम समायोजित करें. छोटे प्रसवपूर्व और prepubertal अंडाशय खोने से बचने के लिए buffers ध्यान से बदलें।
    नोट: अन्य प्रारूपों, जैसे कि 48- और 96-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन गहरे कुओं और संकीर्ण उद्घाटन अंडाशय को खोने या नुकसान पहुंचाए बिना बफर को एस्पिरेट करना मुश्किल बनाते हैं।
  2. दिन 1
    1. पिपेट 1 मिलीलीटर पीबीएस / अच्छी तरह से एक साफ 24-अच्छी तरह से प्लेट में आवश्यक कुओं की संख्या में अच्छी तरह से। एक 200 μL पिपेट टिप की नोक को काट दें ताकि एक व्यापक उद्घाटन किया जा सके और इसका उपयोग 70% इथेनॉल के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों से धीरे-धीरे प्रीप्युबर्टल अंडाशय को कुओं में स्थानांतरित करने के लिए किया जा सके। Pubertal अंडाशय के लिए, स्थानांतरण के लिए बंद टिप कट के साथ एक 1000 μL पिपेट टिप का उपयोग करें।
      नोट: टिप का व्यापक उद्घाटन स्थानांतरण के दौरान ऊतक क्षति को रोकता है।
    2. एक बार जब सभी नमूनों को कुओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो पीबीएस को एस्पिरेट करने के लिए एक नई टिप का उपयोग करें और इसे पीबीएस / अच्छी तरह से ताजा 0.8 मिलीलीटर के साथ बदल दें। रात भर ~ 100-150 आरपीएम पर एक शेकर पर कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। permeabilization बफर की तैयारी शुरू करें ( तालिका 1 और अनुभाग 1 देखें)।
      नोट: नई टिप अंडाशय को टिप से चिपकने से रोकती है, और पीबीएस इनक्यूबेशन चरण अंडाशय को पीबीएस में संतुलित करने और धुंधला होने से पहले रीहाइड्रेट करने की अनुमति देता है।
  3. दिन 2
    1. permeabilization बफर की तैयारी समाप्त. कुओं से एस्पिरेट पीबीएस और इसे 0.8 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से permeabilization बफर के साथ प्रतिस्थापित करें। प्लेटों को शेकर पर वापस रखें और 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    2. इनक्यूबेशन के 4 घंटे के बाद, पूरी तरह से permeabilization बफर aspirate और इसे 0.5 मिलीलीटर ब्लॉकिंग बफर के साथ प्रतिस्थापित करें ( तालिका 1 और अनुभाग 1 देखें)। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ प्लेट को सील करें, एक शेकर पर एक सुरक्षित रूप से कवर किए गए कंटेनर में रखें, और कमरे के तापमान पर रातभर बफर (16-24 ज) को अवरुद्ध करने में कोमल आंदोलन के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 3
    1. बफर को अवरुद्ध करने में कमजोर पड़ने से प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। ओसाइटों की कल्पना करने के लिए, ओसाइट मार्करों का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, चूहे विरोधी रोगाणु सेल परमाणु अम्लीय पेप्टिडेज़ (जीसीएनए)/ टीआरए 98 दोनों प्रसवपूर्व और प्रीप्युबर्टल अंडाशय और खरगोश एंटी-डेड-बॉक्स हेलीकेस 4 (डीडीएक्स 4) / माउस वासा होमोलॉग (एमवीएच) दोनों के लिए प्रीप्युबर्टल और प्यूबर्टल अंडाशय दोनों के लिए। प्रसवपूर्व अंडाशय में LINE-1 ORF1p अभिव्यक्ति को परिमाणित करने के लिए, खरगोश एंटी-लाइन-1 ORF1p या किसी अन्य उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करें।
      नोट:: GCNA/TRA98 सिग्नल pubertal अंडाशय में पता लगाने योग्य नहीं है।
    2. नमूनों से अवरुद्ध बफर aspirate और पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 0.5 मिलीलीटर के साथ इसे प्रतिस्थापित करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ प्लेट को सील करें। प्लेटों को कवर के साथ एक कंटेनर में रखें ताकि इनक्यूबेशन के दौरान नमूनों के सूखने को रोका जा सके। कंटेनर को शेकर पर रखें और कमरे के तापमान पर 3-4 दिनों के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  5. दिन 7
    1. धीरे से प्लेटों से पैराफिल्म को हटा दें और नमूनों से प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण को एस्पिरेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस (एक महीने या तीन उपयोगों तक) पर स्टोर करें और बाद में ताजा एंटीबॉडी के साथ पूरक करके उन्हें पुन: उपयोग करें (उदाहरण के लिए, पहले से उपयोग किए गए मिश्रण के प्रति 5 मिलीलीटर ताजा एंटीबॉडी एलीकोट के 2 μL)।
    2. नमूनों के लिए अच्छी तरह से धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( तालिका 1 और अनुभाग 1 देखें) प्रति अच्छी तरह से और धीरे से अवशिष्ट एंटीबॉडी को कुल्ला करने के लिए कुछ सेकंड के लिए प्लेटों को रॉक करें। ध्यान से aspirate और ताजा धोने बफर के 0.8 मिलीलीटर के साथ धोने बफर की जगह और रात भर कमरे के तापमान पर प्लेटों हिला.
  6. दिन 8
    1. रात भर धोने के बफर को एस्पिरेट करें, इसे ताजा धोने के बफर के 0.8 मिलीलीटर के साथ बदलें, और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिलाएं। एक और 2 घंटे के लिए ताजा धोने बफर के साथ धोने के कदम को दोहराएं।
    2. अंतिम धोने के बाद, वाशिंग बफर को 0.5 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ बदलें, उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा फ्लोर 555 और बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 647 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर। प्रत्येक immunostaining प्रयोग के लिए ताजा माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें।
    3. इनक्यूबेशन के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ प्लेट को सील करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर या 3 दिनों के लिए कोमल आंदोलन के साथ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर प्लेटों में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कदम और बाद के सभी कदम अंधेरे में या एल्यूमीनियम पन्नी लपेटने के साथ जगह लेते हैं।
  7. दिन 11
    1. द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण aspirate और धोने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ एक प्रारंभिक धोने प्रदर्शन. धीरे से अवशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी दूर कुल्ला करने के लिए कुछ सेकंड के लिए प्लेटों रॉक.
    2. वाशिंग बफर aspirate, ताजा धोने बफर के 0.8 मिलीलीटर के साथ इसे प्रतिस्थापित करें, और हिलाते हुए, प्रकाश से संरक्षित के साथ 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। कुल 3 धोने के लिए धोने के चरण को 2 बार दोहराएं। तीसरे धोने के बाद, समाशोधन चरण (अनुभाग 6) पर आगे बढ़ें।

6. immunostained पूरे माउंट अंडाशय (चित्रा 2A) के समाशोधन.

नोट: एल्यूमीनियम पन्नी या अपारदर्शी कंटेनरों में प्लेसमेंट में प्लेटों लपेटकर अंधेरे में सभी समाशोधन चरणों का प्रदर्शन करें। समाशोधन चरण prepubertal और pubertal अंडाशय के लिए भिन्न होते हैं।

  1. दिन 11 [प्रसवपूर्व और प्रीप्युबर्टल अंडाशय को एक-चरणीय प्रोटोकॉल में मंजूरी दे दी जाती है]
    1. अंतिम धोने के बाद, धोने के बफर को एस्पिरेट करें और इसे ताजा बनाए गए स्केलएस 4 (0) समाधान के 0.8 मिलीलीटर के साथ बदलें ( तालिका 1 और अनुभाग 1 देखें)। पैराफिल्म के साथ प्लेट को सील करें और इमेजिंग से पहले तीन से चार दिनों के लिए कमरे के तापमान पर हिलाने के साथ अंधेरे में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    2. यदि आवश्यक हो तो ScaleS4 (0) समाधान को दैनिक रूप से एक ताजा समाधान के साथ बदलें; समाधानों को बदलते समय ध्यान रखें, क्योंकि साफ़ किए गए अंडाशय पारदर्शी हो जाते हैं और देखना मुश्किल होता है। समाशोधन के बाद, नमूना सेट अप और इमेजिंग (अनुभाग 7) के लिए आगे बढ़ें।
      नोट:: समाधान बदलने से छवि की गुणवत्ता में काफी सुधार नहीं हुआ. दैनिक परिवर्तन छोटे और ज्यादातर पारदर्शी नमूनों को खोने की संभावना को बढ़ाते हैं।
  2. दिन 11-15 [Pubertal अंडाशय एक दो कदम प्रोटोकॉल में साफ कर रहे हैं]
    1. अंतिम immunostaining धोने के बाद, धोने बफर aspirate और ScaleCUBIC-1 के 0.8 mL के साथ इसे प्रतिस्थापित करें ( तालिका 1 और अनुभाग 1 देखें)। पैराफिल्म के साथ प्लेट को सील करें और धीरे से अंधेरे में 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को हिलाएं। ScaleCUBIC-1 समाधान को दैनिक नए समाधान के साथ बदलें।
    2. दिन 15 पर, नमूने को 10 मिनट के लिए 3 बार धोएं हर बार पीबीएस के 0.8 मिलीलीटर में कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ। PBS को 0.8 mL degassed 20% सुक्रोज के साथ बदलें जो PBS के साथ ताजा तैयार किया गया है। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे से हिलाएं।
    3. स्केलक्यूबआईसी -2 समाधान के 0.8 मिलीलीटर के साथ 20% सुक्रोज समाधान को बदलें ( तालिका 1 और अनुभाग 1 देखें), प्लेट को पैराफिल्म के साथ सील करें, और स्केलक्यूबिक -2 समाधान के दैनिक परिवर्तनों के साथ कमरे के तापमान पर धीरे से हिलाएं। 4-5 दिनों के लिए साफ़ करें और छवि के लिए आगे बढ़ें। नमूना हानि से बचने के लिए समाधानों का आदान-प्रदान करते समय ध्यान रखें क्योंकि साफ़ किए गए अंडाशय पारदर्शी और देखने में मुश्किल होते हैं। नमूना सेट अप और इमेजिंग (अनुभाग 7) के लिए आगे बढ़ें।

7. नमूना सेटअप और एक multiphoton माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग

नोट: नीचे वर्णित सभी चरणों को एक Leica DIVE / 4TUNE / फाल्कन के साथ दो tunable मोड-लॉक Ti: नीलम मल्टीफोटॉन लेजर के साथ 120 fs की पल्स अवधि के साथ एक बहु-विसर्जन 16x / NA0.6 उद्देश्य (विसर्जन तरल = ग्लिसरॉल) के साथ 2.2 मिमी की अधिकतम काम करने की दूरी के साथ किया गया था। छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें. पूरक तालिका S1 और पूरक आकृति S1 इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स दिखाते हैं. अन्य इमेजिंग प्लेटफार्मों के लिए, माइक्रोस्कोपी कोर के साथ परामर्श करें या निर्माताओं के विनिर्देशों / सिफारिशों का पालन करें।

  1. नमूना सेटअप
    1. नमूनों को माउंट करने के लिए सेटअप तैयार करें। उदाहरण के लिए, एक चिपचिपा और लचीला सिलिकॉन गैस्केट का उपयोग एक चिपकने वाला अच्छी तरह से बनाने के लिए। एक 25 मिमी x 25 मिमी नंबर 1.5 माइक्रो कवरस्लिप पर चिपकने वाले को अच्छी तरह से रखें ताकि एक अच्छी तरह से बनाया जा सके जिसमें अंडाशय रखा जाएगा (चित्रा 2 बी)।
      नोट: 1 मिमी मोटाई का एक गैसकेट अंडाशय के सभी आकारों को समायोजित करता है। इस सेटअप की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह इमेजिंग के दौरान अंडाशय आंदोलन को समाप्त करता है, जो तब हो सकता है जब अंडाशय को ग्लास-बॉटम डिश में माउंटेंट में रखा जाता है।
    2. टिप कट ऑफ (प्रसवपूर्व और प्रीप्युबर्टल के लिए 20 μL) के साथ एक पिपेट टिप का उपयोग करते हुए, चिपकने वाले के बीच में स्केलएस 4 (0) समाधान के ~ 5-10 μL के साथ अंडाशय को स्थानांतरित करें जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। प्यूबर्टल अंडाशय के लिए, अंडाशय को स्थानांतरित करने के लिए टिप को काफी दूर तक काट देने के साथ एक 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करें। चिपकने वाला अच्छी तरह से के बीच में ScaleCUBIC-2 समाधान के ~ 15-20 μL जोड़ें।
      नोट: बहुत अधिक समाधान माइक्रोस्कोप चरण पर रिसाव का कारण बन सकता है, और बहुत कम समाधान के परिणामस्वरूप खराब छवि गुणवत्ता होगी। नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें क्योंकि साफ़ किए गए अंडाशय पारदर्शी हो जाते हैं और देखना मुश्किल होता है।
    3. एक बार जब अंडाशय को समाशोधन समाधान की एक बूंद के साथ व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो धीरे से चिपकने वाले पर एक और कवर ग्लास रखें, एक सील बनाने के लिए दबाएं, और नमूनों को दो कवरलिप्स (चित्रा 2 बी) के बीच सैंडविच समाधान को साफ करने के एक छोटे से पूल में रखें। इमेजिंग के लिए, कवरस्लिप "सैंडविच" को 3 डी मुद्रित माइक्रोस्कोप एडाप्टर स्लाइड (जैसे, 43 ) में रखें।
      नोट: चिपकने वाले कुओं को "सैंडविच" को डीकंस्ट्रक्ट करने और पानी से धोने के बाद पुन: प्रयोज्य किया जा सकता है।
  2. इमेजिंग (पूरक तालिका S1 और पूरक चित्रा S1)
    1. माइक्रोस्कोपी कोर या निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार माइक्रोस्कोप और सॉफ़्टवेयर को चालू करें। माइक्रोस्कोप चरण पर घुड़सवार नमूनों को रखें और कम शक्ति वाले एलईडी प्रतिदीप्ति लैंप के साथ जलाए गए नमूने का पता लगाने के लिए आईपीस के माध्यम से देखें।
    2. एक बार जब नमूने स्थित हो जाते हैं, तो लेजर (ओं) को चालू करें और प्रत्येक डिटेक्टर को एक विशिष्ट एलेक्सा फ्लोर डाई / मार्कर को असाइन करें। एकाधिक लेज़रों के लिए, अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति दें। लेजर स्विच करने से पहले पूरे स्टैक को प्राप्त करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, एक लेजर दोनों 555 एनएम और 647 एनएम fluorophores की छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    3. माइक्रोस्कोपी कोर या निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार छवि अधिग्रहण के लिए पैरामीटर सेट करें। द्विदिश छवि अधिग्रहण का उपयोग करें, यदि उपलब्ध हो, तो स्कैनिंग समय को कम करने और दक्षता में सुधार करने के लिए। लाइन औसत (1), फ़्रेम औसत (1), और फ़्रेम संचय (1) सहित अन्य सेटिंग्स समायोजित करें.
      नोट: द्विदिश छवि अधिग्रहण लेज़रों को एक्स-अक्ष पर ले जाने के रूप में दोनों दिशाओं में स्कैन करने की अनुमति देता है।
    4. शुरुआत (नमूना / नीचे ग्लास कवर के नीचे) और अंत स्थिति (नमूना / शीर्ष ग्लास कवर के शीर्ष) की पहचान करके जेड-स्टैक सेट करें। Prepubertal अंडाशय के लिए 2 μm और pubertal अंडाशय के लिए 5 μm के एक Z-चरण आकार का चयन करें।
    5. Z-मुआवजा सुविधा को सक्रिय करें, और इस सुविधा के भीतर, उत्तेजना लाभ को सक्रिय करें। नीचे (कम तीव्रता) और शीर्ष स्टैक (उच्च तीव्रता) दोनों के लिए एक लेजर तीव्रता का चयन करके नमूने के नीचे और ऊपर के लिए जेड-मुआवजा सेट करें। अनुपूरक चित्रा S1, रैखिक Z-मुआवजा देखें, जहां उत्तेजना लाभ बॉक्स का चयन किया जाता है, और नीचे (0) और शीर्ष (347.75) के लिए लेजर तीव्रता क्रमशः 10 और 12 के रूप में सेट की जाती है।
    6. दृश्य के किसी एकल फ़ील्ड में कैप्चर नहीं किए जा सकने वाले बड़े नमूनों के लिए टाइलिंग मोड का उपयोग करें. छवि नेविगेटर को सक्रिय करें और आयताकार अंकन उपकरण का उपयोग करके पूरे नमूने को कैप्चर करने के लिए आवश्यक टाइल्स की संख्या को इंगित करें।
    7. छवि अधिग्रहण प्रारंभ करें। एकाधिक टाइल्स वाली छवियों के लिए, सभी टाइल्स कैप्चर करने के लिए नेविगेटर के साथ छवि अधिग्रहण शुरू करें। एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो जाने के बाद, पहले सभी छवियों को सहेजें , और यदि कई टाइल्स का अधिग्रहण किया गया था, तो टाइल्स को एक ही छवि में विलय करने के लिए मोज़ेक-मर्ज टूल चलाएं।
    8. मर्ज की गई फ़ाइलों को गीगाबाइट-आकार की छवियों के साथ काम करना आसान बनाने के लिए एक अलग प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में सहेजें। 3 डी छवि विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ छवि प्रसंस्करण के लिए फ़ाइलों को स्थानांतरित करें। चित्रा 3 दो मार्करों (GCNA और DDX4) के साथ विभिन्न चरणों में ली गई प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है।

8. छवि प्रसंस्करण

नोट:: नीचे वर्णित सभी चरणों को विकसित किया गया था और IMARIS 3D छवि विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था।

  1. छवि (ओं) को 3D छवि विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आयात करें और, यदि आवश्यक हो, तो फ़ाइलों को मूल प्रारूप (जैसे, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) से .ims प्रारूप में कनवर्ट करें।
  2. यदि आवश्यक हो, तो पिक्सेलेशन (चित्रा 4A) को कम करने के लिए गॉसियन फ़िल्टर के साथ छवियों को संसाधित करें। 3D दृश्य सुविधा का उपयोग करके, छवि को स्थित करें और फ़्रेम विकल्प का चयन रद्द करें (फ़्रेम को निकालने के लिए).
    नोट:: अन्य वैकल्पिक फ़िल्टर हैं, जिनका उपयोग पिक्सेलेशन को कम करने और पृष्ठभूमि तीव्रता को कम करने के लिए भी किया जा सकता है.
  3. छवि को किसी विशिष्ट पैमाने पर बड़ा करें और स्नैपशॉट सुविधा का उपयोग करें. प्राथमिकताओं को निम्नानुसार सेट करें: 300 DPI का चयन करें, TIFF छवि के रूप में सहेजें, और पारदर्शी पृष्ठभूमि. छवि का एक स्नैपशॉट लें और इसे सहेजें। चित्रा 3 पूर्ण इकट्ठे छवियों से पता चलता है.

9. ओसाइट परिमाणीकरण

नोट: पूरे अंडाशय immunofluorescence और 3 डी छवि विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण स्पॉट सुविधा का उपयोग कर पूरे अंडाशय (चित्रा 3 और चित्रा 4) में ओसाइट संख्या के अनुमान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। GCNA सिग्नल का उपयोग प्रसवपूर्व और प्रीप्युबर्टल अंडाशय में ओसाइटों को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 4 (P5) में दिखाया गया है। प्यूबर्टल अंडाशय में, गैर-बढ़ते रोम ("रिंग-जैसे" संरचना, बंद तीर) और बढ़ते रोम (बड़ी संरचनाएं, खुले तीर, चित्रा 4, पी 28) में दो ओसाइट आबादी को मापने के लिए डीडीएक्स 4 सिग्नल का उपयोग करें।

  1. चरण 9.2 में स्पॉट सुविधा के साथ ओसाइटों को मापने के लिए पैरामीटर के रूप में उपयोग किए जाने वाले ओसाइटों का आकार निर्धारित करें।
    1. छवि खोलें और Z-स्टैक छवि को खोलने के लिए स्लाइस विकल्प का चयन करें।
    2. माप पैनल में रेखा विकल्प का चयन करें और गणना करने के लिए ओसाइट प्रकार / आकार के XY व्यास को निर्धारित करने के लिए सबसे व्यापक बिंदु पर एक ओसाइट / मार्कर के एक किनारे से दूसरे किनारे तक एक रेखा खींचकर दूरी को मापें। स्टैक के माध्यम से ले जाएँ और एक ही प्रकार के एकाधिक ocytes के लिए व्यास की सीमा प्राप्त करें। ओसाइट गिनती के लिए आकार चयन मानदंड के रूप में सबसे छोटी लंबाई का उपयोग करें।
  2. स्पॉट सुविधा: 3 डी दृश्य विकल्प का चयन करें और एल्गोरिथ्म पैनल खोलने के लिए दृश्य पैनल में नए स्पॉट जोड़ें फ़ंक्शन को सक्रिय करें। चरण 9.1 में प्राप्त ओसाइट आकार के साथ आकार चयन फ़िल्टर के रूप में सभी एल्गोरिथ्म सेटिंग्स का चयन रद्द करें उपयोग किया जाएगा।
    1. स्रोत चैनल पर जाने के लिए एकल अग्रेषित तीर पर क्लिक करें. पसंदीदा मार्कर के साथ चैनल का चयन करें और चरण 9.1 में प्राप्त अनुमानित XY व्यास में प्रकार। उदाहरण के लिए, प्रसवपूर्व ocytes के लिए 7 μm और P5 ocytes के लिए 11 μm के अनुमानित XY व्यास का उपयोग करें (GCNA = ग्रीन सिग्नल); चित्रा 3 और चित्रा 4A)।
    2. P5 अंडाशय (DDX4 = मैजेंटा सिग्नल) में बढ़ते रोम में ओसाइटों की संख्या का अनुमान लगाने के लिए DDX4 सिग्नल के लिए 30 μm का उपयोग करें; चित्रा 3 और चित्रा 4A)। प्यूबर्टल अंडाशय के लिए, ओसाइट परिमाणीकरण के लिए DDX4 सिग्नल का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, गैर-बढ़ते रोम और बढ़ते रोम के भीतर ओसाइटों की पहचान करने के लिए क्रमशः 15 μm और 80 μm के XY व्यास का उपयोग करें, जैसा कि चित्र4A में दिखाया गया है।
      नोट:: चयनित आकार छवि अधिग्रहण मापदंड और उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के प्रकार के कारण भिन्न हो सकता है। चयन आनुवांशिक उपभेदों के बीच भी भिन्न हो सकता है क्योंकि अधिक ओसाइट वाले अंडाशय को बेहतर स्वचालित ओसाइट का पता लगाने के लिए छोटे आकार के चयन की आवश्यकता होगी।
    3. आकार चयन के बाद, मॉडल PSF-बढ़ाव और पृष्ठभूमि घटाव, जो स्वचालित रूप से निर्धारित कर रहे हैं सक्रिय करें। फ़िल्टर स्पॉट पैनल पर ले जाने के लिए एकल अग्रेषित तीर का चयन करें. गुणवत्ता फ़िल्टर जोड़ें और एक थ्रेशोल्ड निर्धारित करें। ओसाइट संख्याओं का सटीक अनुमान सुनिश्चित करने के लिए, छवि को बड़ा करें क्योंकि थ्रेशोल्ड को एक थ्रेशोल्ड मान चुनने के लिए समायोजित किया जाता है जो अधिकांश ओसाइटों का चयन करता है। स्वचालित गिनती समाप्त करने के लिए डबल तीर पर क्लिक करें।
    4. मैन्युअल रूप से चयनित ocytes मैन्युअल रूप से संपादित करें टैब का उपयोग कर चयनित ocytes की जाँच करें छूटे हुए ocytes का चयन करें या स्वत: थ्रेशोल्ड द्वारा चयनित गैर-ocyte कणों का चयन रद्द करने के लिए। आगे के विश्लेषण के लिए समग्र टैब के अंतर्गत आँकड़े टैब में डेटा रिकॉर्ड करें।
      नोट:: धब्बों की गिनती के लिए उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर सहेजे जा सकते हैं और किसी अन्य नमूना सेट के लिए उपयोग किए जा सकते हैं, लेकिन बैच विश्लेषण चलाने से पहले मैन्युअल जांच करने की सिफारिश की जाती है।
    5. पैरामीटर संग्रहीत करने के लिए, निर्माण टैब पर क्लिक करें और बैच के लिए स्टोर पैरामीटर पर क्लिक करें।
      नोट: परमाणु मार्करों (GCNA + ocytes, चित्रा 4A) आसानी से स्पॉट सुविधा द्वारा पहचाने जाते हैं और अधिक मैनुअल समायोजन की आवश्यकता नहीं हो सकती है। हालांकि, साइटोप्लाज्मिक मार्कर (DDX4 + oocyte, चित्रा 3 (P28, बंद तीर) और चित्रा 4A) को सही आकार / प्रकार के ओसाइट्स की पहचान सुनिश्चित करने के लिए अधिक मैनुअल समायोजन की आवश्यकता होगी।

10. अंडाशय में प्रोटीन अभिव्यक्ति परिमाणित

नोट:: स्पॉट सुविधा ( अनुभाग 9 और चरण 10.1) और सतहों सुविधा (चरण 10.2) दोनों का उपयोग कर विशिष्ट मार्करों की ओसाइट अभिव्यक्ति को मापने के लिए कई तरीके हैं। स्पॉट सुविधा का उपयोग परमाणु मार्करों (जीसीएनए) जैसे अलग-अलग स्थानीयकरण पैटर्न वाले प्रोटीन के लिए किया जा सकता है, और सतहों की सुविधा का उपयोग गैर-समान स्थानीयकरण पैटर्न वाले प्रोटीन के लिए किया जा सकता है जैसा कि चित्रा 5 ए में दिखाया गया है जहां ई 15.5 और ई 18.5 अंडाशय में लाइन -1 ओआरएफ 1 पी तीव्रता को मापा गया था। दो नमूनों (जैसे, टाइमपॉइंट्स, उपचार, या जीनोटाइप) के बीच ब्याज के प्रोटीन की तीव्रता की गणना और तुलना करने के लिए, समान गुणों के साथ छवियों को इकट्ठा करें। अन्य नमूनों के लिए संग्रहीत और उपयोग किए जा सकने वाले पैरामीटर निर्धारित करने के लिए अधिक तीव्र संकेत वाले नमूनों का उपयोग करें।

  1. स्पॉट्स सुविधा के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, पहले हाइलाइट किए गए के रूप में ओसाइट की पहचान करें (अनुभाग 9)।
    1. फिर स्पॉट सुविधा के तहत, विस्तृत टैब के बाद सांख्यिकी टैब का चयन करें। नीचे तीर पर क्लिक करें और विशिष्ट मूल्यों का चयन करें, जो इसके नीचे एक और टैब खोलेगा जिसमें विभिन्न माप होंगे। सतह पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल का तीव्रता माध्य का चयन करें (या अन्य तीव्रता मापों जैसे तीव्रता माध्यिका का चयन करें)।
    2. संयुक्त/औसत सांख्यिकीय जानकारी प्राप्त करने के लिए, औसत मान मानदंड का चयन करें. एक बार हो जाने के बाद, निर्यात करें और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा सहेजें।
  2. Surfaces सुविधा के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, छवि खोलें, 3D दृश्य विकल्प का चयन करें और एल्गोरिथ्म पैनल को खोलने के लिए दृश्य पैनल में नई सतहें जोड़ें फ़ंक्शन को सक्रिय करें। यदि आवश्यक न हो तो सभी एल्गोरिथ्म सेटिंग्स का चयन रद्द करें और स्रोत चैनल पर जाने के लिए एकल अग्रेषित तीर पर क्लिक करें.
    1. मापने के लिए एंटीबॉडी सिग्नल के साथ चैनल का चयन करें। चयन करने के लिए अन्य गुण उपयोगकर्ता-विशिष्ट विकल्प हैं। यहां, LINE-1 सिग्नल का उपयोग मार्कर के रूप में किया गया था। Surfaces Detail और Background Subtraction (Local Contrast) मानों को क्रमशः 1.42 और 5.33 के डिफ़ॉल्ट मानों पर रखा गया था।
    2. थ्रेशोल्ड पैनल पर जाने के लिए आगे तीर पर क्लिक करें। एक थ्रेशोल्ड मान चुनें जो दोनों नमूनों में तुलनीय है (उदाहरण के लिए, यहां, E18.5 में LINE-1 व्यंजक का उपयोग थ्रेशोल्ड चुनने के लिए किया गया था)। 7.10 के डिफ़ॉल्ट बीज बिंदु व्यास के साथ सक्षम करें का चयन करें (यह मान छवियों के लिए इष्टतम पाया गया था, लेकिन सुविधाओं के अपेक्षित पिक्सेल-आकार पर निर्भर हो सकता है)।
    3. फ़िल्टर सतहों पैनल पर ले जाने के लिए आगे तीर पर क्लिक करें। गुणवत्ता फ़िल्टर का उपयोग किया गया था, और दोनों अंडाशय नमूनों में प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर थ्रेशोल्ड मान के साथ मूल्य को आधार बनाया गया था। एक बार फ़िल्टर गुण का चयन हो जाने के बाद, सतह की पीढ़ी को पूरा करने के लिए डबल फॉरवर्ड तीर पर क्लिक करें।
    4. तीव्रता मान प्राप्त करने के लिए, विस्तृत टैब के बाद आँकड़े टैब का चयन करें. नीचे तीर पर क्लिक करें और विशिष्ट मूल्यों का चयन करें, जो इसके नीचे एक और टैब खोलेगा जिसमें विभिन्न माप होंगे।
    5. सतह पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल के तीव्रता माध्य का चयन करें (या अन्य तीव्रता मापों जैसे तीव्रता माध्यिका का चयन करें)।
    6. संयुक्त/औसत सांख्यिकीय जानकारी प्राप्त करने के लिए, औसत मान मानदंड का चयन करें. एक बार हो जाने के बाद, निर्यात करें और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को सहेजें (चित्रा 5 सी)।

11. कम्प्यूटेशनल सुधार के साथ क्षतिग्रस्त अंडाशय में कुल ओसाइट संख्या का अनुमान

नोट: यदि विच्छेदन के दौरान एक मामूली अंडाशय क्षति होती है, तो कम्प्यूटेशनल रूप से कुल ओसाइट गिनती का अनुमान लगाना संभव हो सकता है। यह एक ही तनाव और विकास के चरण से बरकरार अंडाशय का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है ओसाइट संख्या अनुमान के लिए जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। E15.5 पर अंडाशय के साथ किए गए सिमुलेशन इंगित करते हैं कि ≥30% हानि के लिए सही करने के परिणामस्वरूप वास्तविक संख्याओं (चित्रा 6 C) से एक महत्वपूर्ण विचलन होता है।

  1. IMARIS के साथ बरकरार अंडाशय की छवियों को खोलें और फ़्रेम सुविधा का चयन करें। फ़्रेम सेटिंग्स के अंतर्गत, बॉक्स, ग्रिड, टिकमार्क और अक्ष लेबल का चयन करें. स्थिति X/Y/Z टैब के अंतर्गत, सभी X/Y/Z पदों में 200 μm रिक्त स्थान के साथ टिकमार्क उत्पन्न करने के लिए 200 μm का चयन करें.
    नोट:: tickmarks एक विशिष्ट क्षेत्र के भीतर ocytes की पहचान करने के लिए X, Y और Z विमानों में एक ग्रिड / शासक बनाते हैं।
  2. अनुभाग 9 (चित्र4) में हाइलाइट किए गए के रूप में ocytes की पहचान करने के लिए स्पॉट सुविधा को सक्रिय करें। स्पॉट्स सुविधा में अंक शैली/गुणवत्ता टैब के तहत क्षेत्र का चयन करके सिमुलेशन के लिए उपयोग किए जा रहे सभी अक्षुण्ण अंडाशय में पहचाने जाने वाले ओसाइट्स का उपयोग करके एक 3 डी मॉडल बनाएँ।
    नोट:: पिक्सेल चौड़ाई भी अंक शैली/गुणवत्ता टैब के अंतर्गत परिवर्तित किया जा सकता है।
  3. चरण 11.1 में उत्पन्न बॉक्स के साथ, अक्षत अंडाशय के 3D मॉडल को उसी ओरिएंटेशन में संरेखित करें जैसा कि चित्र 6A में दिखाया गया है।
  4. 200 μm tickmarks (चरण 11.1) का उपयोग करते हुए, प्रत्येक अंडाशय की मात्रा के 50% के भीतर आने वाले ओसाइटों का चयन करें। स्पॉट्स सुविधा पर क्लिक करें और रंग द्वारा 50% क्षेत्र के भीतर आने वाले ओसाइटों को वर्गीकृत करने के लिए लेबल संपादित करें का चयन करें, जैसा कि चित्र 6A में दिखाया गया है।
    नोट: एक बार जब ओसाइटों को किसी क्षेत्र में वर्गीकृत किया जाता है, तो प्रत्येक वर्ग के भीतर आने वाले ओसाइटों की संख्या प्रदान की जाएगी।
  5. 50% क्षेत्र में ज़ूम करें और ओसाइट पहचान के लिए एक छोटा शासक बनाने के लिए 200 μm से 50 μm तक टिकमार्क बदलें। सभी छवियों में ज़ूम % बनाए रखें। एक गाइड के रूप में 50 μm tickmarks के साथ, 50% क्षेत्र को पांच बराबर भागों में विभाजित करें।
    नोट: प्रत्येक भाग के भीतर ओसाइट वॉल्यूम के 10% का प्रतिनिधित्व करेंगे जैसा कि चित्रा 6 ए में हाइलाइट किया गया है, जहां एक बरकरार अंडाशय अंडाशय के शीर्ष आधे हिस्से में ओसाइट दिखाता है, जिसमें प्रत्येक रंग 10% वॉल्यूमेट्रिक क्षेत्र के भीतर ओसाइट का प्रतिनिधित्व करता है।
  6. प्रत्येक 10% क्षेत्र में ओसाइट संख्याओं को रिकॉर्ड करें जैसा कि चित्र 6A, B में दिखाया गया है। 10, 20, 30, 40, और 50% वृद्धि के लिए ओसाइटों की औसत संख्या की गणना करें।
  7. क्षतिग्रस्त आंशिक अंडाशय में ओसाइट संख्या प्राप्त करने के लिए चरण 11.1 से 11.6 में हाइलाइट किए गए का उपयोग करें। क्षतिग्रस्त अंडाशय को बरकरार अंडाशय के समान अभिविन्यास में रखें और ऊपर वर्णित के रूप में लापता मात्रा / प्रतिशत का अनुमान लगाएं।
  8. पूरे अंडाशय में कुल ओसाइट संख्या का अनुमान लगाने के लिए, आंशिक अंडाशय (चित्रा 6 बी) से प्राप्त संख्या में एक समान मात्रा के लिए गणना किए गए ओसाइटों की औसत संख्या जोड़ें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पूरे अंडाशय के इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग एक ही तकनीक और मार्करों (चित्रा 3) का उपयोग करके विभिन्न विकास ता्मक चरणों में अंडाशय में ओसाइट या प्रोटीन अभिव्यक्ति के विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल एक बड़े पैमाने पर परियोजना के लिए विकसित किया गया था जिसमें कई चरणों में अंडाशय के विश्लेषण और कई माउस उपभेदों से आवश्यक था। यहां, हम C57BL6 / J तनाव के लिए एकत्र किए गए डेटा को प्रस्तुत करते हैं, जो आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक मानक तनाव है। यहां प्रस्तुत तकनीक सीधी है, परिणाम 14-19 दिनों (चित्रा 2 डी) के भीतर प्राप्त किए जा सकते हैं और प्रसवपूर्व, प्रीप्युबर्टल और प्यूबर्टल मादाओं (चित्रा 1 और चित्रा 2 ए, बी) से अंडाशय के लिए उपयोग किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग डिम्बग्रंथि के नुकसान की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया था जो डिम्बग्रंथि ओसाइट रिजर्व के गठन के दौरान स्वाभाविक रूप से होता है। माउस सहित कई जीवों में, ओसाइट संख्याओं को भ्रूण के जीवन के दौरान उस समय के आसपास चरम पर माना जाता है जब ओसाइट अर्धसूत्रीविभाजन ~ E13.5 में प्रवेश करते हैं। भ्रूण ओसाइट एट्रिशन (एफओए) (~ E15.5 से E18.5 तक) की अभी भी पूरी तरह से समझी जाने वाली प्रक्रिया के कारण ओसाइट संख्या में कमी आती है, जिसे यंत्रवत रूप से रेट्रोट्रांसपोसन लाइन -120,21 की अभिव्यक्ति से जोड़ा गया है। एक अर्धसूत्रीविभाजन गुणवत्ता चेकपॉइंट22,23 द्वारा असामान्य ओसाइटों के उन्मूलन के कारण E18.5 से P0 के बाद अधिक ओसाइटों को समाप्त कर दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए, हमने DDX4 और GCNA का उपयोग करके विभिन्न विकास ता्मक चरणों में अंडाशय को ओसाइट मार्करों के रूप में इम्यूनोस्टेन और इमेज किया है जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।

GCNA और DDX4 को व्यक्त करने वाले छोटे ओसाइट्स को E15.5 के बाद से देखा जाता है और वे एमपीआई के दौरान ओसाइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं या आदिम रोम के भीतर डिक्टिएट में गिरफ्तार किए जाते हैं। मजबूत DDX4 अभिव्यक्ति के साथ बड़े बढ़ते ocytes पहले से ही P2 अंडाशय में पाया जाता है जहां वे सबसे अधिक संभावना follicles44 की पहली लहर का प्रतिनिधित्व करते हैं। P5 और P28 अंडाशय में बड़े ocytes की बढ़ती संख्या देखी जाती है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 ए) द्वारा प्राप्त छवियों को आईएमएआरआईएस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया गया था और परमाणु जीसीएनए सिग्नल के आधार पर छोटे और बड़े बढ़ते ओसाइटों की पहचान करने के लिए 3 डी रेंडरिंग किया गया था और डीडीएक्स 4 सिग्नल (चित्रा 4 ए और वीडियो 1) द्वारा चित्रित आकार। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में ओसाइट्स की गणना की गई थी और परिणामों को चित्र 4 बी में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में, हमने E15.5 से E18.5 (~ 32%) और E18.5 से P2 (~ 24%) तक एक महत्वपूर्ण ओसाइट हानि देखी। जब तक महिलाएं यौवन (P28) तक पहुंचती हैं, तब तक E15.5 पर मौजूद केवल ~ 30% ओसाइट बच गए हैं।

इस विधि का उपयोग विकिरण जैसे जीनोटॉक्सिक उपचारों के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसे एक सप्ताह23,38,45 के भीतर आदिम कूप रिजर्व को पूरी तरह से खत्म करने के लिए दिखाया गया है। विकिरण के साथ इलाज किए गए पूरे अंडाशय और चित्रा 3 में अनुपचारित नियंत्रण के बीच एक महत्वपूर्ण दृश्य अंतर स्पष्ट है (उपचारित और अनुपचारित महिलाओं से पी 28 अंडाशय की तुलना)। विकिरण जोखिम के बिना P28 अंडाशय में, हमने DDX4 के साथ लेबल किए गए दो ओसाइट आबादी को देखा; आदिम follicles (बंद तीर) में प्रचुर मात्रा में छोटे ocytes; और विभिन्न आकारों के बड़े ओसाइट आमतौर पर बढ़ते रोम (जैसे, प्राथमिक, माध्यमिक और प्रीएंट्रल) में पाए जाते हैं (चित्रा 3)। इसके विपरीत, P7 में γ-विकिरण के 0.5Gy के संपर्क में आने वाली एक महिला से अंडाशय पूरी तरह से आदिम रोम में छोटे ओसाइटों से रहित है जैसा कि पहले 2 डी वर्गों में देखा गया था। दिलचस्प बात यह है कि समान आकार के केवल बड़े ओसाइट विकिरण से बच गए; ये पहले से ही P7 अंडाशय में बढ़ रहे पहले तरंग follicles हो सकता है, के रूप में वे विकिरण46 (चित्रा 3, P28) के लिए प्रतिरोधी होने के लिए जाना जाता है.

ओसाइट संख्याओं के परिमाणीकरण के अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग ओसाइट विकास में शामिल अन्य प्रोटीनों के इम्युनोस्टेनिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने LINE-1ORF1p प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग किया, एक आरएनए-बाइंडिंग चैपरोन प्रोटीन, LINE-1 retrotransposons (चित्रा 5) द्वारा उत्पादित। E15.5 से E18.5 तक LINE-1 तत्वों की बहुतायत में वृद्धि को20,21 के ocyte उन्मूलन का कारण बनने का प्रस्ताव किया गया है। दरअसल, IMARIS में मल्टीफोटॉन-कैप्चर की गई छवियों और सिग्नल तीव्रता विश्लेषण का उपयोग करते हुए, LINE-1 ORF1p के स्तर को इस समय के दौरान ओसाइटों में काफी वृद्धि देखी गई थी, जो चित्र4B में दिखाए गए अनुसार ओसाइट संख्याओं में एक महत्वपूर्ण गिरावट के साथ सहसंबंधित है।

उन परिस्थितियों में जहां अंडाशय का एक हिस्सा क्षतिग्रस्त या खो जाता है, एक ही तनाव और विकास के चरण से अंडाशय का उपयोग लापता क्षेत्र के भीतर ओसाइटों की संख्या का कम्प्यूटेशनल रूप से अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है जैसा कि चित्र6 में दिखाया गया है। E15.5 अंडाशय से डेटा कम्प्यूटेशनल सुधार की सटीकता का परीक्षण करने के लिए सिमुलेशन के लिए उपयोग किया गया था। 30% ऊतक क्षति के साथ अंडाशय में ओसाइट्स को कम्प्यूटेशनल रूप से एक बरकरार अंडाशय में ओसाइटों की तुलना में ≤10% विचलन होने का अनुमान लगाया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि 3 डी अंडाशय धुंधला और मॉडलिंग का उपयोग कीमती ऊतकों से डेटा को बचाने के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है। E15.5 पर अंडाशय के साथ किए गए सिमुलेशन इंगित करते हैं कि ≥30% हानि के लिए सही करने के परिणामस्वरूप वास्तविक संख्याओं (चित्रा 6 C) से एक महत्वपूर्ण विचलन होता है।

Figure 1
चित्र1: अंडाशय विच्छेदन और प्रसवपूर्व और प्रसवोत्तर चरणों से महिलाओं से परफ्यूजन। (ए-सी) विभिन्न चरणों से अंडाशय विच्छेदन के लिए विभिन्न तकनीकों की आवश्यकता होती है, जिन्हें वीडियो में विवरणों के पूरक के लिए योजनाबद्ध रूप से चित्रित किया गया है। (डी) प्रसवोत्तर दिन 5 (पी 5) में अंडाशय पी 28 की तुलना में बहुत छोटे होते हैं, जिसके लिए प्रोटोकॉल में वर्णित एक अलग समाशोधन प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। (E,F) अंडाशय का उचित छिड़काव लाल रक्त कोशिकाओं से पृष्ठभूमि धुंधला को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है। गैर-परफ्यूज्ड प्रजनन पथ और अंडाशय में गुलाबी रंग होता है जबकि परफ्यूज्ड अंग सफेद हो जाएंगे। संक्षिप्त नाम: RI = non-perfused reproductive tracts. छवियों ए-सी BioRender.com के साथ बनाए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इम्युनोस्टेनिंग, समाशोधन, और पूरे माउस अंडाशय की इमेजिंग। (ए) फ्लो चार्ट प्री-प्लेनल / प्रीप्युबर्टल और प्यूबर्टल अंडाशय के लिए इम्युनोस्टेनिंग और क्लियरिंग प्रोटोकॉल के लिए साझा और विशिष्ट चरणों को दर्शाता है। (बी) साफ़ अंडाशय दो कवर स्लिप के बीच सैंडविच किए गए चिपकने वाले कुएं के बीच में समाशोधन समाधान की एक बूंद में लगाए जाते हैं। इमेजिंग के लिए, घुड़सवार नमूनों को 3 डी मुद्रित एडाप्टर स्लाइड में रखा जाता है। (सी) गैर-परफ्यूज्ड बनाम परफ्यूज्ड अंडाशय की ग्रेस्केल मल्टीफोटॉन छवियां, ओसाइट मार्कर डीडीएक्स 4 के साथ इम्यूनोस्टेन्ड, बेहतर छवि गुणवत्ता और परफ्यूजन के बाद कम गैर-विशिष्ट धुंधला दिखा रही हैं। बंद तीर साइटोप्लाज्मिक डीडीएक्स 4 की एक पतली परत के साथ एक ओसाइट को इंगित करता है जो आदिम रोम के लिए विशिष्ट है, और खुले तीर बढ़ते रोम के भीतर बड़े ओसाइट दिखाते हैं। तारांकन रक्त वाहिकाओं से स्वत: प्रतिदीप्ति को इंगित करता है। (डी) 3 डी P5 अंडाशय के confocal बनाम multiphoton छवियों से रेंडर, ओसाइट मार्करों GCNA (हरे) और DDX4 (मैजेंटा) के साथ immunostained, confocal माइक्रोस्कोपी से एक महत्वपूर्ण गोलाकार विपथन दिखा रहा है और वस्तुतः multiphoton से कोई नहीं. स्केल सलाखों = 100 μm (C, D) और 50 μm ( D में इनसेट)। संक्षेप: GCNA = रोगाणु सेल परमाणु अम्लीय peptidase; DDX4 = डेड-बॉक्स हेलिकेस 4. छवि A BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न विकास ता्मक चरणों के अंडाशय की प्रतिनिधि 3 डी-रेंडर की गई छवियां। GCNA (हरे) और LINE-1 ORF1p (नीले) या DDX4 (मैजेंटा) के साथ पूरे माउंट अंडाशय के multiphoton छवियों से 3 डी प्रतिपादन, प्रसवपूर्व और प्रसवोत्तर अंडाशय में, क्रमशः। परमाणु और साइटोप्लाज्मिक संकेतों को दिखाने के लिए व्यक्तिगत चैनलों को ग्रेस्केल में प्रस्तुत किया जाता है। सफ़ेद बक्से बाएँ नीचे इनसेट में आवर्धित क्षेत्रों को रेखांकित करते हैं. P28 के लिए दो अलग-अलग अंडाशय दिखाए गए हैं। नियंत्रण गैर-विकिरणित मादा (शीर्ष) से अंडाशय में आदिम रोम में छोटे ओसाइटों की एक बड़ी आबादी होती है (इनसेट देखें)। इसके विपरीत, γ-विकिरण (आईआर) के 0.5 Gy के साथ P7 पर विकिरणित मादा से अंडाशय पूरी तरह से आदिम follicles में छोटे ocytes से रहित है (इनसेट देखें)। बंद तीर साइटोप्लाज्मिक DDX4 की एक पतली परत के साथ एक ओसाइट को इंगित करता है जो आदिम रोम के लिए विशिष्ट है, और खुले तीर बढ़ते रोम के भीतर बड़े ओसाइट दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 100 μm; P28 इनसेट के लिए 30 μm; अन्य सभी इनसेट के लिए 10 μm. इनसेट में IMARIS में उत्पन्न 3D-रेंडर की गई छवियों के आवर्धित दृश्य होते हैं और परिप्रेक्ष्य के कारण कम-आवर्धन छवियों से थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। संक्षेप: गैर-आईआर = नियंत्रण गैर-विकिरणित; IR = γ विकिरण के 0.5 Gy के साथ P7 पर विकिरणित; GCNA = रोगाणु सेल परमाणु अम्लीय peptidase; DDX4 = मृत बॉक्स हेलीकेस 4; LINE-1 = लंबे समय तक interspersed परमाणु तत्व -1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: छवि प्रसंस्करण, ओसाइटों का 3 डी प्रदर्शन, और परिमाणीकरण परिणाम। (ए) मल्टीफोटॉन छवियों (बाएं) से 3 डी रेंडर को गाऊसी फिल्टर (मध्य) का उपयोग करके आईएमएरिस में संसाधित किया गया था और स्पॉट फीचर (दाएं) का उपयोग करके छोटे और बड़े आकार के ओसाइटों की पहचान की गई थी। P5 और P28 अंडाशय उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 100 μm (P5); 10 μm (P5 इनसेट); 300 μm (P28); 50 μm (P28 इनसेट)। (बी) जीसीएनए के लिए सकारात्मक छोटे ओसाइट्स को स्पॉट सुविधाओं (शीर्ष) का उपयोग करके विभिन्न चरणों से अंडाशय में परिमाणित किया गया था। विकास के दौरान ओसाइटों की घटती संख्या को स्पष्ट करने के लिए, E15.5 (नीचे) पर गिने गए शुरुआती चरण में मौजूद औसत संख्या की तुलना में प्रत्येक चरण में ओसाइटों के औसत % की गणना की गई थी। E15.5 से E18.5 तक ओसाइट संख्याओं में बड़ी गिरावट पर ध्यान दें। डेटा को एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किए गए थे और एक तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया था, और महत्व बोनफेरोनी के पोस्ट हॉक मल्टीपल तुलना परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था। * पी ≤ 0.05; पी ≤ 0.0001; एनएस >0.05. संक्षिप्त नाम: GCNA = रोगाणु सेल परमाणु अम्लीय peptidase; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: भ्रूण के ओसाइटों में THELINE-1 ORF1p अभिव्यक्ति का पता लगाना और परिमाणीकरण। (ए) मल्टीफोटॉन छवियों से 3 डी रेंडरिंग E15.5 और E18.5 भ्रूण ओसाइट (हरे GCNA द्वारा चिह्नित) में LINE-1 ORF1p (नीले) अभिव्यक्ति दिखाते हैं। (बी) पैनल ए में शीर्ष पंक्ति छवियों का उपयोग करके आईएमएरिस में उत्पन्न 3 डी सतहों। (C) LINE-1 ORF1p तीव्रता विश्लेषण E15.5 की तुलना में E18.5 पर LINE-1 ORF1p प्रति oocyte की उच्च अभिव्यक्ति दिखाता है। स्केल सलाखों = 100 μm; 10 μm (पैनल ए इनसेट); 30 μm (पैनल बी इनसेट). डेटा को एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था और छात्र के टी-टेस्ट द्वारा विश्लेषण किया गया था, और महत्व मान-व्हिटनी यू परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था। पी ≤ 0.0001; एनएस >0.05. संक्षेप: GCNA = रोगाणु सेल परमाणु अम्लीय peptidase; LINE-1 = लंबे समय तक interspersed परमाणु तत्व -1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: कम्प्यूटेशनल सुधार के साथ क्षतिग्रस्त डिम्बग्रंथि के नमूनों में कुल ओसाइट संख्याओं का अनुमान लगाने के लिए विधि। (ए) एक बरकरार अंडाशय में लाल, नीले, ग्रे, मैजेंटा और भूरे रंग में हाइलाइट किए गए पांच 10% क्षेत्रों के साथ जीसीएनए-पॉजिटिव (हरे) ई 15.5 ओसाइटों का मॉडल। प्रत्येक सफल छवि, बरकरार अंडाशय के बाद, 10% वृद्धिशील क्षेत्रों के साथ एक नकली अंडाशय का प्रतिनिधित्व करती है जो 50% तक गायब है। (बी) क्षतिग्रस्त नमूने में ओसाइट संख्या का अनुमान लगाने के लिए कम्प्यूटेशनल विधि की योजनाबद्ध। (c) सिम्युलेटेड अंडाशय में कुल ओसाइट संख्याओं की तुलना मूल अक्षुण्ण अंडाशय (100% माना जाता है) में संख्याओं से की गई थी और अंतर को % विचलन के रूप में प्रस्तुत किया गया है। 10-50% मात्रा के साथ छह व्यक्तिगत अंडाशय से सिमुलेशन गायब है। स्केल सलाखों = 80 μm. संक्षिप्त नाम: GCNA = रोगाणु सेल परमाणु अम्लीय peptidase. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: P5 अंडाशय में 3D रेंडरिंग और 3D मॉडलिंग. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान और बफ़र्स अभिकर्मक (ओं) संयोजन
स्थिरीकारक पैराफॉर्मेल्डिहाइड 4% (v/v)
परमीबिलाइज़ेशन बफ़र Polyvinyl अल्कोहल (PVA) 0.2% (w/v)
सोडियम बोरोहाइड्राइड 0.1% (w/v)
ट्राइटन एक्स-100 1.5% (v/v)
अवरोधित बफर गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) 3% (w/v)
1 एम ग्लाइसिन (पीएच 7.4) 2% (w/v)
ट्राइटन एक्स-100 0.1% (v/v)
200x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1% (v/v)
10% सोडियम एज़ाइड 0.2% (v/v)
बकरी सीरम 10% (v/v)
धुलाई बफर PVA 0.2% (w/v)
ट्राइटन एक्स-100 0.15% (v/v)
10% सोडियम एज़ाइड 0.1% (v/v)
स्केलS4(0) समाधान (pH 8.1) D-Sorbitol 40% (w/v)
यूरिया 24% (w/v)
ग्लिसरॉल 10% (v/v)
DMSO 20% (v/v)
स्केलक्यूबआईसी -1 समाधान यूरिया 25% (w/v)
N, N, N′, N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine 25% (v/v)
ट्राइटन एक्स-100 15% (v/v)
सुक्रोज समाधान शर्करा 20%(w/v)
स्केलक्यूबआईसी -2 समाधान शर्करा 50% (w/v)
यूरिया 25% (w/v)
ट्राइएथेनोलामाइन 10% (w/v)
ट्राइटन एक्स-100 0.1% (v/v)

तालिका 1: समाधान और बफ़र्स।

पूरक चित्रा S1: छवि अधिग्रहण प्राथमिकताओं. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक तालिका S1: छवि अधिग्रहण सेटिंग्स। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह लेख उच्च-थ्रूपुट और रोगाणु कोशिका परिमाणीकरण और प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए तुलनात्मक अध्ययन के लिए प्रसवपूर्व और प्रसवोत्तर अंडाशय के लिए एक विस्तृत 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग और इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हमने अंडाशय (एन = 6-12) में ओसाइट संख्याओं का विश्लेषण करने के लिए इस प्रोटोकॉल को 10-16 विभिन्न उपभेदों में छह विकासात्मक समय बिंदुओं पर विकसित किया है, जहां 2-4 24-अच्छी तरह से प्लेटों को आमतौर पर एक समय में संसाधित किया जाता है। इस विधि को अन्य अंगों या सेलुलर मार्करों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग दैहिक कोशिकाओं को लेबल करने और कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि अंडाशय में ग्रैनुलोसा कोशिकाएं, उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करके, इस प्रकार दैहिक-रोगाणु कोशिका इंटरैक्शन या अन्य डिम्बग्रंथि सेल प्रकारों के विकास के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी संयोजन की एक सीमा विभिन्न कूपिक चरणों की निश्चित पहचान है। ग्रैनुलोसा सेल नाभिक की परतों द्वारा कूपिक चरणों की पहचान करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और 2 डी इमेजिंग में उपयोग किए जाने वाले डीएनए दाग 3 डी दृष्टिकोण के लिए अपर्याप्त हैं। 4', 6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) या Hoechst शायद ही कभी सीमित प्रकाश प्रवेश और बड़े ऊतक के बीच में सड़ने के संकेत के कारण पूरे अंग धुंधला के लिए उपयोग किया जाता है। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) एक छोटा अणु है जो ऊतक में गहराई से प्रवेश करने में सक्षम है, लेकिन वर्णक्रमीय ओवरलैप के कारण मल्टीफोटॉन इमेजिंग सिस्टम पर कब्जा करना मुश्किल है। कूपिक चरणों का बेहतर रिज़ॉल्यूशन ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के लिए विशिष्ट अतिरिक्त मार्करों जैसे एंटी-मुलेरियन हार्मोन (एएमएच) या FOXL247,48 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, हालांकि ये मार्कर बड़े बढ़ते रोम को अलग करने में सहायक हैं, वे प्राथमिक रोम से आदिम को अलग नहीं करेंगे। जब तक इन शुरुआती चरणों के लिए विशिष्ट मार्कर उपलब्ध नहीं हो जाते हैं, तब तक DDX4 या GCNA जैसे ओसाइट मार्कर कूप विकास का सबसे अच्छा संकेतक प्रदान करते हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल प्रसवपूर्व पुरुष गोनाड्स के लिए काम करता है, लेकिन अभी तक प्रसवोत्तर वृषण में परीक्षण नहीं किया गया है जहां इसका आकार सीमित कारक हो सकता है। अलग-अलग आकारों के अंडाशय में रोगाणु कोशिकाओं के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण के लिए महत्वपूर्ण मुद्दों को नीचे सूचीबद्ध किया गया है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले इम्यूनोस्टेनिंग को सुनिश्चित करने के लिए उठाए गए तकनीकों और कदमों पर प्रकाश डाला गया है।

पहला महत्वपूर्ण कदम निर्धारण से पहले और बाद में अंडाशय को नुकसान को रोकने के लिए है। क्षतिग्रस्त अंडाशय में अंग संरचना के कुछ हिस्सों की कमी हो सकती है, जो ओसाइट संख्या को प्रभावित करती है और प्रयोगात्मक परिणामों को तिरछा कर सकती है। क्षति को रोकने के लिए, अंडाशय को स्थानांतरित करने के लिए संदंश के साथ हड़पने के लिए विच्छेदन के बाद अतिरिक्त दैहिक ऊतक को बड़े अंडाशय से जोड़ा जाता है। इसके अलावा, छोटे अंडाशय के लिए, उन्हें एक पिपेट टिप के साथ स्थानांतरित करना जो अंडाशय को आसानी से टिप के भीतर फिट होने के लिए पर्याप्त रूप से चौड़ा काट दिया जाता है, नुकसान से बचा जाता है। यदि अंडाशय के एक हिस्से में मामूली ऊतक क्षति के परिणामस्वरूप गायब हो जाता है, तो इसे एक कम्प्यूटेशनल विधि द्वारा कम किया जा सकता है जहां क्षतिग्रस्त नमूने में कुल ओसाइट संख्या को उसी प्रकार के बरकरार नमूनों का उपयोग करके एक्सट्रपलेटेड किया जा सकता है (चित्रा 6)।

हालांकि, कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन से पता चला कि भविष्यवाणी की सटीकता क्षतिग्रस्त क्षेत्र के बढ़ते आकार के साथ कम हो जाती है (0.2 ± 100.8%, 1.5 ± 97.2% और 90.3% ± 10, 20, और 30% क्षति के लिए 1, क्रमशः चित्रा 6 सी)। सिमुलेशन के आधार पर, हम अनुशंसा करते हैं कि >30% हानि वाले नमूनों को विश्लेषण से बाहर रखा जाए। एक ही नमूना प्रकार से एकाधिक बरकरार अंडाशय का उपयोग क्षतिग्रस्त नमूने में लापता एक के समान क्षेत्र में ओसाइटों की औसत संख्या की गणना करने के लिए किया गया था। इस संख्या का उपयोग तब क्षति के साथ अंडाशय में ओसाइट की कुल संख्या की भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था। एक ही अंडाशय में समान आकार के क्षेत्र का उपयोग करना जो लापता क्षेत्र को रोकता है, एक विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है लेकिन इसका परीक्षण नहीं किया गया था।

एक और मुद्दा उन कोशिकाओं को दूषित करने से बचना है जो ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बन सकते हैं। प्यूबर्टल अंडाशय के लिए, परफ्यूजन, जैसा कि ऊपर वर्णित है, दोनों 1x पीबीएस और 1% पीएफए के साथ रक्त कोशिकाओं को खत्म करने के लिए किया जाना चाहिए जो ऑटोफ्लोरेसेंस (चित्रा 2 सी) का कारण बनेंगे। पीबीएस के साथ परफ्यूजन तब तक जारी रहना चाहिए जब तक कि अंगों, विशेष रूप से अंडाशय और गुर्दे, रक्त से साफ नहीं हो जाते हैं और 1% पीएफए (चित्रा 1 ई, एफ) पर स्विच करने से पहले सफेद हो जाते हैं। पीबीएस के साथ अक्षम परफ्यूजन के परिणामस्वरूप एक उच्च पृष्ठभूमि होगी जो मास्क कर सकती है और छोटे ओसाइटों के विज़ुअलाइज़ेशन को मुश्किल बना सकती है। पीएफए के कम (1%) या उच्चतर (4%) प्रतिशत के साथ परफ्यूजन के परिणामस्वरूप अकेले पीबीएस के साथ परफ्यूजन की तुलना में बेहतर छवि गुणवत्ता होती है; इसलिए, पीएफए के कम प्रतिशत का उपयोग किया गया था।

एंटीबॉडी धुंधला के अनुकूलन के लिए कई चर पर ध्यान देने की आवश्यकता होती है। Permeabilization कदम के लिए, 4 ज इस परख के लिए आदर्श होने के लिए पाया गया था, 4 ज (6-8 ज परीक्षण) से अधिक अवधि के साथ कोई धुंधला नहीं है जिसके परिणामस्वरूप कोई धुंधला नहीं है। क्योंकि बड़े पैमाने पर इम्युनोस्टेनिंग प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की मात्रा और लागत अधिक हो सकती है, इसलिए इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था और इम्यूनोस्टेनिंग गुणवत्ता के किसी भी नुकसान के बिना एंटीबॉडी मिश्रणों का पुन: उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया था। पुन: उपयोग के लिए, एंटीबॉडी मिश्रण को प्रोटोकॉल में वर्णित ताजा एंटीबॉडी के साथ पूरक किया जाना चाहिए। धोने के कदम भी immunostaining की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण हैं और इमेजिंग के दौरान एक बेहतर संकेत-से-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए लंबे समय तक प्रदर्शन किया जाना चाहिए और पसंद के प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, हम प्रत्येक उपयोग के लिए तराजू 4 (0) समाशोधन समाधान को नए सिरे से तैयार करने की सलाह देते हैं, जबकि स्केलक्यूबिक -1 और स्केलक्यूबिक -2 को ~ 1-2 महीने के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

ScaleCUBIC-1 समाशोधन 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है; महत्वपूर्ण रूप से, उच्च तापमान से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे अभिकर्मक वर्षा में परिणाम करेंगे, जो इम्यूनोस्टेनिंग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। इमेजिंग के लिए कई नमूनों को बढ़ाना समय लेने वाला हो सकता है। अन्य प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले आगर या अन्य एम्बेडिंग विधियां श्रम-गहन हैं औरउन्हें 47,49,50 नमूनों के अतिरिक्त पुन: समाशोधन की आवश्यकता हो सकती है। पुन: प्रयोज्य सिलिकॉन गैस्केट्स का उपयोग चिपकने वाले कुओं के रूप में किया जा सकता है जो कवरलिप के साथ उपयोग करने में आसान हैं और अन्य नमूना आकारों को समायोजित करने के लिए विभिन्न आकारों और गहराई में पेश किए जाते हैं। उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए, समाशोधन समाधान की पर्याप्त मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए; बहुत कम खराब छवि गुणवत्ता में परिणाम होगा, और बहुत अधिक समाधान माइक्रोस्कोप पर रिसाव कर सकते हैं. इस चरण को उनके आकार के आधार पर विशिष्ट नमूनों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। ग्लास-बॉटम व्यंजनों का उपयोग किया जा सकता है लेकिन नमूनों को इमेजिंग के लिए स्थिर किया जाना चाहिए क्योंकि यहां तक कि थोड़ी सी भी आंदोलनों से छवि विकृत हो जाएगी। सिलिकॉन gaskets एक ग्लास नीचे पकवान और शीर्ष coverslip इमेजिंग के लिए नमूनों को स्थिर करने के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह नमूने को फ्लिप करने की क्षमता को सीमित करेगा यदि अंडाशय के आकार के कारण दोनों तरफ से इमेजिंग की आवश्यकता होती है।

इस बड़े पैमाने पर, उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण के लिए एक और महत्वपूर्ण विकल्प दो ट्यूनेबल स्पेक्ट्रा-फिजिक्स मल्टीफोटॉन (एमपी) लेजर के साथ लीका डाइव / 4TUNE / फाल्कन प्लेटफ़ॉर्म पर इमेजिंग था। DIVE प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करने के लाभों में नमूना बढ़ते (ऊपर वर्णित) की आसानी, ऑप्टिकल विरूपण को कम करना (confocal प्लेटफ़ॉर्म की तुलना में), और सबसे महत्वपूर्ण बात, इमेजिंग गति और अधिग्रहित छवि डेटा का प्रबंधन शामिल है। उच्च आवर्धन (16x) पर मल्टीफोटॉन लेजर के साथ इमेजिंग नमूने बहुत तेज है और एलएएस एक्स सॉफ्टवेयर के साथ छवि अधिग्रहण के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करके Leica DIVE या SP8 पर कॉन्फोकल लेजर की तुलना में कम photodamage का कारण बनता है। एमपी बीम कम है, इसकी फ्लोरोफोर उत्तेजना केंद्र बिंदु पर अत्यधिक स्थानीयकृत है और स्थानिक / अक्षीय इमेजिंग चरणों की उच्च संख्या के बावजूद फोटोडैमेज को प्रभावित किए बिना कम आवर्धन पर अधिक गहराई प्राप्त करती है (कॉन्फोकल: ~ 300-400 वर्गों को अधिकतम रूप से, एमपी: >800 वर्गों)।

16x / NA0.6 उद्देश्य एक यांत्रिक सुधार कॉलर के माध्यम से ऑप्टिकल अक्ष के साथ नमूना और माउंटेंट वितरण के कारण मामूली अपवर्तक सूचकांक बेमेल के लिए सुधार की अनुमति देता है, जो अधिकतम संकेत के लिए इष्टतम रूप से सेट किया जाता है, नमूने में आधे रास्ते। इसके अलावा, गोलाकार संरचनाओं, जैसे कि ओसाइट, को कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण द्वारा विकृत किया जा सकता है क्योंकि किसी दिए गए पिनहोल सेटिंग पर माउंटेंट और नमूना अपवर्तक सूचकांक बेमेल के कारण कॉन्फोकल प्लेन (सिग्नल) की गहराई-निर्भर स्थानीयकरण हो सकता है (चित्रा 2 डी)। जैसा कि प्रतिदीप्ति संकेत को आउट-ऑफ-फोकस सिग्नल को हटाने के लिए उपकरण के आंतरिक पिनहोल के माध्यम से कब्जा किया जा रहा है, आंतरिक ऑप्टिकल विरूपण (गोलाकार विपथन) नमूने में गहरा हो सकता है, जो बड़े अंडाशय (यानी, ~ 400-600 माइक्रोमीटर मोटाई) के लिए समस्याग्रस्त है।

एक ही मिलान लेंस-सुधार सेटिंग्स के साथ, अलग-अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ DIVE एमपी सिस्टम पर लगभग कोई गोलाकार विपथन का पता नहीं लगाया जा सकता है, इस प्रकार परिमाणीकरण और सह-स्थानीयकरण अध्ययन (चित्रा 2 डी) को सरल बनाया जा सकता है। अंत में, उच्च शक्ति स्पंदित लेजर नमूने के अंदर रोमांचक कम फ्लोरोफोर एकाग्रता के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से, जब इसका उपयोग जेड-गहराई उत्तेजना सुधार के साथ किया जाता है। इसके अलावा, कमजोर संकेतों पर कब्जा भी एमपी हाइब्रिड डिटेक्टर (HyD-RLDs) द्वारा बढ़ाया जाता है, जो नियमित रूप से फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों और हिमस्खलन फोटॉन-गिनती डिटेक्टरों का एक संयोजन है, जो उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला पर 30 गुना से अधिक उच्च सिग्नल का पता लगाने की अनुमति देता है।

लाइट शीट (एलएस) मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी ऊतक इमेजिंग47 के लिए एक और उभरता हुआ मंच है। हालांकि, एलएस मैक्रोस्कोपिक नमूनों के लिए अधिक सेटअप समय की मांग करता है, जिसमें अगर एम्बेडिंग और इमेजिंग के लिए सेट अप शामिल है। इसके अलावा, नमूना रोटेशन के साथ उच्च आवर्धन पर अधिग्रहित छवियां बड़ी >100 जीबी फाइलें उत्पन्न कर सकती हैं, जो प्रकाश शीट छायांकन कलाकृतियों को हटाने के लिए आवश्यक हो सकती हैं (बाहरी माध्यम के अपवर्तक सूचकांक बेमेल और नमूने के इंटीरियर के कारण, या नमूना-सतह विकृतियों)। चिपकने वाले कुओं में समाधान में बढ़ते नमूनों की प्रस्तुत विधि सरल और तेज है।

इसके अलावा, यह दृष्टिकोण एक सेटअप के साथ एक अच्छी तरह से और फ़्लिपिंग या रोटेशन के बिना एक में कई अंडाशय की इमेजिंग की अनुमति देता है। हालांकि, बड़े अंडाशय के लिए कवरस्लिप "सैंडविच" को फ्लिप करने की आवश्यकता हो सकती है। DIVE सिस्टम इमेजिंग confocal और LS की तुलना में तेज है; 16x आवर्धन पर, prepubertal अंडाशय 3-5 मिनट (Z-चरण 2 μm) और 1 h (Z-चरण 5 μm) में pubertal अंडाशय में चित्रित किया जाता है। इसके अलावा, एलएएस एक्स में उत्पन्न फ़ाइलें प्रबंधनीय आकार (2-20 जीबी) की हैं, जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में नमूनों के लिए भी महत्वपूर्ण है। यद्यपि इस इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल को DIVE प्लेटफ़ॉर्म के साथ संयोजन में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, immunosstained नमूनों को कुछ संशोधनों के साथ अन्य MP / LS प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है।

3 डी मॉडलिंग प्रोटोकॉल के साथ पूरे अंडाशय धुंधला का लाभ 2 डी विश्लेषण में मैनुअल डेटा अधिग्रहण की तुलना में कुशल और अपेक्षाकृत आसान डेटा विश्लेषण है। IMARIS 3D विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को चुना गया था क्योंकि यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और कई माइक्रोस्कोपी कोर द्वारा पेश किया जाता है, प्रोग्रामिंग कौशल की आवश्यकता नहीं होती है, और कई छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म जैसे कि Leica से LAS X या ZEISS से ZEN के साथ संगत है। आईएमएरिस के साथ, मानक पैरामीटर प्रोटोकॉल अनुभाग में हाइलाइट किए गए के रूप में सेट किए जाते हैं, और इन मापदंडों का उपयोग अन्य छवियों और नमूनों के लिए मामूली परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, इस प्रकार पुनरुत्पादन और दक्षता में सुधार होता है।

छवि विश्लेषण और परिमाणीकरण IMARIS सॉफ्टवेयर के लिए अनुकूलित कर रहे हैं; हालांकि, इसी तरह के विश्लेषण समान सिद्धांतों का पालन करते हुए अन्य वाणिज्यिक या ओपन-सोर्स डेटा विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर पर किए जा सकते हैं। अंत में, मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए पूरे अंडाशय को इमेजिंग करने के लिए यहां एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह उद्देश्यपूर्ण रूप से उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण की मांगों के लिए अनुकूलित किया गया था जो विष विज्ञान परीक्षण, नैदानिक और नैदानिक उद्देश्यों, और डिम्बग्रंथि पर्याप्तता और कार्य के नियामकों के जीनोम-व्यापी विश्लेषण के लिए तेजी से आवश्यक होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान (R01 HD093778 से E.B-F और T32 HD007065 से R.B. तक) द्वारा समर्थित किया गया था। हम विकिरण प्रयोग के साथ उनकी सहायता के लिए Zachary Boucher धन्यवाद. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मैरी एन हैंडेल को धन्यवाद देते हैं। हम कृतज्ञतापूर्वक इस प्रकाशन में वर्णित माइक्रोस्कोपी काम के साथ विशेषज्ञ सहायता के लिए जैक्सन प्रयोगशाला में सोनिया इराटुपुझा और माइक्रोस्कोपी कोर सेवा के योगदान को स्वीकार करते हैं और 3 डी-मुद्रित एडेप्टर स्लाइड को डिजाइन करने के लिए जैक्सन प्रयोगशाला में वैज्ञानिक साधन सेवाओं से जारेक ट्रैप्सजो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 175
माउस में डिम्बग्रंथि रिजर्व के विकासशील डिम्बग्रंथि रिजर्व के मात्रात्मक 3 डी विश्लेषण के लिए पूरे अंडाशय Immunofluorescence, समाशोधन, और Multiphoton माइक्रोस्कोपी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter