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Developmental Biology

Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

Nous présentons ici un protocole optimisé pour l’imagerie d’ovaires entiers pour des analyses quantitatives et qualitatives utilisant l’immunocoloration à montage entier, la microscopie multiphotonique et la visualisation et l’analyse 3D. Ce protocole prend en charge un traitement à haut débit, fiable et reproductible applicable à la toxicologie, au diagnostic clinique et aux tests génomiques de la fonction ovarienne.

Abstract

La fertilité féminine et la durée de vie reproductive dépendent de la qualité et de la quantité de la réserve d’ovocytes ovariens. On estime que 80% des cellules germinales femelles entrant dans la prophase méiotique I sont éliminées pendant l’attrition ovocytaire fœtale (FOA) et la première semaine de vie postnatale. Trois mécanismes majeurs régulent le nombre d’ovocytes qui survivent pendant le développement et établissent la réserve ovarienne chez les femmes entrant dans la puberté. Dans la première vague de perte d’ovocytes, 30 à 50% des ovocytes sont éliminés au début de la FOA, un phénomène attribué à une expression élevée de l’élément nucléaire intercalaire long (LINE-1). La deuxième vague de perte d’ovocytes est l’élimination des ovocytes présentant des défauts méiotiques par un point de contrôle de qualité méiotique. La troisième vague de perte d’ovocytes se produit périnatalement lors de la formation de follicules primordiaux lorsque certains ovocytes ne parviennent pas à former des follicules. On ne sait toujours pas ce qui régule chacune de ces trois vagues de perte d’ovocytes et comment elles façonnent la réserve ovarienne chez la souris ou l’homme.

L’immunofluorescence et la visualisation 3D ont ouvert une nouvelle voie pour imager et analyser le développement des ovocytes dans le contexte de l’ensemble de l’ovaire plutôt que dans des sections 2D moins informatives. Cet article fournit un protocole complet pour l’immunocoloration des ovaires entiers et le nettoyage optique, produisant des préparations pour l’imagerie à l’aide de la microscopie multiphotonique et de la modélisation 3D à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce. Il montre comment cette méthode peut être utilisée pour montrer la dynamique de l’attrition ovocytaire au cours du développement ovarien chez les souris C57BL / 6J et quantifier la perte d’ovocytes au cours des trois vagues d’élimination des ovocytes. Ce protocole peut être appliqué aux ovaires prénataux et postnatals précoces pour la visualisation et la quantification des ovocytes, ainsi qu’à d’autres approches quantitatives. Il est important de noter que le protocole a été stratégiquement développé pour permettre un traitement à haut débit, fiable et reproductible qui peut répondre aux besoins en toxicologie, en diagnostic clinique et en tests génomiques de la fonction ovarienne.

Introduction

La plupart des femelles mammifères naissent avec un nombre fini d’ovocytes arrêtés méiotiquement stockés dans des follicules primordiaux, constituant la réserve ovarienne (RC)1,2. La RO détermine la durée de vie reproductive globale et la santé des femmes3. La salle d’opération diminue normalement en taille avec le vieillissement et peut être épuisée prématurément lors de l’exposition à certains agents génotoxiques (radiothérapie / chimiothérapie) et à des stress environnementaux (malnutrition), conduisant à l’infertilité 4,5,6. L’infertilité féminine idiopathique peut souvent être attribuée à la qualité génétique et physiologique des ovules qui se développent à partir de la salle d’opération et reste mal comprise 7,8. Étant donné que la dotation en follicules féminins est largement prédéterminée par la naissance, il est essentiel de comprendre les mécanismes de régulation impliqués dans l’établissement et l’entretien de la salle d’opération.

Chez la souris, la formation de RO commence par la spécification des cellules germinales primordiales (PGC) autour du jour embryonnaire (E) 7,52. Les PGC migrent vers les crêtes génitales, où ils résideront vers E10,59. La prolifération étendue suivante se produit avec une cytocinèse incomplète entraînant la formation de kystes qui seront décomposés plus tard dans le développement10,11. À environ E12,5, le sexe gonadique est déterminé et la prolifération de la PGC s’arrête dans les ovaires. Chez les femelles, les PGC, maintenant des ovocytes, entrent dans la prophase méiotique I (MPI) à environ E13,512,13. Les ovocytes progressent grâce à une MPI prolongée et à un arrêt au stade du dictyat au moment de la naissance. Au cours de la première semaine après la naissance, chaque ovocyte arrêté est entouré de cellules de granulosa, formant ainsi un follicule primordial.

Le nombre de follicules primordiaux dans la salle d’opération d’une femme dépend du nombre d’ovocytes qui ont survécu aux vagues d’élimination des ovocytes qui se produisent avant et pendant l’arrêt de la MPI par apoptose, autophagie ou nécrose14,15. La première vague se produit pendant le développement du fœtus et est connue sous le nom de FOA. Le FOA est un processus conservé de manière évolutive chez les femelles (mammifères et non mammifères), par lequel environ 50 à 80% des ovocytes sont éliminés en fonction des espèces femelles 16,17,18,19. Chez la souris, le FOA se produit au cours de E15,5 à E18.5 et a été attribué à la réactivation et à l’expression de séquences de rétrotransposon LINE-1 provoquant la mort des ovocytes20,21. La deuxième vague d’élimination des ovocytes se produit par un point de contrôle méiotique qui élimine les ovocytes présentant des défauts méiotiques tels que les cassures double brin d’ADN non réparées (DSB)22,23. La prochaine vague d’élimination des ovocytes se produit lors de la dégradation des kystes, culminant lors de la formation de follicules primordiaux, dont chacun contient un seul ovocyte 10,11,24,25.

Chez la souris, la réserve de follicules primordiaux est largement établie par la puberté, après quoi elle diminue à mesure que les follicules primordiaux sont activés pour la croissance au cours des cycles de reproduction réguliers. La taille de la salle d’opération varie d’une femme à l’autre et de différentes souches génétiques de souris; pourtant, la régulation génétique de la taille des salles d’opération n’est pas bien comprise 26,27,28,29. Les études génétiques de la régulation de la RO sont entravées par l’absence de protocoles standardisés pour étudier les vagues d’élimination des ovocytes au cours du développement prénatal et postnatal. Plusieurs méthodes de quantification des ovocytes ont été développées chez la souris, la plus courante et la plus largement utilisée étant l’évaluation histomorphométrique des sectionshistologiques 30,31. Dans cette technique, les ovocytes sont identifiés sur des coupes en série avec des taches histologiques, telles que l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et l’acide-Schiff périodique (PAS) ou des marqueurs fluorescents. Cette technique est fiable si toutes les conditions restent constantes, y compris l’épaisseur de la section, la récupération efficace de toutes les sections dans l’ovaire et les schémas de comptage des laboratoires individuels. Cependant, les chiffres rapportés par les différents laboratoires diffèrent souvent de manière significative et ne sont donc pas facilement comparables.

De plus, compte tenu des différences génétiques, l’utilisation de différentes souches de souris peut également influencer le nombre d’ovocytes. D’autres approches computationnelles ont été développées pour l’évaluation histomorphométrique et comprennent la détection automatisée des ovocytes à l’aide de l’approche du fractionneur, le comptage automatique à l’aide d’algorithmes informatiques et la reconstruction 3D d’images histologiques pour éviter le comptage multiple du même ovocyte 31,32,33,34,35,36 . Même avec ces améliorations ajoutées à l’évaluation histomorphométrique, la technique est relativement exigeante en main-d’œuvre, en particulier pour les études à grande échelle et à haut débit. Les données recueillies peuvent ne pas être reproductibles et comparables entre les études en raison des différences dans les schémas de comptage, les algorithmes informatiques et les logiciels utilisés.

Récemment, accélérées par le développement de nouvelles méthodes de microscopie multiphotonique et de feuille de lumière à moyenne résolution et de nettoyage optique des tissus, les techniques de modélisation et d’analyse 3D pour les ovaires intacts deviennent la méthode de choix pour quantifier efficacement le nombre d’ovocytes et étudier la localisation et la dynamique des protéines37,38. Ces méthodes 3D sont généralement avantageuses par rapport aux méthodes histologiques car les tissus et les organes sont mieux conservés et conservés intacts. De plus, l’analyse et la modélisation 3D fournissent des informations supplémentaires sur la fonction et les interactions au sein et entre les niches ou sous-structures cellulaires de l’organe qui peuvent être manquées dans l’analyse 2D.

L’analyse 3D d’organes entiers nécessite une optimisation des protocoles de fixation, d’immunocoloration et de nettoyage optique pour des organes individuels, tels que les ovaires, sans distorsion ou dommage tissulaire. Une optimisation supplémentaire du montage de l’échantillon pour l’imagerie est nécessaire pour la microscopie à haute résolution et peut dépendre de la plate-forme d’imagerie disponible. Enfin, l’imagerie de l’ensemble de l’ovaire intact génère une grande quantité de données pour les analyses informatiques ultérieures. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes 3D standardisées pour compter les ovocytes pour les études comparatives et à tous les stades de développement.

Ce protocole utilise des protocoles d’immunocoloration standard et de compensation précédemment rapportés, en se concentrant sur une approche simple, conviviale et à haut débit 38,39,40,41. Le protocole est optimisé pour analyser un grand nombre d’ovaires prénataux et postnatals jusqu’au jour postnatal 28 (P28) et différentes tailles d’ovaires de différents milieux génétiques de souris. Les étapes d’immunocoloration sont similaires pour toutes les étapes; cependant, les protocoles de clairance diffèrent pour les ovaires pubertaires en raison de leur plus grande taille, ScaleS4(0) et CUBIC pour les petits et grands ovaires, respectivement40,41. En outre, la perfusion du corps entier est effectuée chez les souris P28 avant la fixation pour prévenir l’autofluorescence des cellules sanguines. Un microscope multiphoton a été construit sur la plate-forme Leica DIVE/4Tune comme alternative à la microscopie à feuille de lumière pour acquérir des images, et le logiciel de visualisation et d’analyse 3D IMARIS avec divers outils analytiques a été choisi pour ce protocole. Ce protocole est simple à suivre et moins pratique, ce qui permet de gagner du temps. De plus, la quantification des ovocytes est relativement rapide, en fonction de la taille de l’ovaire et de la disposition des ovocytes.

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Protocol

Toutes les souris utilisées étaient de la souche génétique C57BL/6J (voir la table des matériaux). Cette souche a été entièrement séquencée et est la norme pour de nombreuses études sur la structure et la fonction ovariennes. Les souris ont été hébergées conformément aux directives des NIH et les procédures effectuées ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Jackson Laboratory. Les réactifs et les compositions utilisés dans ce protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux et le tableau 1, respectivement.

1. Préparation des réactifs

  1. Fixateur: Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x PBS. Par exemple, pour 24 échantillons (0,5 mL/échantillon = 12 mL de volume total), ajoutez 3 mL de 16 % de qualité microscopique électronique PFA à 9 mL de 1x PBS.
  2. Tampon de perméabilisation
    1. Mesurez l’alcool polyvinylique (PVA) dans un bécher en plastique de 250 mL contenant 1x PBS la veille de la nécessité du tampon de perméabilisation. Remuer la solution pendant la nuit pour permettre au PVA de se dissoudre complètement.
    2. Ajouter le borohydrure de sodium au PVA dissous et laisser le mélange s’homogénéiser pendant environ 3 à 5 min. Attendez-vous à ce que la solution mousse.
    3. Ajoutez Triton X-100 à la solution et utilisez le tampon une fois le Triton X-100 dissous.
      REMARQUE: PVA prend beaucoup de temps à se dissoudre (au moins 3 h), et la pénétration de l’anticorps dépend de la façon dont il se dissout. Pour les ovaires plus gros, il est crucial de dissoudre complètement le PVA.
  3. Blocage de la mémoire tampon
    1. Mesurer l’albumine sérique bovine (BSA) dans un bécher avec 1x PBS. Remuer la solution jusqu’à ce que le BSA soit dissous.
    2. Ajouter la glycine, le triton X-100, la pénicilline-streptomycine et l’azoture de sodium. Remuer jusqu’à ce que la solution s’homogénéise. Transférer le tampon dans une bouteille et conserver à 4 °C. Ajouter le sérum de chèvre normal avant utilisation.
  4. Tampon de lavage: Mesurez le PVA dans un bécher contenant 1x PBS. Remuer la solution pendant la nuit pour permettre au PVA de se dissoudre. Ajouter Triton X-100 et l’azoture de sodium. Une fois le tampon mélangé, conservez-le à 4 °C.
  5. Solution ScaleS4(0) (pH 8,1) : Dissoudre le D-sorbitol dans du PBS dans un bécher en remuant à ≤100 °C. Ajouter l’urée à la solution, et une fois que l’urée se dissout, éteindre le feu et laisser la solution remuer jusqu’à dissolution complète. Ajouter le glycérol et le sulfoxyde de diméthyle et remuer jusqu’à ce que la solution s’homogénéise. Conservez la solution à température ambiante dans l’obscurité.
    REMARQUE: La solution ScaleS4(0) doit être préparée à nouveau le premier jour de l’élimination des ovaires.
  6. Solution ScaleCUBIC-1
    1. Dissoudre l’urée dans un bécher contenant du PBS sous agitation à température ≤100 °C. Mesurer la N,N,N′,N′-tétrakis(2-hydroxypropyl)éthylènediamine dans un bécher séparé, puis ajouter l’urée dissoute et agiter à une température de ≤100 °C jusqu’à dissolution complète des réactifs. Une fois que tous les réactifs sont en solution, éteignez le chauffage et refroidissez à température ambiante. Conserver dans le noir.
    2. Dégazez la solution en la transférant dans une fiole filtrante. Fixez la fiole à un vide avec un tube, couvrez la fiole et allumez le vide jusqu’à ce que les bulles dans la solution disparaissent. Utilisez la solution après ce dégazage.
      REMARQUE: La solution peut être stockée dans l’obscurité pour être utilisée jusqu’à un mois.
  7. Solution de saccharose: Dissoudre le saccharose dans 1x PBS; puis dégazez la solution avant utilisation.
    REMARQUE: Préparez la solution fraîchement avant utilisation.
  8. Solution ScaleCUBIC-2
    1. Dissoudre le saccharose dans un bécher contenant du PBS en remuant à une température ≤100 °C. Ajouter l’urée et remuer à une température de ≤100 °C jusqu’à dissolution de l’urée. Éteignez le feu.
    2. Ajouter la triéthanolamine et le Triton X-100. Remuer jusqu’à ce que la solution s’homogénéise. Laisser refroidir la solution à température ambiante et la conserver dans l’obscurité. Dégazez la solution avant de l’utiliser.
      REMARQUE: La solution peut être stockée dans l’obscurité pour être utilisée jusqu’à un mois.

2. Dissection et fixation des ovaires prénataux (Figure 1A)

  1. Accoupler les femelles adultes (≥8 semaines) et les mâles selon le protocole institutionnel approuvé. Vérifiez les bouchons vaginaux tous les matins.
    REMARQUE: Le matin d’un bouchon vaginal est désigné comme 0,5 jour après le coitum (d.p.c) ou E0.5.
  2. Le jour de la dissection, préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) et aliquote ~0,5 mL dans des tubes de microcentrifugation, placés du côté du banc (~4 par femme enceinte).
    REMARQUE: PFA est une substance dangereuse et doit être manipulé sous une hotte chimique.
  3. Préparer trois plaques de 100 mm contenant environ 10 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour chaque femelle enceinte (pour la récolte de l’utérus, pour disséquer le complexe mésonéphros-ovaire et isoler les ovaires).
  4. Euthanasier les femelles gravides qui portent des embryons du stade de développement préféré et procéder à la dissection. Euthanasier pas plus de 1-2 femelles à la fois. Utilisez un protocole approuvé pour l’euthanasie des souris gravides (p. ex., exposition au CO2 suivie d’une luxation cervicale).
  5. Une fois qu’une femelle est euthanasiée, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70%. À l’aide d’une pince, soulevez la peau abdominale et utilisez des ciseaux pour faire une incision en forme de V à travers l’abdomen et la paroi du corps. Coupez le long des deux côtés de l’incision et pelez la peau pour exposer les organes internes et les fœtus dans l’utérus.
  6. Avec des pinces et des ciseaux, coupez et séparez l’utérus avec les fœtus de la graisse abdominale et des artères et veines ovariennes. Retirez l’utérus et placez-le dans une plaque de 100 mm contenant 1x PBS. Libérez les fœtus dans le PBS en coupant la paroi utérine et en perforant le sac vitellin. Coupez le cordon ombilical.
    REMARQUE: Pour les fœtus de moins de 15 jours de gestation, l’euthanasie de la mère et le retrait de l’utérus assurent une mort rapide du fœtus. Les fœtus âgés de plus de 15 jours de gestation à la naissance doivent être euthanasiés par décapitation.
  7. Transférez un fœtus dans une nouvelle assiette avec 1x PBS frais. Pour décapiter un fœtus E15.5, épinglez délicatement les deux membres postérieurs sur la plaque avec une pince pour immobiliser le fœtus. À l’aide d’une deuxième paire de pinces tenue dans la main dominante, tenez le cou entre les broches de la pince et serrez pour couper la tête du fœtus, ou utilisez des ciseaux pour couper le cou.
  8. Avec les pinces à main dominantes, coupez sous les membres antérieurs et retirez doucement le haut du corps. Ensuite, insérez un point final de la pince à main dominante dans la cavité péritonéale verticalement dans l’ouverture de la région abdominale tandis que l’autre extrémité de la pince reste à l’extérieur. Fermez la pince, pincez la paroi du corps pour la couper et exposez les organes internes.
  9. Avec la même pince, retirez doucement les organes, y compris les intestins et le foie, jusqu’à ce que le rein et les organes reproducteurs deviennent visibles. Déterminez le sexe du fœtus: à E15.5, les ovaires ont une forme allongée en forme de saucisse tandis que les testicules sont ovales.
    REMARQUE: À des stades plus précoces, un génotypage peut être nécessaire pour déterminer le sexe.
  10. À l’aide d’une paire de pinces, maintenez le fœtus femelle vers le bas et utilisez les autres pinces pour saisir chaque complexe mésonéphros-ovaire et le séparer doucement des reins et des canaux müllériens. Placez les ovaires dans une nouvelle plaque avec 1x PBS, laissez les mésonéphros attachés, mais retirez les tissus environnants pour vous assurer que les ovaires sont exposés. Placer les deux ovaires dans ~0,5 mL de PFA à 4% dans des tubes de microcentrifugation et fixer à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le PFA par de l’éthanol à 70 %.
  11. Pour la dissection et la fixation des ovaires E18.5, séparez les fœtus de l’utérus comme décrit ci-dessus, puis suivez le protocole pour les petits prépubères décrit à la rubrique 3 (Figure 1B).

3. Dissection et fixation des ovaires prépubères (Figure 1B)

  1. Préparez 4% de PFA et aliquote ~0,5 mL dans des tubes de 1,5 mL et placez-les du côté du banc (~un tube par chiot). Préparez des assiettes de 35 mm avec 1x PBS (~un par chiot). Euthanasier les chiots en utilisant le protocole institutionnel approuvé.
    REMARQUE: La décapitation est la méthode préférée d’euthanasie pour les souris de 8 jours ou moins. Les souris néonatales peuvent être décapitées à l’aide de ciseaux disséquants de 3 à 4 pouces ou de ciseaux Mayo de 5 à 7 pouces.
  2. Déterminez le sexe des petits en mesurant la distance anogénitale, qui est plus grande chez les mâles que chez les femelles. Utilisez des ciseaux de décapitation tranchants pour décapiter les chiots femelles. Placez le corps, côté ouvert vers le bas, sur une serviette en papier pour drainer le sang (~ 5-10 s).
  3. Fixez le chiot sur son dos en plaçant une épingle dans le coussinet de chaque pied. Vaporiser l’abdomen avec 70% d’éthanol. Utilisez des pinces pour tenir la peau du chiot loin du corps et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision en forme de V dans la peau du bas-ventre.
  4. Insérez les ciseaux dans l’incision sous la peau et coupez le long des deux côtés de l’abdomen. Utilisez la pince pour peler doucement la peau et révéler le bas-ventre. Déplacez doucement l’intestin vers le haut et localisez les cornes utérines à côté de la vessie. Suivez chaque corne utérine vers le rein et localisez l’ovaire avec le tissu adipeux environnant sous chaque rein.
  5. Pour disséquer les ovaires, maintenez la corne utérine sous l’ovaire et l’oviducte avec une paire de pinces (forceps A, Figure 1B) et soulevez-la doucement du corps. À l’aide d’une autre paire de pinces (pince b), saisissez doucement sous la première paire de pinces afin que l’ovaire et l’oviducte dans le coussinet adipeux soient visibles au-dessus de la deuxième paire de pinces. Ensuite, coupez sous la deuxième paire de pinces avec des ciseaux ou tirez soigneusement pour détacher les ovaires et les tissus attachés.
  6. Placez les organes isolés dans une plaque avec 1x PBS. Coupez le tissu adipeux supplémentaire, l’oviducte et la corne utérine pour nettoyer et isoler l’ovaire. Ouvrez délicatement la bourse entourant l’ovaire et exposez l’ovaire entier.
  7. Coupez la membrane de la bourse sans endommager l’ovaire et laissez du tissu autour du hile (structure ligamentaire entre l’ovaire et l’appareil reproducteur) pour manipuler l’ovaire, comme le montre la figure 1B, P5. Une fois les ovaires coupés, placez-les dans 4% de PFA et fixez les ovaires à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, remplacez 4 % de PFA par de l’éthanol à 70 % et conservez les ovaires à 4 °C jusqu’à l’étape du protocole d’immunocoloration.

4. Perfusion, dissection et fixation des ovaires pubertaires (Figure 1C)

  1. Perfuser des souris selon des protocoles approuvés par l’institution avec la souris sous anesthésie profonde dans une hotte chimique. Préparez l’équipement de perfusion et les réactifs. Voir le protocole détaillé à la p. 42.
    REMARQUE: La perfusion est une procédure d’euthanasie terminale qui remplace le sang dans tout le système vasculaire par un fixateur tissulaire.
  2. Pesez une souris femelle pubertaire (P28) et enregistrez le poids de la souris (généralement entre 13 g et 15 g). Calculer la quantité de l’agent anesthésique approuvé à utiliser.
    REMARQUE: Ici, 0,35 mL de tribromoéthanol par 10 g de poids corporel a été utilisé dans ce protocole.
  3. Utilisez une seringue jetable de 10 mL avec une aiguille de 20 G pour remplir la seringue avec l’agent anesthésique approuvé. Remplacez l’aiguille de 20 G par une aiguille de 26 G x 3/8.
  4. Retenez soigneusement la souris en frottant la peau du cou dorsal d’une seule main. Tournez la souris pour exposer l’abdomen. Injecter la quantité d’anesthésique précédemment calculée dans la cavité péritonéale. Placez la souris dans un récipient avec un couvercle jusqu’à ce que l’anesthésie prenne effet (c.-à-d. que la souris ne bouge plus).
  5. Une fois que la souris cesse de bouger, pincez doucement ses pieds pour vérifier qu’il n’y a pas de réponse et assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée avant de commencer la perfusion. Placez et fixez la souris sur son dos en épinglant doucement les quatre pattes à travers les coussinets de pattes sur une planche. Assurez-vous que les jambes sont épinglées dans une position détendue, et non trop étirées.
  6. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70% de l’abdomen à la région thoracique. Utilisez des pinces pour pincer et soulever doucement la peau abdominale, puis utilisez des ciseaux pour faire une petite coupe en forme de V à travers la peau et la paroi du corps.
  7. Soulevez le lambeau de peau de la cavité corporelle et insérez les ciseaux sous la peau et la paroi du corps. Coupez la peau et la paroi du corps directement vers la tête jusqu’au bord de la cavité thoracique au niveau du sternum.
  8. Ouvrez la cavité thoracique en coupant soigneusement les côtes des deux côtés du sternum juste en dessous de l’omoplate. Veillez à ne pas percer les poumons sous la cage thoracique. Attrapez les lambeaux de peau / côtes avec une pince et épinglez-les pour exposer les organes internes.
  9. Coupez doucement tout tissu, comme le thymus, qui peut obstruer un accès clair au cœur. Exposez tous les organes, y compris le tractus gastro-intestinal, pour permettre la confirmation visuelle que tout le corps est perfusé, y compris le bas-ventre.
  10. Utilisez des ciseaux à dissection pour couper l’oreillette droite du cœur et libérer le sang du système. Tenez doucement le cœur avec une pince et insérez une aiguille de perfusion (connectée à un contrôleur de pompe péristaltique) dans le ventricule gauche.
  11. Pompez environ 10 mL de PBS, avec une pression douce mais constante, jusqu’à ce que des tissus tels que le foie, les reins et l’appareil reproducteur (Figure 1E, F) passent du rose au blanc. Ensuite, remplacez le PBS par du PFA à 1 % fraîchement préparé et poursuivez la perfusion avec environ 10 mL de PFA ou jusqu’à ce que des contractions se produisent dans le bas du corps de la souris (p. ex., la queue).
    REMARQUE: Ces tremblements de fixation indiquent une perfusion réussie.
  12. Une fois la perfusion terminée, localisez le coussinet adipeux avec les ovaires sous le rein et disséquez doucement l’ensemble de l’appareil reproducteur, y compris le coussinet adipeux, les ovaires et les cornes utérines, et placez le tractus dans un flacon contenant 4% de PFA. Fixez les ovaires à température ambiante pendant la nuit (~16-24 h). Ensuite, remplacez le PFA à 4 % par de l’éthanol à 70 % pendant au moins un jour et coupez les ovaires (Figure 1E, F), comme décrit ci-dessus, avant de commencer le protocole d’immunocoloration.

5. Immunocoloration de l’ovaire de montage entier (figure 2A)

REMARQUE: Pratiquez des techniques stériles pendant le protocole d’immunocoloration, en particulier lors du changement de tampons, afin de prévenir la contamination pendant les périodes d’incubation prolongées.

  1. Effectuez toutes les étapes d’immunocoloration dans une plaque de 24 puits, comme illustré à la figure 2A. Ajustez les volumes de réactifs pour d’autres formats. Changez soigneusement les tampons pour éviter de perdre de petits ovaires prénataux et prépubères.
    REMARQUE: D’autres formats, tels que les plaques de 48 et 96 puits, peuvent être utilisés, mais les puits plus profonds et les ouvertures plus étroites rendent difficile l’aspiration des tampons sans perdre ou endommager les ovaires.
  2. Jour 1
    1. Pipette 1 mL de PBS/puits dans le nombre de puits nécessaires dans une plaque propre de 24 puits. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 μL pour faire une large ouverture et utilisez-la pour transférer doucement les ovaires prépubères de tubes de 1,5 mL avec 70% d’éthanol dans les puits. Pour les ovaires pubertaires, utilisez une pointe de pipette de 1000 μL avec la pointe coupée pour le transfert.
      REMARQUE: L’ouverture plus large de la pointe empêche les lésions tissulaires pendant le transfert.
    2. Une fois que tous les échantillons sont transférés dans les puits, utilisez une nouvelle pointe pour aspirer le PBS et remplacez-le par 0,8 mL de PBS/puits frais. Incuber les échantillons à température ambiante sur un agitateur à ~100-150 tr/min pendant la nuit. Commencer la préparation du tampon de perméabilisation (voir tableau 1 et section 1).
      REMARQUE: La nouvelle pointe empêche les ovaires de coller à la pointe, et l’étape d’incubation PBS permet aux ovaires de s’équilibrer dans PBS et de se réhydrater avant de tacher.
  3. Jour 2
    1. Terminer la préparation du tampon de perméabilisation. Aspirer le PBS des puits et le remplacer par 0,8 mL de tampon de perméabilisation par puits. Replacez les plaques sur le shaker et incubez les échantillons à température ambiante pendant 4 h.
    2. Après 4 h d’incubation, aspirer complètement le tampon de perméabilisation et le remplacer par 0,5 mL de tampon bloquant (voir tableau 1 et rubrique 1). Scellez la plaque avec un parafilm pour éviter l’évaporation, placez-la dans un récipient bien recouvert sur un agitateur et incubez les échantillons avec une légère agitation dans un tampon bloquant pendant la nuit (16-24 h) à température ambiante.
  4. Jour 3
    1. Préparer les anticorps primaires par dilution dans un tampon bloquant. Pour visualiser les ovocytes, utilisez des marqueurs ovocytaires, par exemple, la peptidase acide nucléaire anti-germinale de rat (GCNA)/TRA98 pour les ovaires prénataux et prépubères et l’hélicase anti-DEAD-box de lapin 4 (DDX4)/homologue vasa de souris (MVH) pour les ovaires prépubères et pubertaires. Pour quantifier l’expression de LINE-1 ORF1p dans les ovaires prénataux, utilisez l’anti-LINE-1 ORF1p de lapin ou un autre anticorps disponible.
      REMARQUE: Le signal GCNA / TRA98 n’est pas détectable dans les ovaires pubertaires.
    2. Aspirer le tampon bloquant des échantillons et le remplacer par 0,5 mL d’anticorps primaires dilués. Scellez la plaque avec un parafilm pour éviter l’évaporation. Placez les plaques dans un récipient avec un couvercle pour éviter le dessèchement des échantillons pendant l’incubation. Placez le récipient sur le shaker et incubez les échantillons pendant 3-4 jours à température ambiante.
  5. Jour 7
    1. Retirez doucement le parafilm des plaques et aspirez le mélange d’anticorps primaires des échantillons. Conserver les mélanges d’anticorps primaires à 4 °C (jusqu’à un mois ou trois utilisations) et les réutiliser plus tard en les complétant avec des anticorps frais (p. ex., 2 μL d’aliquote d’anticorps frais pour 5 mL du mélange précédemment utilisé).
    2. Ajouter 1 mL de tampon de lavage (voir tableau 1 et rubrique 1) par puits aux échantillons et bercer doucement les plaques pendant quelques secondes pour rincer les anticorps résiduels. Aspirer soigneusement et remplacer le tampon de lavage par 0,8 mL de tampon de lavage frais et agiter les plaques à température ambiante pendant la nuit.
  6. Jour 8
    1. Aspirer le tampon de lavage pendant la nuit, le remplacer par 0,8 mL de tampon de lavage frais et agiter à température ambiante pendant 2 h. Répétez l’étape de lavage avec un tampon de lavage frais pendant encore 2 h.
    2. Après le dernier lavage, remplacez le tampon de lavage par 0,5 mL de mélanges d’anticorps secondaires dilués dans un tampon bloquant, par exemple, Alexa Fluor 555 anti-rat chèvre et Alexa Fluor 647 anti-lapin chèvre à dilution 1:1 000. Préparez le mélange d’anticorps secondaire frais pour chaque expérience d’immunocoloration.
    3. Scellez la plaque avec un parafilm pour éviter l’évaporation pendant l’incubation. Incuber les échantillons à température ambiante dans l’obscurité ou dans des plaques recouvertes de papier d’aluminium avec une agitation douce pendant 3 jours.
      REMARQUE: Cette étape et toutes les étapes suivantes se déroulent dans l’obscurité ou avec une pellicule d’aluminium.
  7. Jour 11
    1. Aspirer le mélange d’anticorps secondaires et effectuer un lavage initial avec 1 mL de tampon de lavage. Bercez doucement les plaques pendant quelques secondes pour rincer les anticorps secondaires résiduels.
    2. Aspirer le tampon de lavage, le remplacer par 0,8 mL de tampon de lavage frais et incuber les échantillons à température ambiante pendant 2 h en le secouant, à l’abri de la lumière. Répétez l’étape de lavage 2 fois pour un total de 3 lavages. Après le troisième lavage, passez à l’étape de nettoyage (section 6).

6. Clairance des ovaires de monture entière immunocolorés (figure 2A).

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de nettoyage dans l’obscurité en enveloppant les plaques dans du papier d’aluminium ou en les plaçant dans des récipients opaques. Les étapes de clairance diffèrent pour les ovaires prépubères et pubertaires.

  1. Jour 11 [Les ovaires prénataux et prépubères sont éliminés en une seule étape]
    1. Après le dernier lavage, aspirer le tampon de lavage et le remplacer par 0,8 mL de solution ScaleS4(0) fraîchement préparée (voir tableau 1 et rubrique 1). Scellez la plaque avec un parafilm et incubez les échantillons dans l’obscurité en agitant à température ambiante pendant trois à quatre jours avant l’imagerie.
    2. Remplacer la solution ScaleS4(0) par une solution fraîche tous les jours si nécessaire; Faites attention lors du remplacement des solutions, car les ovaires dégagés deviennent transparents et sont difficiles à voir. Après avoir effacé, passez à la mise en place de l’échantillon et à l’imagerie (section 7).
      REMARQUE: La modification des solutions n’a pas amélioré de manière significative la qualité de l’image. Les changements quotidiens augmentent la probabilité de perdre de petits échantillons pour la plupart transparents.
  2. Jours 11-15 [Les ovaires pubères sont éliminés dans un protocole en deux étapes]
    1. Après le dernier lavage immunocolorant, aspirer le tampon de lavage et le remplacer par 0,8 mL de ScaleCUBIC-1 (voir tableau 1 et rubrique 1). Scellez la plaque avec un parafilm et secouez doucement les échantillons à 37 °C pendant 3 jours dans l’obscurité. Remplacez quotidiennement la solution ScaleCUBIC-1 par la solution fraîche.
    2. Le jour 15, lavez les échantillons 3 fois pendant 10 minutes à chaque fois dans 0,8 mL de PBS à température ambiante en secouant doucement. Remplacer le PBS par 0,8 mL de saccharose dégazé à 20 % préparé fraîchement avec du PBS. Agiter doucement à température ambiante pendant 1 h.
    3. Remplacer la solution de saccharose à 20 % par 0,8 mL de solution ScaleCUBIC-2 (voir tableau 1 et rubrique 1), sceller la plaque avec un parafilm et agiter doucement à température ambiante avec les changements quotidiens de la solution ScaleCUBIC-2. Effacer pendant 4-5 jours et passer à l’image. Faites attention lors de l’échange de solutions pour éviter la perte d’échantillons car les ovaires dégagés sont transparents et difficiles à voir. Passez à la configuration de l’échantillon et à l’imagerie (section 7).

7. Configuration de l’échantillon et imagerie avec un microscope multiphotonique

REMARQUE: Toutes les étapes décrites ci-dessous ont été effectuées avec un Leica DIVE / 4TUNE / FALCON avec deux lasers multiphotons Ti:Sapphire à verrouillage en mode accordable avec une durée d’impulsion de 120 fs avec un objectif multi-immersion 16x / NA0.6 (liquide d’immersion = glycérol) avec une distance de travail maximale de 2,2 mm. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur le logiciel d’acquisition d’images. Le tableau supplémentaire S1 et la figure supplémentaire S1 montrent les paramètres utilisés pour ce protocole. Pour les autres plates-formes d’imagerie, consultez le noyau de microscopie ou suivez les spécifications / recommandations du fabricant.

  1. Exemple de configuration
    1. Préparez la configuration pour le montage des échantillons. Par exemple, utilisez un joint en silicone collant et flexible pour créer un puits adhésif. Placez le puits adhésif sur un micro-couvercle de 25 mm x 25 mm n° 1,5 pour créer un puits dans lequel les ovaires seront placés (Figure 2B).
      REMARQUE: Un joint de 1 mm d’épaisseur s’adapte à toutes les tailles d’ovaires. Cette configuration est recommandée car elle élimine le mouvement des ovaires pendant l’imagerie, ce qui peut se produire lorsque les ovaires sont placés en mountant dans une boîte à fond de verre.
    2. À l’aide d’une pointe de pipette avec la pointe coupée (20 μL pour les prénataux et prépubères), transférez les ovaires avec environ 5 à 10 μL de solution De ScaleS4(0) au milieu du puits adhésif, comme illustré à la figure 2B. Pour les ovaires pubertaires, utilisez une pointe de pipette de 200 μL avec la pointe coupée assez loin pour transférer les ovaires. Ajouter ~15-20 μL de la solution ScaleCUBIC-2 au milieu du puits adhésif.
      REMARQUE: Trop de solution peut provoquer une fuite sur l’étage du microscope, et trop peu de solution entraînera une mauvaise qualité d’image. Utilisez un microscope à dissection pour transférer des échantillons lorsque les ovaires dégagés deviennent transparents et sont difficiles à voir.
    3. Une fois que les ovaires sont transférés dans des puits individuels avec une goutte de solution de nettoyage, placez doucement un autre verre de couverture sur le puits adhésif, appuyez pour créer un joint et maintenez les échantillons en place dans un petit bassin de solution de nettoyage pris en sandwich entre les deux couvercles (Figure 2B). Pour l’imagerie, placez le " sandwich » dans une lame d’adaptateur de microscope imprimée en 3D (par exemple,43 ).
      REMARQUE: Les puits adhésifs sont réutilisables après la déconstruction du « sandwich » et le lavage à l’eau.
  2. Imagerie (tableau supplémentaire S1 et figure supplémentaire S1)
    1. Allumez le microscope et le logiciel selon les directives du noyau de microscopie ou du fabricant. Placez les échantillons montés sur la scène du microscope et regardez à travers l’oculaire pour localiser l’échantillon éclairé avec une lampe à fluorescence LED de faible puissance.
    2. Une fois les échantillons localisés, allumez le(s) laser(s) et affectez chaque détecteur à un colorant/marqueur Alexa Fluor spécifique. Pour plusieurs lasers, autorisez l’acquisition séquentielle d’images. Acquérir toute la pile avant de changer de laser.
      REMARQUE: Pour ce protocole, un laser a été utilisé pour l’acquisition d’images de fluorophores de 555 nm et 647 nm.
    3. Configurez les paramètres d’acquisition d’images en fonction des spécifications du noyau de microscopie ou du fabricant. Utilisez l’acquisition d’images bidirectionnelle, si disponible, pour réduire le temps de numérisation et améliorer l’efficacité. Ajustez d’autres paramètres, notamment la moyenne des lignes (1), la moyenne des images (1) et l’accumulation des images (1).
      REMARQUE: L’acquisition d’images bidirectionnelle permet aux lasers de numériser dans les deux sens lorsqu’ils se déplacent sur l’axe X.
    4. Configurez le Z-Stack en identifiant le début (en bas de l’échantillon/couvercle en verre inférieur) et la position finale (en haut du couvercle en verre de l’échantillon/supérieur). Sélectionnez une taille en Z de 2 μm pour les ovaires prépubères et de 5 μm pour les ovaires pubertaires.
    5. Activez la fonction de compensation Z et, dans cette fonction, activez le gain d’excitation. Réglez la compensation Z pour le bas et le haut de l’échantillon en sélectionnant une intensité laser pour le bas (faible intensité) et le haut (haute intensité). Voir la figure supplémentaire S1, Compensation Z linéaire, où la boîte de gain d’excitation est sélectionnée, et l’intensité laser pour le bas (0) et le haut (347,75) est définie sur 10 et 12, respectivement.
    6. Utilisez le mode mosaïque pour les échantillons plus volumineux qui ne peuvent pas être capturés dans un seul champ de vision. Activez le navigateur d’images et indiquez le nombre de tuiles nécessaires pour capturer l’échantillon entier à l’aide de l’outil de marquage rectangulaire.
    7. Démarrez l’acquisition d’image. Pour les images avec plusieurs vignettes, démarrez l’acquisition d’images avec le navigateur pour capturer toutes les vignettes. Une fois l’acquisition d’image terminée, enregistrez d’abord toutes les images et, si plusieurs vignettes ont été acquises, exécutez l’outil mosaïque-fusion pour fusionner les vignettes en une seule image.
    8. Enregistrez les fichiers fusionnés dans un dossier de projet distinct pour faciliter l’utilisation des images de la taille d’un gigaoctet. Transférez les fichiers pour le traitement d’images avec un logiciel de visualisation et d’analyse d’images 3D. La figure 3 montre des images représentatives prises à différents stades avec deux marqueurs (GCNA et DDX4).

8. Traitement d’image

REMARQUE: Toutes les étapes décrites ci-dessous ont été développées et effectuées à l’aide du logiciel de visualisation et d’analyse d’images 3D IMARIS.

  1. Importez la ou les images dans le logiciel de visualisation et d’analyse d’images 3D et, si nécessaire, convertissez les fichiers du format d’origine (par exemple, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) au format .ims.
  2. Si nécessaire, traitez les images avec le filtre gaussien pour réduire la pixellisation (Figure 4A). À l’aide de la fonction de vue 3D , positionnez l’image et désélectionnez l’option d’image (pour supprimer l’image).
    REMARQUE: Il existe d’autres filtres facultatifs, qui peuvent également être utilisés pour réduire la pixellisation et réduire l’intensité de l’arrière-plan.
  3. Agrandissez l’image à une échelle spécifique et utilisez la fonction Instantané. Définissez les préférences comme suit : sélectionnez 300 DPI, enregistrez en tant qu’image TIFF et Arrière-plan transparent. Prenez un instantané de l’image et enregistrez-la. La figure 3 montre des images assemblées complètes.

9. Quantification des ovocytes

REMARQUE: L’immunofluorescence des ovaires entiers et la visualisation et l’analyse d’images 3D peuvent être utilisées pour l’estimation du nombre d’ovocytes dans les ovaires entiers (Figure 3 et Figure 4) à l’aide de la fonction Spot. Le signal GCNA peut être utilisé pour quantifier les ovocytes dans les ovaires prénataux et prépubères, comme le montre la figure 4 (P5). Dans les ovaires pubertaires, utilisez le signal DDX4 pour quantifier deux populations d’ovocytes dans des follicules non en croissance (structure en forme d’anneau, flèche fermée) et des follicules en croissance (grandes structures, flèche ouverte, Figure 4, P28).

  1. Déterminer la taille des ovocytes qui seront utilisés comme paramètre pour quantifier les ovocytes avec la fonction Spots à l’étape 9.2.
    1. Ouvrez l’image et sélectionnez l’option Tranche pour ouvrir l’image Z-stack.
    2. Sélectionnez l’option Ligne dans le panneau Mesure et mesurez la distance en traçant une ligne d’un bord d’un ovocyte/marqueur à l’autre bord au point le plus large pour déterminer le diamètre XY du type/de la taille d’ovocyte à compter. Déplacez-vous dans la pile et obtenez la gamme de diamètres pour plusieurs ovocytes du même type. Utilisez la longueur la plus courte comme critère de sélection de la taille pour le nombre d’ovocytes.
  2. Fonction Spots : sélectionnez l’option Vue 3D et activez la fonction Ajouter de nouveaux spots dans le panneau Scène pour ouvrir le panneau Algorithme . Désélectionnez tous les paramètres de l’algorithme car le filtre de sélection de taille avec la taille d’ovocyte obtenue à l’étape 9.1 sera utilisé.
    1. Cliquez sur la flèche de transfert unique pour accéder au canal source. Sélectionnez le canal avec le marqueur préféré et tapez le diamètre XY estimé obtenu à l’étape 9.1. Par exemple, utilisez un diamètre XY estimé de 7 μm pour les ovocytes prénataux et de 11 μm pour les ovocytes P5 (GCNA = signal vert; Figure 3 et Figure 4A).
    2. Utilisez 30 μm pour le signal DDX4 afin d’estimer le nombre d’ovocytes dans les follicules en croissance dans les ovaires P5 (DDX4 = signal magenta; Figure 3 et Figure 4A). Pour les ovaires pubertaires, utilisez le signal DDX4 pour la quantification des ovocytes. Par exemple, utilisez des diamètres XY de 15 μm et 80 μm pour identifier les ovocytes dans les follicules non en croissance et les follicules en croissance, respectivement, comme le montre la figure 4A.
      REMARQUE: La taille sélectionnée peut varier en fonction des critères d’acquisition d’images et du type de microscope utilisé. La sélection peut également varier d’une souche génétique à l’autre, car les ovaires avec plus d’ovocytes nécessiteront des sélections de plus petite taille pour une meilleure détection automatisée des ovocytes.
    3. Après la sélection de la taille, activez l’allongement PSF du modèle et la soustraction d’arrière-plan, qui sont automatiquement déterminés. Sélectionnez la flèche d’avant unique pour accéder au panneau Filtrer les taches . Ajoutez le filtre Qualité et déterminez un seuil. Pour assurer l’estimation précise du nombre d’ovocytes, agrandissez l’image au fur et à mesure que le seuil est ajusté pour choisir une valeur seuil qui sélectionne la plupart des ovocytes. Cliquez sur la double flèche pour terminer les comptages automatisés.
    4. Vérifiez manuellement les ovocytes sélectionnés à l’aide de l’onglet Modifier pour sélectionner les ovocytes manqués ou désélectionnez les particules non ovocytaires sélectionnées par le seuil automatique. Enregistrez les données dans l’onglet Statistiques sous l’onglet Général pour une analyse plus approfondie.
      REMARQUE: Les paramètres utilisés pour compter les taches peuvent être enregistrés et utilisés pour un autre ensemble d’échantillons, mais il est recommandé d’effectuer une vérification manuelle avant d’exécuter l’analyse par lots.
    5. Pour stocker les paramètres, cliquez sur l’onglet Création et cliquez sur Paramètres du magasin pour le lot.
      REMARQUE: Les marqueurs nucléaires (ovocytes GCNA+, figure 4A) sont facilement identifiables par la fonction spot et peuvent ne pas nécessiter beaucoup d’ajustement manuel. Cependant, le marqueur cytoplasmique (ovocyte DDX4+, figure 3 (P28, flèche fermée) et figure 4A) nécessitera un ajustement manuel supplémentaire pour assurer l’identification de la taille / du type d’ovocytes corrects.

10. Quantification de l’expression des protéines dans les ovaires

REMARQUE : Il existe plusieurs façons de quantifier l’expression ovocytaire de marqueurs spécifiques à l’aide de la fonction Spots (section 9 et étape 10.1) et de la fonction Surfaces (étape 10.2). La fonction Spots peut être utilisée pour les protéines avec des modèles de localisation distincts tels que les marqueurs nucléaires (GCNA), et la fonction Surfaces peut être utilisée pour les protéines avec des modèles de localisation non uniformes comme le montre la figure 5A où les intensités LINE-1 ORF1p dans les ovaires E15.5 et E18.5 ont été mesurées. Pour calculer et comparer l’intensité de la protéine d’intérêt entre deux échantillons (p. ex., points temporels, traitements ou génotypes), recueillez des images ayant les mêmes propriétés. Utilisez des échantillons avec un signal plus intense pour déterminer les paramètres qui peuvent être stockés et utilisés pour les autres échantillons.

  1. Pour obtenir l’expression protéique avec la fonction Spots , identifiez d’abord les ovocytes comme indiqué (rubrique 9).
    1. Ensuite, sous la fonction Spots , sélectionnez l’onglet Statistiques , suivi de l’onglet Détaillé . Cliquez sur la flèche vers le bas et sélectionnez Valeurs spécifiques, ce qui ouvrira un autre onglet en dessous contenant différentes mesures. Sélectionnez la moyenne d’intensité du canal utilisé pour la génération de surface (ou sélectionnez d’autres mesures d’intensité telles que la médiane d’intensité).
    2. Pour obtenir les informations statistiques combinées/moyennes, sélectionnez le critère Valeurs moyennes . Une fois cela fait, exportez et enregistrez les données pour une analyse plus approfondie.
  2. Pour obtenir l’expression de la protéine avec la fonction Surfaces , ouvrez l’image, sélectionnez l’option Vue 3D et activez la fonction Ajouter de nouvelles surfaces dans le panneau Scène pour ouvrir le panneau Algorithme . Désélectionnez tous les paramètres de l’algorithme si ce n’est pas nécessaire et cliquez sur la flèche de transfert unique pour accéder au canal source.
    1. Sélectionnez le canal avec le signal d’anticorps à mesurer. Les autres propriétés à sélectionner sont des options spécifiques à l’utilisateur. Ici, le signal LINE-1 a été utilisé comme marqueur. Les valeurs Détails des surfaces et Soustraction de l’arrière-plan (contraste local) ont été conservées aux valeurs par défaut de 1,42 et 5,33, respectivement.
    2. Cliquez sur la flèche vers l’avant pour accéder au panneau Seuil . Choisissez une valeur de seuil comparable dans les deux échantillons (par exemple, ici, l’expression LINE-1 dans E18.5 a été utilisée pour choisir un seuil). Sélectionnez Activer avec un diamètre de points d’amorçage par défaut de 7,10 (cette valeur a été jugée optimale pour les images, mais peut dépendre de la taille de pixel attendue des entités).
    3. Cliquez sur la flèche vers l’avant pour accéder au panneau Filtrer les surfaces . Utilisez un filtre de qualité et basez la valeur, comme pour la valeur seuil, sur l’expression des protéines dans les deux échantillons d’ovaires. Une fois la propriété de filtre sélectionnée, cliquez sur la double flèche avant pour terminer la génération de la surface.
    4. Pour obtenir les valeurs d’intensité, sélectionnez l’onglet Statistiques , suivi de l’onglet Détaillé . Cliquez sur la flèche vers le bas et sélectionnez Valeurs spécifiques, ce qui ouvrira un autre onglet en dessous contenant différentes mesures.
    5. Sélectionnez la moyenne d’intensité du canal utilisé pour la génération de surface (ou sélectionnez d’autres mesures d’intensité telles que la médiane d’intensité).
    6. Pour obtenir les informations statistiques combinées/moyennes, sélectionnez le critère Valeurs moyennes . Une fois cela fait, exportez et enregistrez les données pour une analyse plus approfondie (Figure 5C).

11. Estimation du nombre total d’ovocytes dans l’ovaire endommagé avec correction informatique

REMARQUE: Si une lésion ovarienne mineure se produit pendant la dissection, il peut être possible d’estimer par calcul le nombre total d’ovocytes. Il est recommandé d’utiliser des ovaires intacts de la même souche et du même stade de développement pour l’estimation du nombre d’ovocytes, comme le montre la figure 6. Les simulations effectuées avec les ovaires à E15,5 indiquent que la correction d’une perte de ≥30 % entraîne un écart significatif par rapport aux chiffres réels (figure 6C).

  1. Ouvrez des images d’ovaires intacts avec IMARIS et sélectionnez la fonction Cadre . Sous Paramètres du cadre, sélectionnez les étiquettes Case, Grille, Coches et Axe . Sous l’onglet Position X/Y/Z , sélectionnez 200 μm pour générer des graduations avec des espaces de 200 μm dans toutes les positions X/Y/Z.
    REMARQUE: Les graduations créent une grille / règle dans les plans X, Y et Z pour identifier les ovocytes dans une région spécifique.
  2. Activez la fonction Spots pour identifier les ovocytes comme indiqué à la rubrique 9 (Figure 4). Créez un modèle 3D à l’aide des ovocytes identifiés dans tous les ovaires intacts utilisés pour la simulation en sélectionnant Sphère sous l’onglet Styles/Qualité des points de la fonction Spots .
    REMARQUE: La largeur des pixels peut également être modifiée sous l’onglet Styles/Qualité des points.
  3. Avec la boîte générée à l’étape 11.1, alignez les modèles 3D des ovaires intacts dans la même orientation que celle illustrée à la figure 6A.
  4. À l’aide des graduations de 200 μm (étape 11.1), sélectionnez les ovocytes qui se situent à moins de 50 % du volume de chaque ovaire. Cliquez sur la fonction Spots et sélectionnez Modifier les étiquettes pour classer les ovocytes qui se trouvent dans la région à 50 % par couleur, comme illustré à la figure 6A.
    REMARQUE: Une fois que les ovocytes sont classés dans une région, le nombre d’ovocytes qui entrent dans chaque classe sera fourni.
  5. Zoomez sur la région des 50% et changez les graduations de 200 μm à 50 μm pour créer une règle plus petite pour l’identification des ovocytes. Conservez le pourcentage de zoom dans toutes les images. Avec les tickmarks de 50 μm comme guide, divisez la région de 50% en cinq parties égales.
    REMARQUE: Les ovocytes dans chaque partie représenteront 10% du volume comme indiqué à la figure 6A, où un ovaire intact montre des ovocytes dans la moitié supérieure de l’ovaire classés par cinq couleurs différentes, chaque couleur représentant des ovocytes dans une région volumétrique de 10%.
  6. Notez le nombre d’ovocytes dans chaque région à 10 %, comme le montre la figure 6A, B. Calculez le nombre moyen d’ovocytes pour des incréments de 10, 20, 30, 40 et 50 %.
  7. Utilisez les points en surbrillance des étapes 11.1 à 11.6 pour obtenir le nombre d’ovocytes dans l’ovaire partiel endommagé. Placez l’ovaire endommagé dans la même orientation que les ovaires intacts et estimez le volume/pourcentage manquant comme décrit ci-dessus.
  8. Pour estimer le nombre total d’ovocytes dans l’ensemble de l’ovaire , ajouter le nombre moyen d’ovocytes calculé pour un volume similaire au nombre obtenu à partir de l’ovaire partiel (figure 6B).

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Representative Results

L’immunocoloration et l’imagerie de l’ensemble de l’ovaire permettent la visualisation et la quantification des ovocytes ou de l’expression des protéines dans les ovaires à différents stades de développement en utilisant la même technique et les mêmes marqueurs (Figure 3). Ce protocole a été développé pour un projet à grande échelle dans lequel l’analyse des ovaires à plusieurs stades et de plusieurs souches de souris était nécessaire. Nous présentons ici les données recueillies pour la souche C57BL6/J, une souche standard pour l’analyse génétique. La technique présentée ici est simple, les résultats peuvent être obtenus dans les 14-19 jours (Figure 2D) et peuvent être utilisés pour les ovaires des femmes prénatales, prépubères et pubertaires (Figure 1 et Figure 2A,B).

Cette approche a été utilisée pour étudier la dynamique de la perte d’ovocytes qui se produit naturellement lors de la formation de la réserve d’ovocytes ovariens. Dans de nombreux organismes, y compris la souris, on pense que le nombre d’ovocytes atteint son apogée au cours de la vie fœtale au moment où les ovocytes entrent dans la méiose ~ E13.5. Le nombre d’ovocytes diminue en raison du processus encore mal compris d’attrition des ovocytes fœtaux (FOA) (de ~E15,5 à E18,5), qui a été mécaniquement lié à l’expression du rétrotransposon LINE-120,21. Plus d’ovocytes sont éliminés après E18,5 à P0 en raison de l’élimination des ovocytes anormaux par un point de contrôle de qualité méiotique22,23. Pour étudier ces processus à l’aide de ce protocole, nous avons immunocoloré et imagé les ovaires à différents stades de développement en utilisant DDX4 et GCNA comme marqueurs d’ovocytes, comme le montre la figure 3.

De petits ovocytes exprimant GCNA et DDX4 sont observés à partir de E15,5 et ils représentent des ovocytes pendant la MPI ou arrêtés au dictyate dans les follicules primordiaux. Des ovocytes en croissance plus gros avec une forte expression de DDX4 sont déjà détectés dans les ovaires P2 où ils représentent très probablement la première vague de follicules44. Un nombre croissant d’ovocytes plus gros sont observés dans les ovaires P5 et P28. Les images obtenues par microscopie multiphotonique (Figure 4A) ont été traitées à l’aide du logiciel IMARIS et un rendu 3D a été effectué pour identifier les ovocytes en croissance petits et grands en fonction du signal nucléaire GCNA et de la taille délimitée par le signal DDX4 (Figure 4A et Vidéo 1). Les ovocytes ont été comptés comme décrit dans le protocole et les résultats sont résumés à la figure 4B. En accord avec les études précédentes, nous avons observé une perte ovocytaire significative de E15,5 à E18,5 (~32%) et E18,5 à P2 (~24%). Au moment où les femelles atteignent la puberté (P28), seulement ~ 30% des ovocytes présents à E15,5 ont survécu.

Cette méthode peut également être utilisée pour observer les conséquences des traitements génotoxiques tels que l’irradiation, dont il a été démontré qu’elle élimine complètement la réserve follicule primordiale en une semaine 23,38,45. Une différence visuelle significative est évidente entre l’ensemble de l’ovaire traité par radiothérapie et le témoin non traité de la figure 3 (comparaison des ovaires P28 de femelles traitées et non traitées). Dans l’ovaire P28 sans exposition aux rayonnements, nous avons observé deux populations d’ovocytes marquées avec DDX4; petits ovocytes abondants dans les follicules primordiaux (flèche fermée); et des ovocytes plus gros de différentes tailles que l’on trouve généralement dans les follicules en croissance (p. ex., primaire, secondaire et préantral) (figure 3). En revanche, l’ovaire d’une femelle exposée à 0,5Gy de rayonnement γ à P7 est complètement dépourvu de petits ovocytes dans les follicules primordiaux comme observé précédemment dans les sections 2D. Fait intéressant, seuls de plus gros ovocytes de taille similaire ont survécu au rayonnement; il peut s’agir des premiers follicules d’ondes qui se développent déjà dans l’ovaire P7, car ils sont connus pour être résistants au rayonnement46 (Figure 3, P28).

En plus de la quantification du nombre d’ovocytes, ce protocole peut être utilisé pour l’immunocoloration et les analyses quantitatives d’autres protéines impliquées dans le développement des ovocytes. Par exemple, nous avons utilisé des anticorps contre la protéine LINE-1ORF1p, une protéine chaperonne liant l’ARN, produite par les rétrotransposons LINE-1 (Figure 5). L’augmentation de l’abondance des éléments LINE-1 de E15,5 à E18,5 a été proposée pour provoquer l’élimination desovocytes 20,21. En effet, en utilisant des images capturées par multiphotons et l’analyse de l’intensité du signal dans IMARIS, on a observé que les niveaux de LINE-1 ORF1p augmentaient significativement dans les ovocytes pendant cette période, ce qui est corrélé à une baisse significative du nombre d’ovocytes, comme le montre la figure 4B.

Dans les cas où une partie d’un ovaire est endommagée ou perdue, les ovaires de la même souche et du même stade de développement peuvent être utilisés pour estimer informatiquement le nombre d’ovocytes dans la région manquante, comme le montre la figure 6. Les données des ovaires E15.5 ont été utilisées pour des simulations visant à tester la précision des corrections computationnelles. On peut estimer par calcul que les ovocytes dans les ovaires avec jusqu’à 30% de lésions tissulaires peuvent être estimés par calcul à un écart de ≤10% par rapport aux ovocytes dans un ovaire intact, ce qui suggère que la coloration et la modélisation 3D des ovaires peuvent être utilisées efficacement pour récupérer des données de tissus précieux. Les simulations effectuées avec les ovaires à E15,5 indiquent que la correction d’une perte de ≥30 % entraîne un écart significatif par rapport aux chiffres réels (figure 6C).

Figure 1
Figure 1: Dissection et perfusion ovares de femelles de stades prénatal et postnatal. (A-C) La dissection ovarienne de différents stades nécessite différentes techniques, qui sont représentées schématiquement pour compléter les descriptions dans la vidéo. (D) Les ovaires au jour postnatal 5 (P5) sont beaucoup plus petits qu’à P28, ce qui nécessite un protocole de compensation différent tel que décrit dans le protocole. (E,F) Une bonne perfusion des ovaires est importante pour éliminer la coloration de fond des globules rouges. Les appareils reproducteurs et les ovaires non perfusés ont une teinte rose tandis que les organes perfusés deviendront blancs. Abréviation : RI = appareils reproducteurs non perfusés. Les images A-C ont été créées avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Immunocoloration, éclaircissement et imagerie d’ovaires entiers de souris. (A) L’organigramme illustre les étapes partagées et spécifiques du protocole d’immunocoloration et de nettoyage pour les ovaires prénataux/prépubères et pubertaires. (B) Les ovaires nettoyés sont montés dans une goutte de solution de nettoyage au milieu d’un adhésif bien pris en sandwich entre deux glissières de couverture. Pour l’imagerie, les échantillons montés sont placés dans une diapositive d’adaptateur imprimée en 3D. (C) Images multiphotoniques en niveaux de gris d’ovaires non perfusés ou perfusés, immunocolorés avec le marqueur ovocytaire DDX4, montrant une meilleure qualité d’image et une coloration non spécifique plus faible après perfusion. La flèche fermée indique un ovocyte avec une fine couche de coloration cytoplasmique DDX4 typique des follicules primordiaux, et les flèches ouvertes montrent des ovocytes plus gros dans les follicules en croissance. L’astérisque indique l’autofluorescence des vaisseaux sanguins. (D) Rendus 3D à partir d’images confocales vs multiphotoniques d’ovaires P5, immunocolorés avec des marqueurs ovocytaires GCNA (vert) et DDX4 (magenta), montrant une aberration sphérique significative de la microscopie confocale et pratiquement aucun de multiphoton. Barres d’échelle = 100 μm (C, D) et 50 μm (encarts en D). Abréviations : GCNA = peptidase acide nucléaire germinale; DDX4 = hélicase dead-box 4. L’image A a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images représentatives rendues en 3D d’ovaires de différents stades de développement. Rendus 3D à partir d’images multiphotoniques d’ovaires entiers de montage immunocolorés avec GCNA (vert) et LINE-1 ORF1p (bleu) ou DDX4 (magenta), dans les ovaires prénataux et postnatals, respectivement. Les canaux individuels sont présentés en niveaux de gris pour montrer les signaux nucléaires et cytoplasmiques. Les zones blanches contournent les régions agrandies dans les encarts inférieurs gauches. Deux ovaires différents sont montrés pour P28. L’ovaire de la femelle témoin non irradiée (en haut) contient une grande population de petits ovocytes dans les follicules primordiaux (voir encadré). En revanche, l’ovaire de la femelle irradié à P7 avec 0,5 Gy de rayonnement γ (IR) est complètement dépourvu de petits ovocytes dans les follicules primordiaux (voir encadré). La flèche fermée indique un ovocyte avec une fine couche de coloration cytoplasmique DDX4 typique des follicules primordiaux, et les flèches ouvertes montrent des ovocytes plus gros dans les follicules en croissance. Barres d’échelle = 100 μm; 30 μm pour les inserts P28; 10 μm pour tous les autres encarts. Les encarts contiennent des vues agrandies d’images rendues en 3D générées dans IMARIS et peuvent différer légèrement des images à faible grossissement en raison de la perspective. Abréviations : Non-IR = témoin non irradié; IR = irradié à P7 avec 0,5 Gy de rayonnement γ; GCNA = peptidase acide nucléaire germinale; DDX4 = hélicase dead-box 4; LINE-1 = long élément nucléaire entrecoupé-1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Traitement d’images, affichage 3D des ovocytes et résultats de quantification. (A) Les rendus 3D à partir d’images multiphotoniques (à gauche) ont été traités dans IMARIS à l’aide d’un filtre gaussien (au milieu) et les ovocytes de petites et grandes tailles ont été identifiés à l’aide de la fonction spot (à droite). Ovaires P5 et P28 montrés à titre d’exemple. Barres d’échelle = 100 μm (P5); 10 μm (encarts P5); 300 μm (P28); 50 μm (encarts P28). (B) Les petits ovocytes positifs pour le GCNA ont été quantifiés dans les ovaires de différents stades à l’aide de caractéristiques ponctuelles (en haut). Pour illustrer la diminution du nombre d’ovocytes au cours du développement, le pourcentage moyen d’ovocytes a été calculé à chaque étape par rapport au nombre moyen présent au stade le plus précoce compté à E15,5 (en bas). Notez la forte baisse du nombre d’ovocytes de E15,5 à E18,5. Les données sont présentées comme des moyens ± SD. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism et analysées par ANOVA unidirectionnelle, et la signification a été déterminée par le test de comparaison multiple post-hoc de Bonferroni. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0.05. Abréviation : GCNA = peptidase acide nucléaire germinale; ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Détection et quantification de l’expression de THELINE-1 ORF1p dans les ovocytes fœtaux. (A) Les rendus 3D à partir d’images multiphotoniques montrent l’expression LINE-1 ORF1p (bleu) dans les ovocytes fœtaux E15.5 et E18.5 (marqués par le GCNA vert). (B) Surfaces 3D générées dans IMARIS à l’aide d’images de la ligne supérieure du panneau A. (C) L’analyse de l’intensité de LINE-1 ORF1p montre une expression plus élevée de LINE-1 ORF1p par ovocyte à E18,5 qu’à E15,5. Barres d’échelle = 100 μm; 10 μm (encarts du panneau A); 30 μm (encarts du panneau B). Les données sont présentées comme des moyens ± SD. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism et analysées par le test t de Student, et la signification a été déterminée par le test Mann-Whitney U. P ≤ 0,0001; ns >0.05. Abréviations : GCNA = peptidase acide nucléaire germinale; LINE-1 = long élément nucléaire entrecoupé-1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Méthode d’estimation du nombre total d’ovocytes dans des échantillons ovariens endommagés avec correction informatique. (A) Modèle d’ovocytes E15.5 GCNA positifs (verts) avec cinq régions à 10% surlignées en rouge, bleu, gris, magenta et brun dans un ovaire intact. Chaque image suivante, après l’ovaire intact, représente un ovaire simulé avec 10% de régions incrémentielles manquantes jusqu’à 50%. (B) Schéma de la méthode de calcul pour estimer le nombre d’ovocytes dans l’échantillon endommagé. (C) Le nombre total d’ovocytes dans les ovaires simulés a été comparé au nombre dans les ovaires intacts d’origine (considéré comme 100%) et la différence est présentée comme un écart en pourcentage. Simulation de six ovaires individuels avec 10-50% de volume manquant. Barres d’échelle = 80 μm. Abréviation : GCNA = peptidase acide nucléaire germinale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Rendu 3D et modélisation 3D des ovocytes dans les ovaires P5. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Solutions et tampons Réactif(s) Composition
Fixateur Paraformaldéhyde 4 % (v/v)
Tampon de perméabilisation Alcool polyvinylique (PVA) 0,2 % (p/v)
Borohydrure de sodium 0,1 % (p/v)
Triton X-100 1,5 % (v/v)
Blocage de la mémoire tampon Albumine sérique bovine (BSA) 3 % (p/v)
1 M de glycine (pH 7,4) 2 % (p/v)
Triton X-100 0,1 % (v/v)
200x pénicilline-streptomycine 1 % (v/v)
10% d’azoture de sodium 0,2 % (v/v)
sérum de chèvre 10 % (v/v)
Tampon de lavage PVA 0,2 % (p/v)
Triton X-100 0,15 % (v/v)
10% d’azoture de sodium 0,1 % (v/v)
Solution ScaleS4(0) (pH 8,1) D-Sorbitol 40 % (p/v)
Urée 24 % (p/v)
Glycérol 10 % (v/v)
DMSO 20 % (v/v)
Solution ScaleCUBIC-1 Urée 25 % (p/v)
N,N,N′,N′-Tétrakis(2-Hydroxypropyl)éthylènediamine 25 % (v/v)
Triton X-100 15 % (v/v)
Solution de saccharose Saccharose 20 %(p/v)
Solution ScaleCUBIC-2 Saccharose 50 % (p/v)
Urée 25 % (p/v)
Triéthanolamine 10 % (p/v)
Triton X-100 0,1 % (v/v)

Tableau 1 : Solutions et tampons.

Figure supplémentaire S1 : Préférences d’acquisition d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : Paramètres d’acquisition d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Cet article présente un protocole détaillé d’immunocoloration et d’imagerie 3D pour les ovaires prénataux et postnatals pour les études comparatives et à haut débit pour la quantification des cellules germinales et la localisation des protéines. Nous avons développé ce protocole pour analyser le nombre d’ovocytes dans les ovaires (N = 6-12) à six points temporels de développement dans 10-16 souches différentes, où 2-4 plaques de 24 puits sont généralement traitées en même temps. Cette méthode peut être adaptée à d’autres organes ou marqueurs cellulaires. Par exemple, ce protocole peut être utilisé pour marquer et visualiser les cellules somatiques, telles que les cellules de la granulosa dans l’ovaire, en utilisant des anticorps appropriés, facilitant ainsi les études des interactions somatiques-cellules germinales ou le développement d’autres types de cellules ovariennes.

Une limitation de ce protocole et de la combinaison d’anticorps est l’identification définitive des différents stades folliculaires. Les taches d’ADN utilisées dans l’immunofluorescence et l’imagerie 2D pour identifier les stades folliculaires par couches de noyaux cellulaires de la granulosa sont insuffisantes pour les approches 3D. Le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou Hoechst sont rarement utilisés pour la coloration de l’organe entier en raison de la pénétration limitée de la lumière et du signal de désintégration au milieu de gros tissus. L’iodure de propidium (IP) est une petite molécule capable de pénétrer profondément dans le tissu, mais qui est difficile à capturer sur le système d’imagerie multiphotonique en raison du chevauchement spectral. Une meilleure résolution des stades folliculaires peut être obtenue par des marqueurs supplémentaires spécifiques aux cellules de la granulosa tels que l’hormone anti-mullérienne (AMH) ou FOXL247,48. Cependant, bien que ces marqueurs soient utiles pour différencier les follicules en croissance plus grands, ils ne distingueront pas les follicules primordiaux des follicules primaires. Jusqu’à ce que des marqueurs spécifiques pour ces premiers stades soient disponibles, les marqueurs ovocytaires tels que DDX4 ou GCNA offrent le meilleur indicateur du développement des follicules. En outre, ce protocole fonctionne pour les gonades masculines prénatales, mais n’a pas encore été testé dans le testicule postnatal où sa taille peut être le facteur limitant. Les questions critiques sont énumérées ci-dessous pour une meilleure visualisation et quantification des cellules germinales dans les ovaires de différentes tailles et les techniques et les mesures prises pour assurer une immunocoloration de bonne qualité pour l’analyse en aval sont mises en évidence.

La première étape critique consiste à prévenir les dommages aux ovaires avant et après la fixation. Les ovaires endommagés peuvent manquer de parties de la structure de l’organe, ce qui affecte le nombre d’ovocytes et fausse les résultats expérimentaux. Pour éviter les dommages, du tissu somatique supplémentaire est laissé attaché à l’ovaire plus grand après la dissection pour saisir avec une pince pour transférer les ovaires. De plus, pour les ovaires plus petits, les transférer avec une pointe de pipette coupée assez large pour que les ovaires puissent facilement s’insérer dans la pointe évite les dommages. Si des lésions tissulaires mineures entraînent la disparition d’une partie de l’ovaire, elles peuvent être atténuées par une méthode de calcul où le nombre total d’ovocytes dans l’échantillon endommagé peut être extrapolé à l’aide d’échantillons intacts du même type (figure 6).

Cependant, les simulations informatiques ont révélé que la précision de la prédiction diminue avec l’augmentation de la taille de la zone endommagée (100,8 % ± 0,2, 97,2 % ± 1,5 et 90,3 % ± 1 pour 10, 20 et 30 % de dommages, respectivement Figure 6C). Sur la base de simulations, nous recommandons que les échantillons présentant une perte de >30% soient exclus de l’analyse. Plusieurs ovaires intacts du même type d’échantillon ont été utilisés pour calculer le nombre moyen d’ovocytes dans la zone similaire à celle manquante dans l’échantillon endommagé. Ce nombre a ensuite été utilisé pour prédire le nombre total d’ovocytes dans l’ovaire présentant des dommages. L’utilisation d’une zone de taille similaire dans le même ovaire jouxtant la région manquante peut être utilisée comme alternative, mais n’a pas été testée.

Un autre problème est d’éviter de contaminer les cellules qui pourraient provoquer une autofluorescence. Pour les ovaires pubertaires, une perfusion, comme décrit ci-dessus, avec 1x PBS et 1% PFA doit être effectuée pour éliminer les cellules sanguines qui provoqueront une autofluorescence (Figure 2C). La perfusion par PBS doit se poursuivre jusqu’à ce que les organes, en particulier les ovaires et les reins, soient débarrassés du sang et deviennent blancs avant de passer à 1% de PFA (Figure 1E, F). Une perfusion inefficace avec PBS entraînera un arrière-plan élevé qui peut masquer et rendre la visualisation de petits ovocytes difficile. La perfusion avec des pourcentages plus faibles (1%) ou supérieurs (4%) de PFA donne une meilleure qualité d’image que la perfusion avec PBS seul; par conséquent, le pourcentage plus faible de PFA a été utilisé.

L’optimisation de la coloration des anticorps nécessite une attention particulière à plusieurs variables. Pour l’étape de perméabilisation, 4 h se sont avérés idéaux pour ce test, avec des périodes supérieures à 4 h (6-8 h testées) n’entraînant aucune coloration. Parce que la quantité et le coût des anticorps utilisés pour les expériences d’immunocoloration à grande échelle peuvent être élevés, ce protocole a été testé et optimisé pour réutiliser les mélanges d’anticorps sans perte de qualité d’immunocoloration. Pour la réutilisation, le mélange d’anticorps doit être complété par un anticorps frais tel que décrit dans le protocole. Les étapes de lavage sont également essentielles pour la qualité de l’immunocoloration et doivent être effectuées plus longtemps pour obtenir un meilleur rapport signal/bruit pendant l’imagerie et doivent être déterminées pour chaque anticorps de choix. Pour de meilleurs résultats, nous vous recommandons de préparer la solution de nettoyage ScaleS4(0) fraîchement pour chaque utilisation, tandis que ScaleCUBIC-1 et ScaleCUBIC-2 peuvent être conservés à température ambiante dans l’obscurité pendant environ 1 à 2 mois.

Le nettoyage ScaleCUBIC-1 est effectué à 37 °C; Il est important de noter que les températures plus élevées doivent être évitées car elles entraîneront des précipitations de réactifs, ce qui peut affecter la qualité de l’immunocoloration. Le montage de plusieurs échantillons pour l’imagerie peut prendre beaucoup de temps. La gélose ou d’autres méthodes d’intégration utilisées dans d’autres protocoles nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent nécessiter un nouveau nettoyage supplémentaire des échantillons 47,49,50. Les joints en silicium réutilisables peuvent être utilisés comme puits adhésifs faciles à utiliser avec des couvercles et sont proposés en différentes tailles et profondeurs pour s’adapter à d’autres tailles d’échantillons. Pour obtenir des images de haute qualité, un volume suffisant de solution de nettoyage doit être utilisé; trop peu entraînera une mauvaise qualité d’image et trop de solution peut fuir sur le microscope. Cette étape doit être optimisée pour des échantillons spécifiques en fonction de leur taille. Des plats à fond de verre peuvent être utilisés, mais les échantillons doivent être immobilisés pour l’imagerie, car même les moindres mouvements déformeront l’image. Les joints en silicium peuvent être utilisés en combinaison avec une parabole à fond de verre et un couvercle supérieur pour immobiliser les échantillons pour l’imagerie. Cependant, cela limitera la capacité de retourner l’échantillon si l’imagerie des deux côtés est nécessaire en raison de la taille de l’ovaire.

Un autre choix essentiel pour cette approche à grande échelle et à haut débit a été l’imagerie sur la plate-forme Leica DIVE/4TUNE/FALCON avec deux lasers multiphotons (MP) Spectra-Physics accordables. Les avantages de l’utilisation de la plate-forme DIVE incluent la facilité de montage des échantillons (décrite ci-dessus), la minimisation de la distorsion optique (par rapport aux plates-formes confocales) et, surtout, la vitesse d’imagerie et la gestion des données d’image acquises. L’imagerie d’échantillons avec les lasers multiphotons à grossissement plus élevé (16x) est beaucoup plus rapide et provoque moins de photodommages que les lasers confocaux du Leica DIVE ou SP8 en utilisant des paramètres similaires pour l’acquisition d’images avec le logiciel LAS X. Le faisceau MP est faible, son excitation fluorophore est très localisée au point focal et atteint plus de profondeur à faible grossissement sans infliger de photodommages malgré un nombre plus élevé d’étapes d’imagerie spatiale/axiale (confocale: ~ 300-400 sections maximum, MP: >800 sections).

L’objectif 16x/NA0.6 permet de corriger les légères incohérences de l’indice de réfraction dues à la distribution de l’échantillon et du mountant le long de l’axe optique via un collier de correction mécanique, qui est réglé de manière optimale pour un signal maximal, à mi-chemin dans l’échantillon. De plus, les structures sphériques, telles que les ovocytes, peuvent être déformées par l’acquisition d’images confocales, car une localisation dépendante de la profondeur du plan confocal (signal) en raison de discordances entre le montage et l’indice de réfraction de l’échantillon à un réglage de sténopé donné peut se produire (Figure 2D). Comme le signal de fluorescence est capturé via le sténopé interne de l’instrument pour éliminer le signal flou, la distorsion optique intrinsèque (aberration sphérique) peut s’aggraver plus profondément dans l’échantillon, ce qui est problématique pour les ovaires plus gros (c’est-à-dire ~ 400-600 micromètres d’épaisseur).

Avec les mêmes réglages de correction de lentille correspondants, pratiquement aucune aberration sphérique ne peut être détectée sur le système DIVE MP avec des longueurs d’onde d’émission variables, simplifiant ainsi les études de quantification et de colocalisation (Figure 2D). Enfin, le laser pulsé de haute puissance permet une concentration de fluorophore plus faible et excitante à l’intérieur de l’échantillon, en particulier lorsqu’il est utilisé avec la correction d’excitation en profondeur Z. De plus, la capture de signaux plus faibles est également améliorée par le détecteur hybride MP (HyD-RLD), qui est une combinaison de tubes photomultiplicateurs réguliers et de détecteurs de comptage de photons d’avalanche, permettant une détection de signal plus de 30 fois plus élevée sur une large gamme de longueurs d’onde d’émission.

La microscopie multiphotonique à feuille de lumière (LS) est une autre plate-forme émergente pour l’imagerie tissulaire 3D47. Cependant, LS exige plus de temps de configuration pour les échantillons macroscopiques, y compris l’intégration de la gélose et la configuration pour l’imagerie. De plus, les images acquises à un grossissement plus élevé avec rotation de l’échantillon peuvent générer de gros fichiers >100 Go, ce qui peut être nécessaire pour supprimer les artefacts d’ombrage de la feuille de lumière (en raison des incohérences de l’indice de réfraction du support extérieur et de l’intérieur de l’échantillon, ou des distorsions de surface de l’échantillon). La méthode présentée de montage d’échantillons en solution dans des puits adhésifs est simple et rapide.

De plus, cette approche permet l’imagerie de plusieurs ovaires dans un puits avec une seule configuration et sans retournement ni rotation. Cependant, il peut être nécessaire de retourner le « sandwich » du couvercle pour les ovaires plus gros. L’imagerie du système DIVE est plus rapide que l’imagerie confocale et LS; à un grossissement de 16x, l’ovaire prépubère est imagé en 3-5 min (Z-step 2 μm) et l’ovaire pubertaire en 1 h (Z-step 5 μm). De plus, les fichiers générés dans LAS X sont de taille gérable (2-20 Go), ce qui est également essentiel pour un grand nombre d’échantillons pour l’analyse en aval. Bien que ce protocole d’immunocoloration ait été optimisé pour une utilisation en combinaison avec la plate-forme DIVE, les échantillons immunocolorés peuvent être imagés à l’aide d’autres plates-formes MP / LS avec quelques modifications.

L’avantage de la coloration de l’ovaire entier avec le protocole de modélisation 3D est l’analyse efficace et relativement facile des données par rapport à l’acquisition manuelle de données en analyse 2D. Le logiciel de visualisation et d’analyse 3D IMARIS a été choisi parce qu’il est disponible dans le commerce et offert par de nombreux cœurs de microscopie, ne nécessite pas de compétences en programmation et est compatible avec de nombreuses plates-formes logicielles d’acquisition d’images telles que LAS X de Leica ou ZEN de ZEISS. Avec IMARIS, les paramètres standard sont configurés comme indiqué dans la section protocole, et ces paramètres peuvent être utilisés pour d’autres images et échantillons avec des modifications mineures, améliorant ainsi la reproductibilité et l’efficacité.

L’analyse et la quantification d’images sont optimisées pour le logiciel IMARIS; cependant, des analyses similaires peuvent être effectuées sur d’autres logiciels de visualisation de données commerciaux ou open source suivant des principes similaires. En conclusion, un protocole optimisé a été présenté ici pour l’imagerie d’ovaires entiers à des fins d’analyses quantitatives et qualitatives. Cela a été délibérément adapté aux exigences du traitement à haut débit qui sera de plus en plus nécessaire pour les tests toxicologiques, à des fins cliniques et diagnostiques, et les analyses à l’échelle du génome des régulateurs de la suffisance et de la fonction ovariennes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health (R01 HD093778 à E.B-F et T32 HD007065 à R.B). Nous remercions Zachary Boucher pour son aide dans l’expérience de radiation. Nous remercions Mary Ann Haendel pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions Sonia Erattupuzha et le service de base de microscopie du Jackson Laboratory pour leur aide spécialisée dans les travaux de microscopie décrits dans cette publication et Jarek Trapszo des Scientific Instrument Services du Jackson Laboratory pour la conception de la diapositive de l’adaptateur imprimé en 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

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Biologie du développement numéro 175
Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris
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Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

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