Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لتصوير المبايض بأكملها للتحليلات الكمية والنوعية باستخدام تلطيخ المناعة الكامل ، والمجهر متعدد الفوتونات ، والتصور والتحليل 3D. يستوعب هذا البروتوكول معالجة عالية الإنتاجية وموثوقة وقابلة للتكرار تنطبق على علم السموم والتشخيص السريري والمقايسات الجينومية لوظيفة المبيض.

Abstract

تعتمد خصوبة الإناث والعمر التناسلي على نوعية وكمية احتياطي بويضة المبيض. يتم التخلص من ما يقدر بنحو 80٪ من الخلايا الجرثومية الأنثوية التي تدخل الطور الأولي الاختزالي خلال استنزاف بويضة الجنين (FOA) والأسبوع الأول من حياة ما بعد الولادة. ثلاث آليات رئيسية تنظم عدد البويضات التي تعيش أثناء التطور وتنشئ احتياطي المبيض لدى الإناث اللواتي يدخلن سن البلوغ. في الموجة الأولى من فقدان البويضات ، يتم التخلص من 30-50٪ من البويضات خلال FOA المبكر ، وهي ظاهرة تعزى إلى التعبير العالي عن العنصر النووي الطويل المتخلل 1 (LINE-1). الموجة الثانية من فقدان البويضات هي القضاء على البويضات ذات العيوب الوسيطة بواسطة نقطة تفتيش جودة meiotic . تحدث الموجة الثالثة من فقدان البويضات في الفترة المحيطة بالولادة أثناء تكوين الجريب البدائي عندما تفشل بعض البويضات في تكوين بصيلات. ولا يزال من غير الواضح ما الذي ينظم كل من هذه الموجات الثلاث من فقدان البويضات وكيف تشكل احتياطي المبيض في الفئران أو البشر.

وقد فتح التألق المناعي والتصور 3D طريقا جديدا لتصوير وتحليل تطور البويضات في سياق المبيض بأكمله بدلا من أقسام 2D أقل إفادة. توفر هذه المقالة بروتوكولا شاملا للتلطيخ المناعي للمبيض بالكامل والمقاصة البصرية ، مما يؤدي إلى استعدادات للتصوير باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتونات والنمذجة 3D باستخدام البرامج المتاحة تجاريا. يوضح كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإظهار ديناميكيات استنزاف البويضات أثناء تطور المبيض في الفئران C57BL/6J وتحديد كمية فقدان البويضات خلال الموجات الثلاث للقضاء على البويضات. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مبايض ما قبل الولادة وبعدها المبكر لتصور البويضات وتحديدها كميا ، بالإضافة إلى النهج الكمية الأخرى. الأهم من ذلك ، تم تطوير البروتوكول بشكل استراتيجي لاستيعاب المعالجة عالية الإنتاجية والموثوقة والقابلة للتكرار التي يمكن أن تلبي الاحتياجات في علم السموم والتشخيص السريري والفحوصات الجينومية لوظيفة المبيض.

Introduction

تولد معظم إناث الثدييات بعدد محدود من البويضات المتوقفة بشكل متوسط الحجم المخزنة داخل بصيلات بدائية ، والتي تشكل احتياطي المبيض (OR) 1,2. يحدد OR العمر الإنجابي العام للإناث والصحة3. عادة ما ينخفض حجم OR مع الشيخوخة ويمكن استنفاده قبل الأوان عند التعرض لبعض العوامل السامة للوراثية (الإشعاع / العلاج الكيميائي) والضغوط البيئية (سوء التغذية) ، مما يؤدي إلى العقم4،5،6. غالبا ما يمكن أن يعزى العقم الأنثوي مجهول السبب إلى الجودة الوراثية والفسيولوجية للبيض الذي يتطور من غرفة العمليات ولا يزال غير مفهوم بشكل جيد 7,8. نظرا لأن هبة الجريب الأنثوي محددة مسبقا إلى حد كبير بالولادة ، فمن الضروري فهم الآليات التنظيمية المشاركة في إنشاء OR وصيانتها.

في الفئران ، يبدأ تكوين OR بمواصفات الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) حول اليوم الجنيني (E) 7.52. تهاجر PGCs إلى التلال التناسلية ، حيث ستقيم بحوالي E10.59. يحدث الانتشار الواسع النطاق التالي مع الحركية الخلوية غير المكتملة مما يؤدي إلى تكوين الخراجات التي سيتم تقسيمها لاحقا في التطور10,11. في حوالي E12.5 ، يتم تحديد جنس الغدد التناسلية ، ويتوقف انتشار PGC في المبيضين. في الإناث ، تدخل PGCs ، البويضات الآن ، الطور الأولي الوسيط الأول (MPI) عند حوالي E13.512,13. تتقدم البويضات من خلال MPI الممتد والاعتقال في مرحلة الإملاء في وقت قريب من الولادة. خلال الأسبوع الأول بعد الولادة ، تحيط بكل بويضة تم القبض عليها خلايا حبيبية ، وبالتالي تشكل جريبا بدائيا.

يعتمد عدد البصيلات البدائية في OR للأنثى على عدد البويضات التي نجت من موجات التخلص من البويضات التي تحدث قبل وأثناء اعتقال MPI من خلال موت الخلايا المبرمج أو الالتهام الذاتي أو النخر14,15. تحدث الموجة الأولى أثناء نمو الجنين وتعرف باسم FOA. FOA هي عملية محفوظة تطوريا في الإناث (الثدييات وغير الثدييات) ، حيث يتم التخلص من ما يقدر بنحو 50-80٪ من البويضات اعتمادا على الأنواع الأنثوية16،17،18،19. في الفئران ، يحدث FOA خلال E15.5 إلى E18.5 وقد يعزى إلى إعادة تنشيط والتعبير عن تسلسلات LINE-1 retrotransposon مما تسبب في موت البويضات20,21. تحدث الموجة الثانية من التخلص من البويضات من خلال نقطة تفتيش meiotic تقضي على البويضات ذات العيوب الوسيطة مثل فواصل الحمض النووي المزدوجة التي لم يتم إصلاحها (DSBs) 22,23. تحدث الموجة التالية من التخلص من البويضات أثناء انهيار الكيس ، وتبلغ ذروتها أثناء تكوين بصيلات بدائية ، يحتوي كل منها على بويضة واحدة10،11،24،25.

في الفئران ، يتم إنشاء احتياطي الجريب البدائي إلى حد كبير بحلول سن البلوغ ، وبعد ذلك ينخفض مع تنشيط البصيلات البدائية للنمو خلال الدورات التناسلية العادية. يختلف حجم OR بين النساء الفرديات وبين السلالات الجينية المختلفة للفئران. ومع ذلك ، فإن التنظيم الجيني لحجم OR غير مفهوم جيدا26،27،28،29. ويعوق الدراسات الجينية لتنظيم OR عدم وجود بروتوكولات موحدة لدراسة موجات التخلص من البويضات أثناء تطور ما قبل الولادة وبعدها. تم تطوير العديد من منهجيات تكميم البويضات في الفئران ، وأكثرها شيوعا واستخداما على نطاق واسع هي التقييم النسيجي المورفومترية للأقسام النسيجية30،31. في هذه التقنية ، يتم تحديد البويضات على أقسام تسلسلية بها بقع نسيجية ، مثل الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وعلامات الحمض شيف الدورية (PAS) أو علامات الفلورسنت. هذه التقنية موثوقة إذا ظلت جميع الظروف ثابتة ، بما في ذلك سمك القسم ، والاسترداد الفعال لجميع الأقسام في جميع أنحاء المبيض ، ومخططات العد في المختبرات الفردية. ومع ذلك، فإن الأرقام التي تبلغ عنها المختبرات المختلفة غالبا ما تختلف اختلافا كبيرا، وبالتالي لا يمكن مقارنتها بسهولة.

علاوة على ذلك ، نظرا للاختلافات الجينية ، يمكن أن يؤثر استخدام سلالات الفئران المختلفة أيضا على عدد البويضات. تم تطوير مناهج حسابية إضافية للتقييم النسيجي وتشمل الكشف الآلي عن البويضات باستخدام نهج التجزئة ، والعد التلقائي باستخدام الخوارزميات الحسابية ، وإعادة بناء الصور النسيجية ثلاثية الأبعاد لمنع الأعداد المتعددة لنفس البويضة31،32،33،34،35،36 . حتى مع إضافة هذه التحسينات إلى التقييم النسيجي المورفومتري، فإن هذه التقنية كثيفة العمالة نسبيا، خاصة بالنسبة للدراسات واسعة النطاق وعالية الإنتاجية. قد لا تكون البيانات التي تم جمعها قابلة للتكرار وقابلة للمقارنة بين الدراسات بسبب الاختلافات في مخططات العد وخوارزميات الكمبيوتر والبرامج المستخدمة.

في الآونة الأخيرة ، تسارعت من خلال تطوير طرق جديدة متعددة الفوتونات والألواح الضوئية وطرق مسح الأنسجة البصرية متوسطة الدقة ، أصبحت تقنيات النمذجة والتحليل ثلاثية الأبعاد للمبايض السليمة هي الطريقة المفضلة لتحديد أعداد البويضات بكفاءة ودراسة توطين البروتين وديناميكياته37,38. هذه الطرق 3D عادة ما تكون مفيدة مقارنة بالطرق النسيجية حيث يتم الحفاظ على الأنسجة والأعضاء بشكل أفضل والحفاظ عليها سليمة. علاوة على ذلك ، يوفر تحليل 3D والنمذجة رؤى إضافية حول الوظيفة والتفاعلات داخل وبين منافذ الخلية أو الهياكل الفرعية داخل العضو التي قد يتم تفويتها في تحليل 2D.

يتطلب تحليل 3D للأعضاء بأكملها تحسين التثبيت ، والتلطيخ المناعي ، وبروتوكولات التطهير البصري للأعضاء الفردية ، مثل المبيضين ، دون تشويه الأنسجة أو تلفها. مطلوب تحسين إضافي لتركيب العينات للتصوير للفحص المجهري عالي الدقة وقد يعتمد على منصة التصوير المتاحة. وأخيرا، فإن تصوير المبيض السليم بأكمله يولد كمية كبيرة من البيانات للتحليلات الحسابية اللاحقة. لذلك ، هناك حاجة لتطوير طرق 3D موحدة لعد البويضات للدراسات المقارنة وعبر مراحل النمو.

يستخدم هذا البروتوكول بروتوكولات التطهير المناعي القياسية والمقاصة التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، مع التركيز على نهج بسيط وسهل الاستخدام وعالي الإنتاجية38،39،40،41. تم تحسين البروتوكول لتحليل أعداد كبيرة من المبايض قبل الولادة وبعدها حتى اليوم 28 بعد الولادة (P28) وأحجام مختلفة من المبيضين من خلفيات وراثية مختلفة للفئران. خطوات تلطيخ المناعة متشابهة لجميع المراحل. ومع ذلك ، تختلف بروتوكولات المقاصة بالنسبة لمبايض البلوغ بسبب حجمها الأكبر ، ScaleS4 (0) و CUBIC للمبايض الصغيرة والكبيرة ، على التوالي40,41. علاوة على ذلك ، يتم إجراء تروية الجسم بالكامل في الفئران P28 قبل التثبيت لمنع التألق الذاتي من خلايا الدم. تم بناء مجهر متعدد الفوتونات على منصة Leica DIVE/4Tune كبديل للفحص المجهري الضوئي للحصول على الصور ، وتم اختيار برنامج IMARIS 3D Visualization and Analysis مع أدوات تحليلية مختلفة لهذا البروتوكول. هذا البروتوكول سهل المتابعة وأقل عملية ، وبالتالي توفير الوقت. علاوة على ذلك ، فإن تحديد كمية البويضات سريع نسبيا ، اعتمادا على حجم المبيض وترتيب البويضات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت جميع الفئران المستخدمة من السلالة الوراثية C57BL/6J (انظر جدول المواد). تم تسلسل هذه السلالة بالكامل وهي قياسية للعديد من الدراسات حول بنية المبيض ووظيفته. تم إيواء الفئران وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة ، وتمت الموافقة على الإجراءات التي تم تنفيذها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مختبر جاكسون. وترد الكواشف والتركيبات المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد والجدول 1 على التوالي.

1. إعداد الكواشف

  1. المثبت: تحضير 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x PBS. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 24 عينة (0.5 مل / عينة = 12 مل الحجم الكلي) ، أضف 3 مل من 16٪ PFA المجهري الإلكتروني إلى 9 مل من 1x PBS.
  2. المخزن المؤقت للنفاذية
    1. قم بقياس كحول البولي فينيل (PVA) في كوب بلاستيكي سعة 250 مل يحتوي على 1x PBS في اليوم السابق لحاجة إلى المخزن المؤقت للنفاذ. حرك المحلول طوال الليل للسماح ل PVA بالذوبان تماما.
    2. أضف بوروهيدريد الصوديوم إلى PVA المذاب واترك الخليط يتجانس لمدة 3-5 دقائق تقريبا. توقع الحل للرغوة.
    3. أضف Triton X-100 إلى الحل واستخدم المخزن المؤقت بمجرد حل Triton X-100.
      ملاحظة: يستغرق PVA وقتا طويلا حتى يذوب (3 ساعات على الأقل) ، ويعتمد تغلغل الجسم المضاد على مدى ذوبانه. بالنسبة للمبايض الكبيرة ، من الأهمية بمكان إذابة PVA تماما.
  3. حظر المخزن المؤقت
    1. قم بقياس ألبومين مصل البقر (BSA) في كوب مع 1x PBS. حرك المحلول حتى يذوب BSA.
    2. أضف الجلايسين وتريتون X-100 والبنسلين والستربتومايسين وأزيد الصوديوم. يحرك المزيج حتى يتجانس المحلول. انقل المخزن المؤقت إلى زجاجة وخزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية. أضف مصل الماعز العادي قبل الاستخدام.
  4. المخزن المؤقت للغسيل: قم بقياس PVA في كوب يحتوي على 1x PBS. حرك المحلول بين عشية وضحاها للسماح ل PVA بالذوبان. أضف تريتون X-100 وأزيد الصوديوم. بمجرد خلط المخزن المؤقت ، قم بتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  5. محلول ScaleS4 (0) (الرقم الهيدروجيني 8.1): يذوب D-sorbitol في PBS في كوب مع التحريك عند ≤100 درجة مئوية. أضف اليوريا إلى المحلول ، وبمجرد ذوبان اليوريا ، أطفئ الحرارة واترك المحلول يحرك حتى يذوب تماما. يضاف الجلسرين وثنائي ميثيل سلفوكسيد ، ويحرك حتى يتجانس المحلول. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول ScaleS4 (0) طازجا في اليوم الأول من تطهير المبايض.
  6. حل ScaleCUBIC-1
    1. تذوب اليوريا في كوب يحتوي على PBS مع التحريك عند درجة حرارة ≤100 درجة مئوية. قم بقياس N,N,N′,N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine في كوب منفصل ، ثم أضف اليوريا الذائبة ، وحرك عند درجة حرارة ≤100 درجة مئوية حتى تذوب الكواشف تماما. بمجرد أن تصبح جميع الكواشف في المحلول ، أطفئ الحرارة ، وابرد في درجة حرارة الغرفة. يخزن في الظلام.
    2. قم بتفريغ المحلول عن طريق نقله إلى قارورة تصفية. قم بتوصيل القارورة بفراغ باستخدام الأنابيب ، وقم بتغطية القارورة ، وقم بتشغيل الفراغ حتى تختفي الفقاعات في المحلول. استخدم المحلول بعد إزالة الغاز هذه.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل في الظلام لاستخدامه لمدة تصل إلى شهر.
  7. محلول السكروز: إذابة السكروز في 1x PBS. ثم قم بإزالة المحلول قبل الاستخدام.
    ملاحظة: قم بإعداد المحلول طازجا قبل الاستخدام.
  8. حل ScaleCUBIC-2
    1. يذوب السكروز في كوب يحتوي على PBS مع التحريك عند درجة حرارة ≤100 درجة مئوية. يضاف اليوريا ويحرك المزيج عند درجة حرارة ≤100 درجة مئوية حتى تذوب اليوريا. أطفئ الحرارة.
    2. أضف ثلاثي إيثانولامين وتريتون X-100. يحرك المزيج حتى يتجانس المحلول. اترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ويخزن في الظلام. قم بتفريغ المحلول قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل في الظلام لاستخدامه لمدة تصل إلى شهر.

2. تشريح وتثبيت المبايض قبل الولادة (الشكل 1 أ)

  1. تزاوج الإناث البالغات (≥8 أسابيع) والذكور وفقا للبروتوكول المؤسسي المعتمد. تحقق من وجود سدادات مهبلية كل صباح.
    ملاحظة: يتم تعيين صباح القابس المهبلي على أنه 0.5 أيام بعد الجماع (d.p.c) أو E0.5.
  2. في يوم التشريح ، قم بإعداد 4٪ paraformaldehyde (PFA) و aliquot ~ 0.5 مل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، الموضوعة على جانب المقعد (~ 4 لكل أنثى حامل).
    ملاحظة: PFA مادة خطرة ويجب التعامل معها تحت غطاء كيميائي.
  3. تحضير ثلاث صفائح 100 مم تحتوي على ~ 10 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل أنثى حامل (لحصاد الرحم ، لتشريح مجمع المبيض الميزونيفروسي ، وعزل المبايض).
  4. القتل الرحيم للإناث الحوامل اللواتي يحملن أجنة مرحلة النمو المفضلة ويشرعن في تشريحها. القتل الرحيم لا يزيد عن 1-2 أنثى في وقت واحد. استخدم بروتوكولا معتمدا للقتل الرحيم للفئران الحامل (على سبيل المثال ، التعرض لثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم).
  5. بمجرد القتل الرحيم للأنثى ، رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام الملقط ، ارفع جلد البطن واستخدم المقص لإجراء شق على شكل حرف V من خلال جدار البطن والجسم. قطع على طول جانبي الشق وتقشير الجلد مرة أخرى لفضح الأعضاء الداخلية والأجنة في الرحم.
  6. باستخدام الملقط والمقص ، قم بقطع وفصل الرحم مع الأجنة عن دهون البطن وشرايين المبيض والأوردة. قم بإزالة الرحم وضعه في صفيحة 100 مم تحتوي على 1x PBS. إطلاق الأجنة في PBS عن طريق قطع جدار الرحم وثقب كيس صفار البيض. قطع الحبل السري.
    ملاحظة: بالنسبة للأجنة التي يقل عمرها عن 15 يوما في الحمل ، يضمن القتل الرحيم للأم وإزالتها من الرحم الموت السريع للجنين. يجب قتل الأجنة التي يزيد عمرها عن 15 يوما في فترة الحمل حتى الولادة بقطع الرأس.
  7. انقل الجنين إلى طبق جديد مع 1x PBS طازجة. لقطع رأس الجنين E15.5 ، قم بتثبيت الطرفين الخلفيين بدقة على اللوحة باستخدام ملقط لشل حركة الجنين. باستخدام زوج ثان من الملقط المثبتة في اليد المهيمنة ، أمسك الرقبة بين شقوق الملقط واضغط لقطع رأس الجنين ، أو استخدم المقص لقطع الرقبة.
  8. باستخدام ملقط اليد المهيمن ، اقطع أسفل الأطراف الأمامية واسحب الجزء العلوي من الجسم برفق بعيدا. بعد ذلك ، أدخل نقطة نهاية واحدة من ملقط اليد المهيمنة في التجويف البريتوني عموديا في فتحة منطقة البطن بينما تبقى نقطة النهاية الأخرى للملقط في الخارج. أغلق الملقط ، وقرص جدار الجسم لقطعه ، وفضح الأعضاء الداخلية.
  9. باستخدام نفس الملقط ، قم بإزالة الأعضاء بلطف ، بما في ذلك الأمعاء والكبد ، حتى تصبح الكلى والأعضاء التناسلية مرئية. تحديد جنس الجنين: في E15.5 ، يكون للمبايض شكل ممدود يشبه النقانق بينما تكون الخصيتان بيضاويتين.
    ملاحظة: في المراحل المبكرة، قد تكون هناك حاجة إلى التنميط الجيني لتحديد الجنس.
  10. باستخدام زوج واحد من الملقط ، أمسك الجنين الأنثوي لأسفل واستخدم الملقط الآخر لفهم كل مركب ميزونفروس-مبيض وفصله بلطف عن الكلى والقنوات المولرية. ضع المبيضين في صفيحة جديدة مع 1x PBS ، واترك الميزونيفروس متصلا ، ولكن قم بإزالة الأنسجة المحيطة لضمان تعرض المبيضين. ضع كلا المبيضين في ~ 0.5 مل من 4٪ PFA في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وقم بإصلاحه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استبدل PFA بالإيثانول بنسبة 70٪.
  11. لتشريح وتثبيت مبايض E18.5 ، افصل الأجنة عن الرحم كما هو موضح أعلاه ثم اتبع بروتوكول الجراء قبل البلوغ الموصوف في القسم 3 (الشكل 1B).

3. تشريح وتثبيت المبيضين قبل البلوغ (الشكل 1B)

  1. تحضير 4٪ PFA و aliquot ~ 0.5 مل في أنابيب 1.5 مل ووضعها على جانب المقعد (~ أنبوب واحد لكل جرو). تحضير لوحات 35 مم مع 1x PBS (~ واحد لكل جرو). القتل الرحيم للجراء باستخدام البروتوكول المؤسسي المعتمد.
    ملاحظة: قطع الرأس هو الطريقة المفضلة للقتل الرحيم للفئران التي يبلغ عمرها 8 أيام أو أقل. يمكن قطع رأس الفئران حديثي الولادة باستخدام مقص تشريح 3-4 بوصات أو مقص Mayo مقاس 5-7 بوصات.
  2. تحديد جنس الجراء عن طريق قياس المسافة الشرجية التناسلية ، والتي هي أكبر في الذكور منها في الإناث. استخدم مقص قطع الرأس الحاد لقطع رؤوس الجراء الإناث. ضع الجسم ، الجانب المفتوح لأسفل ، على منشفة ورقية لتصريف الدم (~ 5-10 ثانية).
  3. تأمين الجرو على ظهره عن طريق وضع دبوس في وسادة مخلب كل قدم. رش البطن مع 70 ٪ من الإيثانول. استخدم الملقط لإبقاء جلد الجرو بعيدا عن الجسم واستخدم المقص لإجراء شق صغير على شكل حرف V في جلد أسفل البطن.
  4. أدخل المقص في الشق تحت الجلد وقطعه على جانبي البطن. استخدم الملقط لتقشير الجلد بلطف والكشف عن أسفل البطن. حرك الأمعاء بلطف لأعلى وحدد موقع قرون الرحم بجوار المثانة. اتبع كل قرن رحمي نحو الكلى وحدد موقع المبيض مع الأنسجة الدهنية المحيطة أسفل كل كلية.
  5. لتشريح المبيضين ، امسك قرن الرحم أسفل المبيض وقناة البيض بزوج واحد من الملقط (الملقط A ، الشكل 1B) وارفعه بلطف بعيدا عن الجسم. باستخدام زوج آخر من الملقط (الملقط B) ، أمسك بلطف أسفل الزوج الأول من الملقط بحيث يكون المبيض وقناة البيض في الوسادة الدهنية مرئيين فوق الزوج الثاني من الملقط. ثم ، اقطع أسفل الزوج الثاني من الملقط بالمقص أو اسحبه بعناية لفصل المبيضين والأنسجة المرفقة.
  6. ضع الأعضاء المعزولة في لوحة مع 1x PBS. قم بتقليم الأنسجة الدهنية الزائدة وقناة البيض وقرن الرحم لتنظيف المبيض وعزله. افتح الجراب المحيط بالمبيض بدقة وكشف المبيض بأكمله.
  7. قم بتقليم غشاء الجراب دون إتلاف المبيض واترك الأنسجة حول الهيلوم (بنية تشبه الرباط بين المبيض والجهاز التناسلي) للتعامل مع المبيض ، كما هو موضح في الشكل 1B ، P5. بمجرد تقليم المبيضين ، ضعهما في 4٪ PFA وأصلح المبيضين عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استبدل 4٪ PFA بالإيثانول بنسبة 70٪ وخزن المبيضين عند 4 درجات مئوية حتى خطوة بروتوكول تلطيخ المناعة.

4. تروية وتشريح وتثبيت مبايض البلوغ (الشكل 1C)

  1. الفئران المتدرجة وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا مع الفأر تحت التخدير العميق في غطاء الدخان الكيميائي. تحضير معدات التروية والكواشف. انظر البروتوكول المفصل في 42.
    ملاحظة: التروية هي إجراء القتل الرحيم النهائي الذي يحل محل الدم في جميع أنحاء نظام الأوعية الدموية مع مثبت الأنسجة.
  2. وزن أنثى الفأر البلوغ (P28) وتسجيل وزن الفأر (عادة بين 13 جم إلى 15 جم). احسب كمية عامل التخدير المعتمد لاستخدامه.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام 0.35 مل من ثلاثي برومو الإيثانول لكل 10 غرام من وزن الجسم في هذا البروتوكول.
  3. استخدم حقنة سعة 10 مل يمكن التخلص منها بإبرة 20 جم لملء المحقنة بعامل التخدير المعتمد. استبدل إبرة 20 جم بإبرة 26 جم × 3/8.
  4. كبح جماح الماوس بعناية عن طريق قشور جلد الرقبة الظهرية بيد واحدة. اقلب الماوس لكشف البطن. حقن الكمية المحسوبة مسبقا من المخدر في التجويف البريتوني. ضع الماوس في وعاء به غطاء حتى يصبح التخدير ساري المفعول (أي أن الماوس لم يعد يتحرك).
  5. بمجرد توقف الماوس عن الحركة ، اضغط بلطف على قدميه للتحقق من عدم وجود استجابة وتأكد من تخدير الماوس بالكامل قبل بدء التروية. ضع الماوس وثبته على ظهره عن طريق تثبيت جميع الأرجل الأربعة برفق من خلال منصات المخلب على اللوحة. تأكد من تثبيت الساقين في وضع مريح ، وليس التمدد الزائد.
  6. رش الماوس مع 70 ٪ من الإيثانول من البطن إلى منطقة الصدر. استخدم الملقط لقرص جلد البطن ورفعه بلطف ثم استخدم المقص لعمل قطع صغير على شكل حرف V عبر الجلد وجدار الجسم.
  7. ارفع رفرف الجلد بعيدا عن تجويف الجسم وأدخل المقص أسفل الجلد وجدار الجسم. قطع الجلد وجدار الجسم مباشرة نحو الرأس إلى حافة التجويف الصدري في القص.
  8. افتح التجويف الصدري عن طريق قطع الأضلاع بعناية على جانبي القص إلى أسفل الكتف مباشرة. احرص على عدم ثقب الرئتين أسفل القفص الصدري. أمسك بالجلد / اللوحات الضلعية بالملقط وقم بتثبيتها لفضح الأعضاء الداخلية.
  9. قم بتقليم أي نسيج بلطف، مثل الغدة الصعترية، قد يعيق الوصول الواضح إلى القلب. كشف جميع الأعضاء ، بما في ذلك الجهاز الهضمي ، للسماح بتأكيد بصري بأن الجسم كله منصهر ، بما في ذلك أسفل البطن.
  10. استخدم مقص التشريح لقص الأذين الأيمن للقلب وإطلاق الدم من النظام. أمسك القلب برفق باستخدام الملقط وأدخل إبرة تروية (متصلة بوحدة تحكم في المضخة التمعجية) في البطين الأيسر.
  11. ضخ ~ 10 مل من PBS ، مع ضغط لطيف ولكن ثابت ، حتى تتحول الأنسجة مثل الكبد والكلى والجهاز التناسلي (الشكل 1E ، F) من اللون الوردي إلى الأبيض. بعد ذلك ، استبدل PBS ب PFA طازج بنسبة 1٪ واستمر في التروية بحوالي 10 مل من PFA أو حتى يحدث الوخز في الجزء السفلي من جسم الماوس (على سبيل المثال ، الذيل).
    ملاحظة: تشير هزات التثبيت هذه إلى نجاح التروية.
  12. بمجرد الانتهاء من التروية ، حدد موقع وسادة الدهون مع المبيضين أسفل الكلى وتشريح الجهاز التناسلي بأكمله بلطف ، بما في ذلك وسادة الدهون والمبيضين وقرون الرحم ، ووضع الجهاز في قارورة مع 4 ٪ PFA. إصلاح المبيضين في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (~ 16-24 ساعة). بعد ذلك ، استبدل PFA بنسبة 4٪ بالإيثانول بنسبة 70٪ لمدة يوم واحد على الأقل وقم بتقليم المبيضين (الشكل 1E ، F) ، كما هو موضح أعلاه ، قبل البدء في بروتوكول تلطيخ المناعة.

5. تلطيخ مناعي كامل المبيض (الشكل 2A)

ملاحظة: مارس تقنيات معقمة أثناء بروتوكول التلطيخ المناعي ، خاصة عند تغيير المخازن المؤقتة ، لمنع التلوث أثناء فترات الحضانة الطويلة.

  1. قم بتنفيذ جميع خطوات التلطيخ المناعي في صفيحة من 24 بئرا ، كما هو موضح في الشكل 2A. اضبط وحدات تخزين الكاشف للتنسيقات الأخرى. غيري المخازن المؤقتة بعناية لتجنب فقدان المبيضين الصغيرين قبل الولادة وقبل البلوغ.
    ملاحظة: يمكن استخدام تنسيقات أخرى ، مثل لوحات 48 و 96 بئرا ، ولكن الآبار العميقة والفتحات الأضيق تجعل من الصعب استنشاق المخازن المؤقتة دون فقدان المبيضين أو إتلافهما.
  2. اليوم 1
    1. ماصة 1 مل من PBS / بئر في عدد الآبار اللازمة في لوحة نظيفة من 24 بئرا. اقطع طرف ماصة 200 ميكرولتر لعمل فتحة واسعة واستخدمها لنقل المبيضين قبل البلوغ بلطف من أنابيب 1.5 مل مع 70٪ من الإيثانول إلى الآبار. بالنسبة لمبايض البلوغ ، استخدم طرف ماصة 1000 ميكرولتر مع قطع الطرف للنقل.
      ملاحظة: يمنع الفتح الأوسع للطرف تلف الأنسجة أثناء النقل.
    2. بمجرد نقل جميع العينات إلى الآبار ، استخدم نصيحة جديدة لشفط PBS واستبدالها ب 0.8 مل طازجة من PBS / well. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة على شاكر في ~ 100-150 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. ابدأ في إعداد المخزن المؤقت للنفاذية (انظر الجدول 1 والقسم 1 ).
      ملاحظة: يمنع الطرف الجديد المبيضين من الالتصاق بالطرف ، وتسمح خطوة حضانة PBS للمبايض بالتوازن في PBS وإعادة الترطيب قبل التلطيخ.
  3. اليوم 2
    1. الانتهاء من إعداد المخزن المؤقت permeabilization. استنشاق PBS من الآبار واستبدالها ب 0.8 مل من المخزن المؤقت للنفاذية لكل بئر. ضع الألواح مرة أخرى على الخلاط واحتضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
    2. بعد 4 ساعات من الحضانة ، استنشق تماما المخزن المؤقت للنفاذية واستبدله ب 0.5 مل من المخزن المؤقت للحظر (انظر الجدول 1 والقسم 1 ). أغلق اللوحة بالبارافيلم لمنع التبخر ، وضعها في حاوية مغطاة بإحكام على شاكر ، واحتضن العينات بإثارة لطيفة في منع المخزن المؤقت بين عشية وضحاها (16-24 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
  4. اليوم 3
    1. تحضير الأجسام المضادة الأولية عن طريق التخفيف في منع المخزن المؤقت. لتصور البويضات، استخدم علامات البويضات، على سبيل المثال، الببتيداز الحمضي النووي المضاد للجراثيم (GCNA)/TRA98 لكل من مبايض ما قبل الولادة وما قبل البلوغ ومرطب الأرانب المضاد للصندوق الميت 4 (DDX4)/ماوس فاسا هومولوج (MVH) لكل من المبيضين قبل البلوغ والبلوغ. لتحديد تعبير LINE-1 ORF1p في مبايض ما قبل الولادة، استخدمي أرنب مضاد LINE-1 ORF1p أو أي جسم مضاد آخر متاح.
      ملاحظة: لا يمكن اكتشاف إشارة GCNA/TRA98 في مبايض البلوغ.
    2. استنشاق المخزن المؤقت المانع من العينات واستبدله ب 0.5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة. ختم اللوحة مع parafilm لمنع التبخر. ضع الألواح في وعاء به غطاء لمنع جفاف العينات أثناء الحضانة. ضع الحاوية على الخلاط واحتضن العينات لمدة 3-4 أيام في درجة حرارة الغرفة.
  5. اليوم 7
    1. قم بإزالة البارافيلم بلطف من الألواح وقم بشفط خليط الأجسام المضادة الأساسي من العينات. تخزين مخاليط الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى شهر أو ثلاثة استخدامات) وإعادة استخدامها في وقت لاحق عن طريق تكملة مع الأجسام المضادة الطازجة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر من أليكوت الأجسام المضادة الطازجة لكل 5 مل من الخليط المستخدم سابقا).
    2. أضف 1 مل من مخزن الغسيل العازل (انظر الجدول 1 والقسم 1 ) لكل بئر إلى العينات وهز الألواح بلطف لبضع ثوان لشطف الأجسام المضادة المتبقية. قم بشفط المخزن المؤقت للغسيل بعناية واستبدله بمخزن مؤقت للغسيل الطازج بسعة 0.8 مل وهز الألواح في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
  6. اليوم 8
    1. قم بشفط المخزن المؤقت للغسيل بين عشية وضحاها، واستبدله بمخزن مؤقت للغسيل الطازج سعة 0.8 مل، ثم رجه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. كرر خطوة الغسيل باستخدام مخزن غسيل مؤقت جديد لمدة 2 ساعة أخرى.
    2. بعد الغسيل الأخير ، استبدل مخزن الغسيل المؤقت ب 0.5 مل من خلطات الأجسام المضادة الثانوية المخففة في مخزن مؤقت مانع ، على سبيل المثال ، الماعز المضاد للفئران Alexa Fluor 555 والماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 647 عند تخفيف 1: 1000. تحضير خليط الأجسام المضادة الثانوي طازجا لكل تجربة تلطيخ مناعي.
    3. ختم اللوحة مع parafilm لمنع التبخر أثناء الحضانة. احتضن العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام أو في ألواح مغطاة بورق الألومنيوم مع إثارة لطيفة لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: تتم هذه الخطوة وجميع الخطوات اللاحقة في الظلام أو مع التفاف رقائق الألومنيوم.
  7. اليوم 11
    1. استنشق خليط الأجسام المضادة الثانوي وقم بإجراء غسل أولي باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل. هز الألواح بلطف لبضع ثوان لشطف الأجسام المضادة الثانوية المتبقية.
    2. قم بشفط المخزن المؤقت للغسيل ، واستبدله ب 0.8 مل من مخزن الغسيل الطازج ، واحتضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع الاهتزاز ، محميا من الضوء. كرر خطوة الغسيل 2 مرات لما مجموعه 3 غسلات. بعد الغسيل الثالث ، انتقل إلى خطوة التطهير (القسم 6).

6. تطهير المبايض الكاملة الملطخة بالمناعة (الشكل 2A).

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات التطهير في الظلام عن طريق لف الألواح بورق الألومنيوم أو وضعها في حاويات غير شفافة. تختلف خطوات المقاصة بالنسبة للمبايض قبل البلوغ والبلوغ.

  1. اليوم 11 [يتم مسح المبيضين قبل الولادة وما قبل البلوغ في بروتوكول من خطوة واحدة]
    1. بعد الغسيل الأخير، قم بشفط مخزن الغسيل المؤقت واستبدله بمحلول ScaleS4(0) الطازج الصنع (انظر الجدول 1 والقسم 1 ). أغلق اللوحة بالبارافيلم واحتضن العينات في الظلام مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام قبل التصوير.
    2. استبدل محلول ScaleS4 (0) بمحلول جديد يوميا إذا لزم الأمر ؛ انتبه أثناء استبدال المحاليل ، حيث تصبح المبايض التي تم تطهيرها شفافة ويصعب رؤيتها. بعد التطهير، انتقل إلى إعداد العينات والتصوير (القسم 7).
      ملاحظة: لم يؤد تغيير الحلول إلى تحسين جودة الصورة بشكل كبير. تزيد التغييرات اليومية من احتمال فقدان عينات صغيرة وشفافة في الغالب.
  2. الأيام 11-15 [يتم مسح مبايض البلوغ في بروتوكول من خطوتين]
    1. بعد آخر غسل مناعي ، استنشق مخزن الغسيل المؤقت واستبدله ب 0.8 مل من ScaleCUBIC-1 (انظر الجدول 1 والقسم 1 ). أغلق اللوحة باستخدام البارافيلم وهز العينات بلطف عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام في الظلام. استبدل محلول ScaleCUBIC-1 بالمحلول الطازج يوميا.
    2. في اليوم 15 ، اغسل العينات 3 مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة في 0.8 مل من PBS في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. استبدل PBS ب 0.8 مل من السكروز المنزوع الغاز بنسبة 20٪ المحضر طازجا باستخدام PBS. رج بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    3. استبدل محلول السكروز بنسبة 20٪ بمحلول ScaleCUBIC-2 بنسبة 0.8 مل (انظر الجدول 1 والقسم 1 ) ، وأغلق اللوحة بالبارافيلم ، ورجها بلطف في درجة حرارة الغرفة مع التغييرات اليومية لمحلول ScaleCUBIC-2. مسح لمدة 4-5 أيام وانتقل إلى الصورة. احرصي عند تبادل المحاليل لتجنب فقدان العينة لأن المبيضين اللذين تم تطهيرهما شفافان ويصعب رؤيتهما. انتقل إلى إعداد العينات والتصوير (القسم 7).

7. إعداد العينات والتصوير باستخدام مجهر متعدد الفوتونات

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات الموضحة أدناه باستخدام Leica DIVE / 4TUNE / FALCON مع اثنين من ليزر Ti:Sapphire متعدد الفوتونات قابل للضبط مع مدة نبض تبلغ 120 fs مع هدف غمر متعدد 16x / NA0.6 (سائل الغمر = الجلسرين) مع مسافة عمل قصوى تبلغ 2.2 مم. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول برنامج الحصول على الصور. يوضح الجدول التكميلي S1 والشكل التكميلي S1 الإعدادات المستخدمة لهذا البروتوكول. بالنسبة لمنصات التصوير الأخرى، استشر نواة الفحص المجهري أو اتبع مواصفات/توصيات الشركات المصنعة.

  1. إعداد العينة
    1. قم بإعداد الإعداد لتركيب العينات. على سبيل المثال ، استخدم طوقا سيليكون لزجا ومرنا لإنشاء بئر لاصق. ضع البئر اللاصق على غطاء واحد 25 مم × 25 مم رقم 1.5 صغير لإنشاء بئر يتم فيه وضع المبيضين (الشكل 2B).
      ملاحظة: حشية بسماكة 1 مم تستوعب جميع أحجام المبايض. يوصى بهذا الإعداد لأنه يلغي حركة المبيض أثناء التصوير ، والتي يمكن أن تحدث عندما يتم وضع المبيضين في حامل في طبق من أسفل الزجاج.
    2. باستخدام طرف ماصة مع قطع الطرف (20 ميكرولتر لما قبل الولادة وما قبل البلوغ) ، انقل المبيضين باستخدام ~ 5-10 ميكرولتر من محلول ScaleS4 (0) إلى منتصف المادة اللاصقة كما هو موضح في الشكل 2B. بالنسبة لمبيض البلوغ، استخدمي طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع قطع الطرف بعيدا بما يكفي لنقل المبيضين. أضف ~ 15-20 ميكرولتر من محلول ScaleCUBIC-2 في منتصف البئر اللاصقة.
      ملاحظة: قد يتسبب الكثير من المحلول في التسرب إلى مرحلة المجهر ، وسيؤدي الحل القليل جدا إلى جودة صورة رديئة. استخدم مجهر التشريح لنقل العينات حيث تصبح المبايض التي تم تطهيرها شفافة ويصعب رؤيتها.
    3. بمجرد نقل المبيضين إلى آبار فردية مع قطرة من محلول التطهير ، ضع بلطف زجاج غطاء آخر على البئر اللاصق ، واضغط لإنشاء ختم ، واحتفظ بالعينات في مكانها في مجموعة صغيرة من محلول التطهير المحصور بين الغطاءين (الشكل 2B). للتصوير ، ضع "ساندويتش" coverslip في شريحة محول المجهر المطبوعة 3D (على سبيل المثال ، 43 ).
      ملاحظة: الآبار اللاصقة قابلة لإعادة الاستخدام بعد تفكيك "الشطيرة" والغسيل بالماء.
  2. التصوير (الجدول التكميلي S1 والشكل التكميلي S1)
    1. قم بتشغيل المجهر والبرامج وفقا لإرشادات قلب الفحص المجهري أو الشركة المصنعة. ضع العينات المثبتة على مرحلة المجهر وانظر من خلال العدسة لتحديد موقع العينة المضاءة بمصباح LED فلوري منخفض الطاقة.
    2. بمجرد تحديد موقع العينات ، قم بتشغيل الليزر (الليزر) وقم بتعيين كل كاشف لصبغة / علامة Alexa Fluor محددة. بالنسبة لأشعة الليزر المتعددة، اسمح بالحصول على صور متتابعة. احصل على المكدس بالكامل قبل تبديل الليزر.
      ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام ليزر واحد للحصول على صورة لكل من 555 نانومتر و 647 نانومتر من الفلوروفورات.
    3. قم بإعداد المعلمات للحصول على الصور وفقا لمواصفات نواة الفحص المجهري أو الشركة المصنعة. استخدم الحصول على الصور ثنائية الاتجاه، إن وجدت، لتقليل وقت المسح الضوئي وتحسين الكفاءة. اضبط الإعدادات الأخرى، بما في ذلك متوسط الخط (1) ومتوسط الإطار (1) وتراكم الإطارات (1).
      ملاحظة: يسمح الحصول على الصور ثنائية الاتجاه لأشعة الليزر بالمسح الضوئي في كلا الاتجاهين أثناء تحركها على المحور X.
    4. قم بإعداد Z-Stack عن طريق تحديد البداية (أسفل العينة/الغطاء الزجاجي السفلي) وموضع النهاية (أعلى العينة/الغطاء الزجاجي العلوي). حدد حجم الخطوة Z من 2 ميكرومتر للمبايض قبل البلوغ و 5 ميكرومتر للمبايض البلوغ.
    5. قم بتنشيط ميزة Z-compensation ، وضمن هذه الميزة ، قم بتنشيط كسب الإثارة. اضبط تعويض Z لأسفل العينة وأعلاها عن طريق تحديد كثافة ليزر لكل من الجزء السفلي (الكثافة المنخفضة) والمكدس العلوي (الكثافة العالية). انظر الشكل التكميلي S1 ، تعويض Z الخطي ، حيث يتم تحديد مربع كسب الإثارة ، ويتم تعيين كثافة الليزر للأسفل (0) والأعلى (347.75) على أنهما 10 و 12 ، على التوالي.
    6. استخدم وضع التجانب للعينات الأكبر التي لا يمكن التقاطها في مجال رؤية واحد. قم بتنشيط متصفح الصور والإشارة إلى عدد البلاطات اللازمة لالتقاط العينة بأكملها باستخدام أداة وضع العلامات المستطيلة.
    7. ابدأ في الحصول على الصورة. بالنسبة للصور ذات اللوحات المتعددة، ابدأ في الحصول على الصور باستخدام المستكشف لالتقاط جميع اللوحات. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة، احفظ أولا جميع الصور، وإذا تم الحصول على تجانبات متعددة، فقم بتشغيل أداة دمج الفسيفساء لدمج التجانبات في صورة واحدة.
    8. احفظ الملفات المدمجة في مجلد مشروع منفصل لتسهيل العمل مع الصور بحجم جيجابايت. نقل الملفات لمعالجة الصور مع 3D صورة التصور وبرنامج التحليل. يوضح الشكل 3 الصور التمثيلية التي تم التقاطها في مراحل مختلفة مع علامتين (GCNA و DDX4).

8. معالجة الصور

ملاحظة: تم تطوير جميع الخطوات الموضحة أدناه وتنفيذها باستخدام برنامج IMARIS 3D لتصور الصور وتحليلها.

  1. قم باستيراد الصورة (الصور) إلى برنامج تصور وتحليل الصور ثلاثي الأبعاد ، وإذا لزم الأمر ، قم بتحويل الملفات من التنسيق الأصلي (على سبيل المثال ، .lif و .czi و .lsm و .lei و .oib و .oif و .nd2) إلى تنسيق .ims.
  2. إذا لزم الأمر، قم بمعالجة الصور باستخدام مرشح غاوسي لتقليل البكسل (الشكل 4A). باستخدام ميزة العرض 3D ، ضع الصورة وقم بإلغاء تحديد خيار الإطار (لإزالة الإطار ).
    ملاحظة: هناك مرشحات اختيارية أخرى، يمكن استخدامها أيضا لتقليل البكسل وتقليل كثافة الخلفية.
  3. قم بتكبير الصورة إلى مقياس معين واستخدم ميزة اللقطة. اضبط التفضيلات على النحو التالي: حدد 300 نقطة في البوصة، واحفظ كصورة TIFF، وخلفية شفافة. التقط لقطة للصورة واحفظها. يوضح الشكل 3 الصور المجمعة بالكامل.

9. تحديد كمية البويضات

ملاحظة: يمكن استخدام التألق المناعي للمبيض الكامل وتصور وتحليل الصور ثلاثية الأبعاد لتقدير أعداد البويضات في المبيضين الكاملين (الشكل 3 والشكل 4) باستخدام ميزة Spot. يمكن استخدام إشارة GCNA لتحديد كمية البويضات في المبيضين قبل الولادة وما قبل البلوغ، كما هو موضح في الشكل 4 (P5). في مبايض البلوغ، استخدم إشارة DDX4 لتحديد مجموعتين من البويضات في بصيلات غير متنامية (بنية "تشبه الحلقة"، سهم مغلق) وبصيلات متنامية (هياكل كبيرة، سهم مفتوح، الشكل 4، P28).

  1. حدد حجم البويضات التي سيتم استخدامها كمعلمة لقياس البويضات باستخدام ميزة البقع في الخطوة 9.2.
    1. افتح الصورة وحدد خيار شريحة لفتح صورة Z-stack.
    2. حدد خيار الخط في لوحة القياس وقم بقياس المسافة عن طريق رسم خط من حافة واحدة من البويضة / العلامة إلى الحافة الأخرى في أوسع نقطة لتحديد قطر XY لنوع / حجم البويضة المراد حسابه. تحرك عبر المكدس واحصل على نطاق الأقطار لبويضات متعددة من نفس النوع. استخدم أقصر طول كمعيار لاختيار الحجم لعدد البويضات.
  2. ميزة البقع: حدد خيار 3D View وقم بتنشيط وظيفة إضافة بقع جديدة في لوحة المشهد لفتح لوحة الخوارزمية. قم بإلغاء تحديد جميع إعدادات الخوارزمية حيث سيتم استخدام مرشح تحديد الحجم مع حجم البويضة الذي تم الحصول عليه في الخطوة 9.1.
    1. انقر على سهم واحد للأمام للانتقال إلى القناة المصدر. حدد القناة التي تحتوي على العلامة المفضلة واكتب في قطر XY المقدر الذي تم الحصول عليه في الخطوة 9.1. على سبيل المثال، استخدمي قطر XY يقدر ب 7 ميكرومتر للبويضات السابقة للولادة و 11 ميكرومتر للبويضات P5 (GCNA = إشارة خضراء; الشكل 3 والشكل 4 ألف).
    2. استخدم 30 ميكرومتر لإشارة DDX4 لتقدير عدد البويضات في البصيلات النامية في مبايض P5 (DDX4 = إشارة أرجوانية; الشكل 3 والشكل 4 ألف). بالنسبة لمبيض البلوغ، استخدمي إشارة DDX4 لتحديد كميات البويضات. على سبيل المثال ، استخدم أقطار XY من 15 ميكرومتر و 80 ميكرومتر لتحديد البويضات داخل البصيلات غير المتنامية والبصيلات النامية ، على التوالي ، كما هو موضح في الشكل 4A.
      ملاحظة: قد يختلف الحجم المحدد بسبب معايير الحصول على الصور ونوع المجهر المستخدم. قد يختلف الاختيار أيضا بين السلالات الجينية لأن المبيضين اللذين يحتويان على المزيد من البويضات سيتطلبان اختيارات أصغر حجما للكشف الآلي عن البويضات بشكل أفضل.
    3. بعد تحديد الحجم، قم بتنشيط استطالة PSF النموذجية وطرح الخلفية، والتي يتم تحديدها تلقائيا. حدد السهم الأمامي الفردي للانتقال إلى لوحة تصفية النقاط . أضف عامل تصفية الجودة وحدد عتبة. لضمان التقدير الدقيق لأعداد البويضات، قم بتكبير الصورة حيث يتم ضبط العتبة لاختيار قيمة عتبة تختار معظم البويضات. انقر على السهم المزدوج لإنهاء عمليات العد التلقائية.
    4. تحقق يدويا من البويضات المحددة باستخدام علامة التبويب تحرير لتحديد البويضات الفائتة أو إلغاء تحديد الجسيمات غير البويضة المحددة بواسطة العتبة التلقائية. سجل البيانات في علامة التبويب إحصائيات ضمن علامة التبويب إجمالي لمزيد من التحليل.
      ملاحظة: يمكن حفظ المعلمات المستخدمة لحساب البقع واستخدامها لمجموعة عينات أخرى ولكن يوصى بإجراء فحص يدوي قبل تشغيل تحليل الدفعات.
    5. لتخزين المعلمات ، انقر فوق علامة التبويب إنشاء وانقر فوق معلمات المتجر للدفعة.
      ملاحظة: يمكن التعرف بسهولة على العلامات النووية (بويضات GCNA+ ، الشكل 4A) بواسطة ميزة البقعة وقد لا تتطلب الكثير من الضبط اليدوي. ومع ذلك ، فإن العلامة السيتوبلازمية (بويضة DDX4 + ، الشكل 3 (P28 ، السهم المغلق) والشكل 4A) ستتطلب المزيد من التعديل اليدوي لضمان تحديد الحجم / النوع الصحيح للبويضة.

10. تحديد حجم التعبير عن البروتين في المبيضين

ملاحظة: هناك عدة طرق لقياس تعبير البويضات عن علامات معينة باستخدام كل من ميزة البقع (القسم 9 والخطوة 10.1) وميزة الأسطح (الخطوة 10.2). يمكن استخدام ميزة البقع للبروتينات ذات أنماط التوطين المتميزة مثل العلامات النووية (GCNA) ، ويمكن استخدام ميزة الأسطح للبروتينات ذات أنماط التوطين غير الموحدة كما هو موضح في الشكل 5A حيث تم قياس كثافة LINE-1 ORF1p في المبيضين E15.5 و E18.5. لحساب ومقارنة شدة البروتين محل الاهتمام بين عينتين (على سبيل المثال ، النقاط الزمنية أو العلاجات أو الأنماط الوراثية) ، قم بجمع الصور بنفس الخصائص. استخدم العينات ذات الإشارة الأكثر كثافة لتحديد المعلمات التي يمكن تخزينها واستخدامها للعينات الأخرى.

  1. للحصول على تعبير البروتين باستخدام ميزة Spots ، حدد أولا البويضات كما هو موضح (القسم 9).
    1. ثم ضمن ميزة النقاط ، حدد علامة التبويب إحصائيات ، متبوعة بعلامة التبويب تفصيل . انقر على السهم لأسفل وحدد قيم محددة ، والتي ستفتح علامة تبويب أخرى تحتها تحتوي على قياسات مختلفة. حدد متوسط كثافة القناة المستخدمة لتوليد السطح (أو حدد قياسات الكثافة الأخرى مثل متوسط الكثافة).
    2. للحصول على المعلومات الإحصائية المجمعة/المتوسطة، حدد معيار متوسط القيم . بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتصدير البيانات وحفظها لمزيد من التحليل.
  2. للحصول على تعبير البروتين باستخدام ميزة Surfaces ، افتح الصورة، وحدد خيار 3D View وقم بتنشيط وظيفة إضافة أسطح جديدة في لوحة المشهد لفتح لوحة الخوارزمية . قم بإلغاء تحديد جميع إعدادات الخوارزمية إذا لم تكن هناك حاجة إليها وانقر فوق السهم الأمامي الفردي للانتقال إلى قناة المصدر.
    1. حدد القناة التي تحتوي على إشارة الأجسام المضادة المراد قياسها. الخصائص الأخرى التي يجب تحديدها هي خيارات خاصة بالمستخدم. هنا ، تم استخدام إشارة LINE-1 كعلامة. تم الاحتفاظ بقيم تفاصيل الأسطح وطرح الخلفية (التباين المحلي) عند القيم الافتراضية 1.42 و 5.33 على التوالي.
    2. انقر على السهم الأمامي للانتقال إلى لوحة العتبة. اختر قيمة عتبة قابلة للمقارنة في كلتا العينتين (على سبيل المثال، هنا، تم استخدام تعبير LINE-1 في E18.5 لاختيار عتبة). حدد تمكين بقطر افتراضي لنقاط البذور يبلغ 7.10 (تم العثور على هذه القيمة مثالية للصور ولكنها قد تعتمد على حجم البكسل المتوقع للميزات).
    3. انقر على السهم الأمامي للانتقال إلى لوحة تصفية الأسطح . تم استخدام مرشح الجودة ، وقم بتأسيس القيمة ، كما هو الحال مع قيمة العتبة ، على التعبير عن البروتينات في كلتا العينتين المبيضين. بمجرد تحديد خاصية المرشح ، انقر فوق السهم الأمامي المزدوج لإكمال توليد السطح.
    4. للحصول على قيم الكثافة، حدد علامة التبويب إحصائيات ، متبوعة بعلامة التبويب مفصلة . انقر على السهم لأسفل وحدد قيم محددة ، والتي ستفتح علامة تبويب أخرى تحتها تحتوي على قياسات مختلفة.
    5. حدد متوسط كثافة القناة المستخدمة لتوليد السطح (أو حدد قياسات كثافة أخرى مثل متوسط الكثافة).
    6. للحصول على المعلومات الإحصائية المجمعة/المتوسطة، حدد معيار متوسط القيم . بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتصدير البيانات وحفظها لمزيد من التحليل (الشكل 5C).

11. تقدير إجمالي أعداد البويضات في المبيض التالف مع التصحيح الحسابي

ملاحظة: إذا حدث تلف بسيط في المبيض أثناء التشريح، فقد يكون من الممكن تقدير إجمالي عدد البويضات حسابيا. يوصى باستخدام المبيضين السليمين من نفس السلالة ومرحلة النمو لتقدير عدد البويضات كما هو موضح في الشكل 6. تشير عمليات المحاكاة التي أجريت مع المبيضين عند E15.5 إلى أن تصحيح الخسارة بنسبة ≥30٪ يؤدي إلى انحراف كبير عن الأرقام الفعلية (الشكل 6C).

  1. افتح صورا للمبايض السليمة باستخدام IMARIS وحدد ميزة الإطار. ضمن إعدادات الإطار، حدد المربع والشبكة وعلامات التجزئة وتسميات المحور. ضمن علامة التبويب الموضع X/Y/Z، حدد 200 ميكرومتر لإنشاء علامات اختيار بمسافات 200 ميكرومتر في جميع مواضع X/Y/Z.
    ملاحظة: تنشئ علامات التجزئة شبكة/مسطرة في مستويات X وY وZ لتحديد البويضات داخل منطقة معينة.
  2. قم بتنشيط ميزة البقع لتحديد البويضات كما هو موضح في القسم 9 (الشكل 4). قم بإنشاء نموذج 3D باستخدام البويضات المحددة في جميع المبايض السليمة المستخدمة في المحاكاة عن طريق تحديد اسفير ضمن علامة التبويب نمط / جودة النقاط في ميزة البقع .
    ملاحظة: يمكن أيضا تغيير عرض البكسل ضمن علامة التبويب نمط النقاط/جودتها .
  3. باستخدام الصندوق الذي تم إنشاؤه في الخطوة 11.1 ، قم بمحاذاة النماذج ثلاثية الأبعاد للمبايض السليمة في نفس الاتجاه كما هو موضح في الشكل 6A.
  4. باستخدام علامات التجزئة 200 ميكرومتر (الخطوة 11.1) ، حدد البويضات التي تقع ضمن 50٪ من حجم كل مبيض. انقر على ميزة البقع وحدد تحرير التسميات لتصنيف البويضات التي تقع ضمن منطقة 50٪ حسب اللون ، كما هو موضح في الشكل 6A.
    ملاحظة: بمجرد تصنيف البويضات في منطقة ما، سيتم توفير عدد البويضات التي تقع ضمن كل فئة.
  5. قم بتكبير منطقة 50٪ وتغيير علامات التجزئة من 200 ميكرومتر إلى 50 ميكرومتر لإنشاء مسطرة أصغر لتحديد البويضات. الحفاظ على نسبة التكبير/التصغير في جميع الصور. باستخدام علامات التجزئة 50 ميكرومتر كدليل ، قسم منطقة 50٪ إلى خمسة أجزاء متساوية.
    ملاحظة: تمثل البويضات داخل كل جزء 10٪ من الحجم كما هو موضح في الشكل 6A ، حيث يظهر المبيض السليم البويضات في النصف العلوي من المبيض مصنفة بخمسة ألوان مختلفة مع كل لون يمثل البويضات داخل منطقة حجمية 10٪.
  6. سجل أعداد البويضات في كل منطقة بنسبة 10٪ كما هو موضح في الشكل 6A ، B. احسب متوسط عدد البويضات لزيادات 10 و 20 و 30 و 40 و 50٪.
  7. استخدم المميز في الخطوات من 11.1 إلى 11.6 للحصول على أرقام البويضات في المبيض الجزئي التالف. ضع المبيض التالف في نفس اتجاه المبيضين السليمين وقدر حجمه/نسبته المفقودة كما هو موضح أعلاه.
  8. لتقدير إجمالي عدد البويضات في المبيض بأكمله ، أضف متوسط عدد البويضات المحسوبة لحجم مماثل للعدد الذي تم الحصول عليه من المبيض الجزئي (الشكل 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتيح التلطيخ المناعي وتصوير المبيض بأكمله تصور وقياس حجم البويضات أو تعبير البروتين في المبيضين في مراحل النمو المختلفة باستخدام نفس التقنية والعلامات (الشكل 3). تم تطوير هذا البروتوكول لمشروع واسع النطاق يتطلب تحليل المبيضين على مراحل متعددة ومن سلالات متعددة من الفئران. هنا ، نقدم البيانات التي تم جمعها لسلالة C57BL6 / J ، وهي سلالة قياسية للتحليل الجيني. التقنية المعروضة هنا واضحة ، ويمكن الحصول على النتائج في غضون 14-19 يوما (الشكل 2D) ويمكن استخدامها للمبايض من الإناث قبل الولادة وما قبل البلوغ والبلوغ (الشكل 1 والشكل 2A ، B).

تم استخدام هذا النهج لدراسة ديناميكيات فقدان البويضات التي تحدث بشكل طبيعي أثناء تكوين احتياطي بويضة المبيض. في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك الفأر ، يعتقد أن أعداد البويضات تبلغ ذروتها خلال حياة الجنين في الوقت الذي تدخل فيه البويضات الانقسام الاختزالي ~ E13.5. تنخفض أعداد البويضات بسبب العملية التي لا تزال غير مفهومة تماما لاستنزاف بويضة الجنين (FOA) (من ~ E15.5 إلى E18.5) ، والتي تم ربطها ميكانيكيا بالتعبير عن retrotransposon LINE-120,21. يتم التخلص من المزيد من البويضات بعد E18.5 إلى P0 بسبب القضاء على البويضات غير الطبيعية بواسطة نقطة تفتيش الجودة meiotic22,23. للتحقيق في هذه العمليات باستخدام هذا البروتوكول ، قمنا بمناعة المبايض وتصويرها في مراحل النمو المختلفة باستخدام DDX4 و GCNA كعلامات بويضة كما هو موضح في الشكل 3.

تشاهد البويضات الصغيرة التي تعبر عن GCNA و DDX4 من E15.5 فصاعدا وتمثل البويضات أثناء MPI أو يتم القبض عليها عند الإملاء داخل البصيلات البدائية. تم الكشف عن البويضات المتنامية الأكبر حجما ذات التعبير القوي DDX4 بالفعل في مبايض P2 حيث تمثل على الأرجح الموجة الأولى من البصيلات44. وينظر إلى أعداد متزايدة من البويضات الكبيرة في المبيضين P5 و P28. تمت معالجة الصور التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر متعدد الفوتونات (الشكل 4A) باستخدام برنامج IMARIS وتم إجراء عرض ثلاثي الأبعاد لتحديد البويضات الصغيرة والكبيرة النمو استنادا إلى إشارة GCNA النووية والحجم المحدد بواسطة إشارة DDX4 (الشكل 4A والفيديو 1). تم حساب البويضات كما هو موضح في البروتوكول ويتم تلخيص النتائج في الشكل 4B. بالاتفاق مع الدراسات السابقة ، لاحظنا فقدان كبير للبويضة من E15.5 إلى E18.5 (~ 32٪) و E18.5 إلى P2 (~ 24٪). بحلول الوقت الذي تصل فيه الإناث إلى سن البلوغ (P28) ، نجا فقط ~ 30٪ من البويضات الموجودة في E15.5.

يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا لمراقبة عواقب العلاجات السامة للوراثة مثل التشعيع ، والتي ثبت أنها تقضي تماما على احتياطي الجريب البدائي في غضون أسبوع واحد23،38،45. هناك فرق بصري كبير واضح بين المبيض بأكمله المعالج بالإشعاع والتحكم غير المعالج في الشكل 3 (مقارنة مبايض P28 من الإناث المعالجة وغير المعالجة). في مبيض P28 دون التعرض للإشعاع ، لاحظنا مجموعتين من البويضات تحمل علامة DDX4. بويضات صغيرة وفيرة في بصيلات بدائية (سهم مغلق) ؛ والبويضات الأكبر حجما ذات الأحجام المختلفة الموجودة عادة في البصيلات النامية (على سبيل المثال، الأولية والثانوية والأولية) (الشكل 3). في المقابل ، فإن المبيض من أنثى تتعرض ل 0.5Gy من الإشعاع γ في P7 خال تماما من البويضات الصغيرة في البصيلات البدائية كما لوحظ سابقا في أقسام 2D. ومن المثير للاهتمام أن البويضات الكبيرة ذات الحجم المماثل فقط نجت من الإشعاع. قد تكون هذه هي بصيلات الموجة الأولى التي تنمو بالفعل في مبيض P7 ، حيث من المعروف أنها مقاومة للإشعاع46 (الشكل 3 ، P28).

بالإضافة إلى التحديد الكمي لأعداد البويضات ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتلطيخ المناعي والتحليلات الكمية للبروتينات الأخرى المشاركة في تطوير البويضات. على سبيل المثال، استخدمنا أجساما مضادة ضد بروتين LINE-1ORF1p، وهو بروتين مرافقة ملزم للحمض النووي الريبي، ينتجه الترانسبوزونات الرجعية LINE-1 (الشكل 5). تم اقتراح زيادة في وفرة عناصر LINE-1 من E15.5 إلى E18.5 للتسبب في التخلص من البويضات20,21. في الواقع، باستخدام الصور الملتقطة متعددة الفوتونات وتحليل كثافة الإشارة في IMARIS، لوحظ أن مستويات LINE-1 ORF1p تزداد بشكل كبير في البويضات خلال هذا الوقت، وهو ما يرتبط بانخفاض كبير في أعداد البويضات كما هو موضح في الشكل 4B.

في الظروف التي يتلف فيها جزء من المبيض أو يفقد، يمكن استخدام المبيضين من نفس السلالة ومرحلة النمو لتقدير عدد البويضات داخل المنطقة المفقودة حسابيا كما هو موضح في الشكل 6. تم استخدام البيانات من مبايض E15.5 للمحاكاة لاختبار دقة التصحيحات الحسابية. يمكن تقدير البويضات في المبيضين مع تلف الأنسجة بنسبة تصل إلى 30٪ حسابيا على أنها ≤10٪ من الانحراف مقارنة بالبويضات في المبيض السليم ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام تلطيخ المبيض ثلاثي الأبعاد والنمذجة بشكل فعال لإنقاذ البيانات من الأنسجة الثمينة. تشير عمليات المحاكاة التي أجريت مع المبيضين عند E15.5 إلى أن تصحيح الخسارة بنسبة ≥30٪ يؤدي إلى انحراف كبير عن الأرقام الفعلية (الشكل 6C).

Figure 1
الشكل 1: تشريح المبيض والتروية من الإناث من مراحل ما قبل الولادة وبعدها. (A-C) يتطلب تشريح المبيض من مراحل مختلفة تقنيات مختلفة ، والتي يتم تصويرها تخطيطيا لاستكمال الأوصاف في الفيديو. (د) المبيضان في اليوم 5 (P5) بعد الولادة أصغر بكثير من P28 ، مما يتطلب بروتوكول تطهير مختلف كما هو موضح في البروتوكول. (E,F) التروية المناسبة للمبايض مهمة للقضاء على تلطيخ الخلفية من خلايا الدم الحمراء. المسالك التناسلية والمبيضين غير المندمجين لهما لون وردي بينما تتحول الأعضاء المنصهرة إلى اللون الأبيض. اختصار: RI = المسالك التناسلية غير المنصهرة. تم إنشاء الصور A-C باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التلطيخ المناعي وإزالة وتصوير مبايض الفئران بأكملها. (أ) يصور مخطط التدفق خطوات مشتركة ومحددة لبروتوكول التلطيخ المناعي وإزالة المبيضين قبل الولادة / ما قبل البلوغ والبلوغ. (ب) يتم تركيب المبيضين المسحوبين في قطرة من محلول المقاصة في منتصف مادة لاصقة محصورة جيدا بين زلتين للغطاء. للتصوير ، يتم وضع العينات المثبتة في شريحة محول مطبوع 3D. (ج) صور متعددة الفوتونات ذات تدرج رمادي للمبايض غير المندمجة مقابل المبيضين المندمجين، ملطخة بالمناعة مع علامة البويضة DDX4، تظهر جودة صورة محسنة وتلطيخا غير محدد أقل بعد التروية. يشير السهم المغلق إلى بويضة ذات طبقة رقيقة من تلطيخ DDX4 السيتوبلازمي النموذجي للبصيلات البدائية ، وتظهر الأسهم المفتوحة بويضات أكبر داخل البصيلات المتنامية. تشير العلامة النجمية إلى التألق الذاتي من الأوعية الدموية. (D) يجعل 3D من الصور البؤرية مقابل الصور متعددة الفوتونات من المبايض P5 ، ملطخة بالمناعة مع علامات البويضات GCNA (الأخضر) و DDX4 (أرجواني) ، مما يدل على انحراف كروي كبير من المجهر البؤري وتقريبا لا شيء من متعدد الفوتونات. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (C، D) و 50 ميكرومتر (الإدخالات في D). الاختصارات: GCNA = الببتيداز الحمضي النووي للخلية الجرثومية. DDX4 = مهبط طائرات الهليكوبتر DEAD-box 4. تم إنشاء الصورة A باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور تمثيلية ثلاثية الأبعاد للمبايض من مراحل النمو المختلفة. عروض ثلاثية الأبعاد من صور متعددة الفوتونات لمبايض جبل كاملة ملطخة بالمناعة مع GCNA (أخضر) و LINE-1 ORF1p (أزرق) أو DDX4 (أرجواني) ، في مبايض ما قبل الولادة وما بعد الولادة ، على التوالي. يتم تقديم القنوات الفردية باللون الرمادي لإظهار الإشارات النووية والسيتوبلازمية. تحدد المربعات البيضاء المناطق المكبرة في الأجزاء السفلية اليسرى. يتم عرض مبايضين مختلفين ل P28. يحتوي المبيض من الأنثى غير المشععة (الأعلى) على مجموعة كبيرة من البويضات الصغيرة في البصيلات البدائية (انظر inset). في المقابل ، فإن المبيض من الأنثى المشععة في P7 مع 0.5 Gy من الإشعاع γ (IR) خال تماما من البويضات الصغيرة في البصيلات البدائية (انظر inset). يشير السهم المغلق إلى بويضة ذات طبقة رقيقة من تلطيخ DDX4 السيتوبلازمي النموذجي للبصيلات البدائية ، وتظهر الأسهم المفتوحة بويضات أكبر داخل البصيلات المتنامية. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر ؛ 30 ميكرومتر ل P28 insets ؛ 10 ميكرومتر لجميع الإدخالات الأخرى. تحتوي الإعدادات الداخلية على طرق عرض مكبرة للصور المقدمة 3D التي تم إنشاؤها في IMARIS وقد تختلف قليلا عن الصور منخفضة التكبير بسبب المنظور. الاختصارات: غير الأشعة تحت الحمراء = التحكم غير المشعع ؛ الأشعة تحت الحمراء = المشععة في P7 مع 0.5 غراي من γ الإشعاع. GCNA = الببتيداز الحمضي النووي للخلايا الجرثومية ؛ DDX4 = مهبط طائرات الهليكوبتر DEAD-box 4 ؛ LINE-1 = العنصر النووي الطويل المتخلل-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: معالجة الصور ، وعرض 3D للبويضات ، ونتائج القياس الكمي. (أ) تمت معالجة الصور ثلاثية الأبعاد من الصور متعددة الفوتونات (يسار) في IMARIS باستخدام مرشح Gaussian (الأوسط) وتم تحديد البويضات ذات الأحجام الصغيرة والكبيرة باستخدام ميزة البقعة (يمين). المبايض P5 و P28 الموضحة كمثال. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (P5) ؛ 10 ميكرومتر (مجموعات P5) ؛ 300 ميكرومتر (P28) ؛ 50 ميكرومتر (P28 insets). (ب) تم قياس البويضات الصغيرة الإيجابية ل GCNA كميا في المبيضين من مراحل مختلفة باستخدام ميزات البقعة (أعلى). ولتوضيح انخفاض أعداد البويضات أثناء التطوير، تم حساب متوسط النسبة المئوية للبويضات في كل مرحلة مقارنة بمتوسط العدد الموجود في المرحلة المبكرة التي تم حسابها عند E15.5 (أسفل). لاحظ الانخفاض الكبير في أعداد البويضات من E15.5 إلى E18.5. تم تقديم البيانات كوسيلة ± SD. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism وتحليلها بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه ، وتم تحديد الأهمية من خلال اختبار المقارنة المتعددة بعد تخصيص Bonferroni. * P ≤ 0.05 ؛ P ≤ 0.0001 ؛ ns >0.05. اختصار: GCNA = الببتيداز الحمضي النووي للخلايا الجرثومية ؛ ns = ليست كبيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الكشف عن تعبير LINE-1 ORF1p وتحديده كميا في بويضات الجنين. (أ) تظهر العروض ثلاثية الأبعاد من الصور متعددة الفوتونات تعبير LINE-1 ORF1p (الأزرق) في بويضات الجنين E15.5 و E18.5 (المميزة ب GCNA الأخضر). (ب) أسطح 3D التي تم إنشاؤها في IMARIS باستخدام صور الصف العلوي في اللوحة A. (ج) يظهر تحليل كثافة LINE-1 ORF1p تعبيرا أعلى عن LINE-1 ORF1p لكل بويضة عند E18.5 من E15.5. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر ؛ 10 ميكرومتر (أجزاء اللوحة A ) ؛ 30 ميكرومتر (أجزاء اللوحة B). يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism وتحليلها بواسطة اختبار t للطالب ، وتم تحديد الأهمية بواسطة اختبار Mann-Whitney U . P ≤ 0.0001 ؛ ns >0.05. الاختصارات: GCNA = الببتيداز الحمضي النووي للخلية الجرثومية. LINE-1 = العنصر النووي الطويل المتخلل-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: طريقة لتقدير إجمالي أعداد البويضات في عينات المبيض التالفة مع التصحيح الحسابي. (أ) نموذج من البويضات الإيجابية (الخضراء) E15.5 إيجابية GCNA مع خمس مناطق 10٪ مميزة باللون الأحمر والأزرق والرمادي والأرجواني والبني في مبيض سليم. تمثل كل صورة لاحقة ، بعد المبيض السليم ، مبيض محاكاة مع مناطق متزايدة بنسبة 10٪ مفقودة تصل إلى 50٪. (ب) مخطط الطريقة الحسابية لتقدير عدد البويضات في العينة التالفة. (ج) تمت مقارنة إجمالي أعداد البويضات في المبيضين المحاكيين بالأرقام الموجودة في المبيضين الأصليين السليمين (تعتبر 100٪) ويتم تقديم الفرق على أنه انحراف ٪. محاكاة من ستة مبايض فردية مع حجم مفقود بنسبة 10-50٪. أشرطة المقياس = 80 ميكرومتر. اختصار: GCNA = الببتيداز الحمضي النووي للخلايا الجرثومية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: تقديم 3D ونمذجة ثلاثية الأبعاد للبويضات في مبايض P5. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الحلول والمخازن المؤقتة كاشف (كاشفات) تكوين
مثبت بارافورمالدهيد 4٪ (v / v)
المخزن المؤقت للنفاذية كحول البولي فينيل (PVA) 0.2٪ (ث / v)
بوروهيدريد الصوديوم 0.1٪ (ث / v)
تريتون X-100 1.5٪ (v / v)
حظر المخزن المؤقت ألبومين مصل البقر (BSA) 3٪ (ث / v)
1 م جليسين (درجة الحموضة 7.4) 2٪ (ث / v)
تريتون X-100 0.1٪ (v / v)
200x البنسلين الستربتومايسين 1٪ (v / v)
10٪ أزيد الصوديوم 0.2٪ (v / v)
مصل الماعز 10٪ (v / v)
الغسيل العازل بي في إيه 0.2٪ (ث / v)
تريتون X-100 0.15٪ (v / v)
10٪ أزيد الصوديوم 0.1٪ (v / v)
محلول ScaleS4 (0) (الرقم الهيدروجيني 8.1) د-سوربيتول 40٪ (ث/ت)
يوريا 24٪ (ث/ت)
الجلسرين 10٪ (v / v)
DMSO 20٪ (v / v)
حل ScaleCUBIC-1 يوريا 25٪ (ث/ت)
N,N,N′,N′-TETRAKIS(2-هيدروكسي بروبيل) إيثيلين ديامين 25٪ (v / v)
تريتون X-100 15٪ (v / v)
محلول السكروز سكروز 20٪ (ث / v)
حل ScaleCUBIC-2 سكروز 50٪ (ث/ت)
يوريا 25٪ (ث/ت)
ثلاثي إيثانولامين 10٪ (ث/ت)
تريتون X-100 0.1٪ (v / v)

الجدول 1: الحلول والمخازن المؤقتة.

الشكل التكميلي S1: تفضيلات الحصول على الصور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: إعدادات الحصول على الصور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم هذه المقالة بروتوكول تصوير وتصوير مناعي 3D مفصل للمبايض قبل الولادة وبعدها للحصول على إنتاجية عالية ودراسات مقارنة لتحديد كمية الخلايا الجرثومية وتوطين البروتين. قمنا بتطوير هذا البروتوكول لتحليل أعداد البويضات في المبيضين (N = 6-12) في ست نقاط زمنية للتطور في 10-16 سلالة مختلفة ، حيث تتم معالجة لوحات 2-4 24-well عادة في وقت واحد. يمكن تكييف هذه الطريقة مع الأعضاء الأخرى أو العلامات الخلوية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتسمية وتصور الخلايا الجسدية ، مثل الخلايا الحبيبية في المبيض ، باستخدام الأجسام المضادة المناسبة ، وبالتالي تسهيل دراسات تفاعلات الخلايا الجرثومية الجسدية أو تطوير أنواع أخرى من خلايا المبيض.

أحد قيود هذا البروتوكول ومزيج الأجسام المضادة هو التحديد النهائي للمراحل الجريبية المختلفة. بقع الحمض النووي المستخدمة في التألق المناعي والتصوير 2D لتحديد المراحل الجريبية بواسطة طبقات من نوى الخلايا الحبيبية غير كافية لنهج 3D. نادرا ما تستخدم 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) أو Hoechst لتلطيخ الأعضاء بأكملها بسبب اختراق الضوء المحدود وإشارة الاضمحلال في وسط الأنسجة الكبيرة. يوديد البروبيديوم (PI) هو جزيء صغير قادر على اختراق عمق الأنسجة ولكن يصعب التقاطه على نظام التصوير متعدد الفوتونات بسبب التداخل الطيفي. يمكن تحقيق حل أفضل للمراحل الجريبية من خلال علامات إضافية خاصة بالخلايا الحبيبية مثل الهرمون المضاد لمولريان (AMH) أو FOXL247,48. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه العلامات مفيدة في التمييز بين البصيلات الأكبر نموا ، إلا أنها لن تميز البصيلات البدائية عن البصيلات الأولية. حتى تتوفر علامات محددة لهذه المراحل المبكرة ، توفر علامات البويضات مثل DDX4 أو GCNA أفضل مؤشر على تطور الجريب. علاوة على ذلك ، يعمل هذا البروتوكول مع الغدد التناسلية الذكرية قبل الولادة ولكن لم يتم اختباره بعد في الخصية بعد الولادة حيث قد يكون حجمها هو العامل المقيد. يتم سرد القضايا الحرجة أدناه لتحسين تصور وقياس الخلايا الجرثومية في المبيضين من مختلف الأحجام ويتم تسليط الضوء على التقنيات والخطوات المتخذة لضمان تلطيخ المناعة ذات النوعية الجيدة للتحليل النهائي.

الخطوة الأولى الحاسمة هي منع تلف المبيضين قبل وبعد التثبيت. قد تفتقر المبايض التالفة إلى أجزاء من بنية العضو، مما يؤثر على أعداد البويضات ويحرف النتائج التجريبية. لمنع التلف ، يتم ترك أنسجة جسدية إضافية متصلة بالمبيض الأكبر بعد التشريح للاستيلاء عليها باستخدام ملقط لنقل المبيضين. علاوة على ذلك ، بالنسبة للمبايض الأصغر حجما ، فإن نقلها بطرف ماصة مقطوع على نطاق واسع بما يكفي لتناسب المبيضين بسهولة داخل الطرف يتجنب الضرر. إذا أدى تلف الأنسجة الطفيف إلى فقدان جزء من المبيض ، فيمكن تخفيفه بطريقة حسابية حيث يمكن استقراء إجمالي أعداد البويضات في العينة التالفة باستخدام عينات سليمة من نفس النوع (الشكل 6).

ومع ذلك ، كشفت المحاكاة الحسابية أن دقة التنبؤ تتضاءل مع زيادة حجم المنطقة المتضررة (100.8٪ ± 0.2 ، 97.2٪ ± 1.5 ، و 90.3٪ ± 1 ل 10 و 20 و 30٪ من الضرر ، على التوالي الشكل 6C). استنادا إلى عمليات المحاكاة، نوصي باستبعاد العينات ذات الخسارة بنسبة >30٪ من التحليل. تم استخدام مبايض متعددة سليمة من نفس نوع العينة لحساب متوسط عدد البويضات في المنطقة على غرار تلك المفقودة في العينة التالفة. ثم تم استخدام هذا الرقم للتنبؤ بالعدد الإجمالي للبويضات في المبيض مع الضرر. يمكن استخدام مساحة حجم مماثلة في نفس المبيض المتاخم للمنطقة المفقودة كبديل ولكن لم يتم اختباره.

مشكلة أخرى هي تجنب تلويث الخلايا التي قد تسبب التألق الذاتي. بالنسبة لمبيض البلوغ ، يجب إجراء التروية ، كما هو موضح أعلاه ، مع كل من 1x PBS و 1٪ PFA للقضاء على خلايا الدم التي ستسبب التألق الذاتي (الشكل 2C). يجب أن يستمر التروية مع PBS حتى يتم تطهير الأعضاء ، وخاصة المبيضين والكلى ، من الدم وتصبح بيضاء قبل التحول إلى 1٪ PFA (الشكل 1E ، F). سيؤدي التروية غير الفعالة مع PBS إلى خلفية عالية قد تخفي وتجعل تصور البويضات الصغيرة أمرا صعبا. يؤدي التروية ذات النسب المئوية الأقل (1٪) أو الأعلى (4٪) من PFA إلى جودة صورة أفضل من التروية باستخدام PBS وحدها ؛ وبالتالي ، تم استخدام النسبة المئوية الأقل من PFA.

يتطلب تحسين تلطيخ الأجسام المضادة الانتباه إلى العديد من المتغيرات. بالنسبة لخطوة النفاذية ، تم العثور على 4 ساعات مثالية لهذا الفحص ، مع فترات أطول من 4 ساعات (6-8 ساعات تم اختبارها) مما أدى إلى عدم تلطيخ على الإطلاق. نظرا لأن كمية وتكلفة الأجسام المضادة المستخدمة في تجارب تلطيخ المناعة على نطاق واسع يمكن أن تكون عالية ، فقد تم اختبار هذا البروتوكول وتحسينه لإعادة استخدام خلطات الأجسام المضادة دون أي فقدان لجودة التلطيخ المناعي. لإعادة الاستخدام ، يجب استكمال خليط الأجسام المضادة بأجسام مضادة طازجة كما هو موضح في البروتوكول. تعتبر خطوات الغسيل حاسمة أيضا لجودة التلطيخ المناعي ويجب إجراؤها لفترة أطول لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل أثناء التصوير ويجب تحديدها لكل جسم مضاد من اختياره. للحصول على أفضل النتائج، نوصي بإعداد حل المقاصة ScaleS4 (0) طازجا لكل استخدام، في حين يمكن تخزين ScaleCUBIC-1 و ScaleCUBIC-2 في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1-2 أشهر تقريبا.

يتم إجراء المقاصة ScaleCUBIC-1 عند 37 درجة مئوية. الأهم من ذلك ، يجب تجنب درجات الحرارة المرتفعة لأنها ستؤدي إلى هطول الأمطار الكاشف ، مما قد يؤثر على جودة التلطيخ المناعي. يمكن أن يستغرق تركيب عينات متعددة للتصوير وقتا طويلا. Agar أو طرق التضمين الأخرى المستخدمة في بروتوكولات أخرى كثيفة العمالة وقد تحتاج إلى إعادة مسح إضافية للعينات47,49,50. يمكن استخدام حشيات السيليكون القابلة لإعادة الاستخدام كآبار لاصقة سهلة الاستخدام مع أغطية ويتم تقديمها بأحجام وأعماق مختلفة لاستيعاب أحجام العينات الأخرى. للحصول على صور عالية الجودة ، يجب استخدام حجم كاف من حل المقاصة ؛ سيؤدي القليل جدا إلى جودة صورة رديئة ، ويمكن أن يتسرب الكثير من الحلول إلى المجهر. يجب تحسين هذه الخطوة لعينات محددة اعتمادا على أحجامها. يمكن استخدام الأطباق ذات القاع الزجاجي ولكن يجب تجميد العينات للتصوير لأنه حتى أدنى الحركات ستشوه الصورة. يمكن استخدام حشيات السيليكون مع طبق من أسفل الزجاج وغطاء علوي لشل حركة العينات للتصوير. ومع ذلك ، فإن هذا سيحد من القدرة على قلب العينة إذا كانت هناك حاجة إلى التصوير من كلا الجانبين بسبب حجم المبيض.

كان هناك خيار حاسم آخر لهذا النهج واسع النطاق وعالي الإنتاجية وهو التصوير على منصة Leica DIVE / 4TUNE / FALCON باستخدام اثنين من ليزر Spectra-Physics متعدد الفوتونات (MP) قابلين للضبط. تشمل فوائد استخدام منصة DIVE سهولة تركيب العينات (الموضحة أعلاه) ، وتقليل التشوه البصري (مقارنة بالمنصات البؤرية) ، والأهم من ذلك ، سرعة التصوير وإدارة بيانات الصور المكتسبة. عينات التصوير باستخدام ليزر الفوتون المتعدد عند تكبير أعلى (16x) أسرع بكثير وتسبب تلفا ضوئيا أقل من الليزر البؤري على Leica DIVE أو SP8 باستخدام إعدادات مماثلة للحصول على الصور باستخدام برنامج LAS X. شعاع MP منخفض ، وإثارة الفلوروفور الخاصة به موضعية للغاية إلى النقطة البؤرية ويحقق المزيد من العمق عند التكبير المنخفض دون التسبب في ضرر ضوئي على الرغم من وجود عدد أكبر من خطوات التصوير المكاني / المحوري (confocal: ~ 300-400 قسم كحد أقصى ، MP: >800 قسم).

يسمح هدف 16x/NA0.6 بتصحيح عدم تطابق معامل الانكسار الطفيف بسبب توزيع العينة والحامل على طول المحور البصري عبر طوق تصحيح ميكانيكي ، والذي يتم ضبطه على النحو الأمثل للإشارة القصوى ، في منتصف الطريق إلى العينة. وعلاوة على ذلك، يمكن تشويه الهياكل الكروية، مثل البويضات، عن طريق الحصول على صورة متحدة البؤرة حيث يمكن أن يحدث توطين يعتمد على العمق للمستوى البؤري (الإشارة) بسبب عدم تطابق معامل الانكسار المتصاعد والعينة في إعداد ثقب معين (الشكل 2D). نظرا لأن إشارة التألق يتم التقاطها عبر الثقب الداخلي للجهاز لإزالة إشارة خارج التركيز البؤري ، فقد يزداد التشوه البصري الجوهري (الانحراف الكروي) سوءا في العينة ، وهو ما يمثل مشكلة بالنسبة للمبايض الأكبر حجما (أي سمك 400-600 ميكرومتر تقريبا).

وبنفس إعدادات تصحيح العدسة المطابقة، لا يمكن عمليا الكشف عن أي انحراف كروي على نظام DIVE MP بأطوال موجية متفاوتة للانبعاثات، مما يبسط دراسات القياس الكمي والتوطين المشترك (الشكل 2D). وأخيرا، يسمح الليزر النبضي عالي الطاقة بتركيز فلوروفور أقل مثير في عمق العينة، ولا سيما عند استخدامه مع تصحيح الإثارة على عمق Z. علاوة على ذلك ، يتم تعزيز التقاط الإشارات الأضعف أيضا بواسطة كاشف MP الهجين (HyD-RLDs) ، وهو مزيج من أنابيب المضاعف الضوئي العادية وأجهزة الكشف عن عد الفوتونات الثلجية ، مما يسمح باكتشاف إشارة أعلى بأكثر من 30 مرة عبر مجموعة واسعة من الأطوال الموجية للانبعاثات.

ورقة الضوء (LS) المجهر متعدد الفوتون هو منصة أخرى ناشئة لتصوير الأنسجة 3D47. ومع ذلك ، يتطلب LS مزيدا من وقت الإعداد للعينات العيانية ، بما في ذلك تضمين agar وإعداده للتصوير. علاوة على ذلك، يمكن للصور التي يتم الحصول عليها عند التكبير العالي مع دوران العينة توليد ملفات كبيرة >100 جيجابايت، والتي قد تكون ضرورية لإزالة القطع الأثرية التي تظلل ورقة الضوء (بسبب عدم تطابق معامل الانكسار بين الوسط الخارجي والداخلي للعينة، أو تشوهات سطح العينة). الطريقة المقدمة لتركيب العينات في محلول في آبار لاصقة بسيطة وسريعة.

علاوة على ذلك ، يسمح هذا النهج بتصوير مبايض متعددة في بئر واحد مع إعداد واحد وبدون تقليب أو دوران. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى قلب "ساندويتش" الغطاء للمبايض الكبيرة. تصوير نظام DIVE أسرع من البؤري و LS. عند تكبير 16x ، يتم تصوير المبيض قبل البلوغ في 3-5 دقائق (Z-step 2 μm) ومبيض البلوغ في 1 ساعة (Z-step 5 μm). علاوة على ذلك ، فإن الملفات التي تم إنشاؤها في LAS X ذات حجم يمكن التحكم فيه (2-20 جيجابايت) ، وهو أمر بالغ الأهمية أيضا لعدد كبير من العينات للتحليل النهائي. على الرغم من أن بروتوكول التلطيخ المناعي هذا قد تم تحسينه للاستخدام مع منصة DIVE ، إلا أنه يمكن تصوير العينات الملطخة بالمناعة باستخدام منصات MP/LS الأخرى مع بعض التعديلات.

ميزة تلطيخ المبيض بأكمله مع بروتوكول النمذجة 3D هو تحليل البيانات الفعال والسهل نسبيا مقارنة بالحصول على البيانات اليدوية في تحليل 2D. تم اختيار برنامج IMARIS 3D للتصور والتحليل لأنه متاح تجاريا ومقدم من قبل العديد من النوى المجهرية ، ولا يتطلب مهارات برمجة ، ومتوافق مع العديد من منصات برامج الحصول على الصور مثل LAS X من Leica أو ZEN من ZEISS. باستخدام IMARIS ، يتم إعداد المعلمات القياسية كما هو موضح في قسم البروتوكول ، ويمكن استخدام هذه المعلمات للصور والعينات الأخرى ذات التغييرات الطفيفة ، وبالتالي تحسين قابلية التكرار والكفاءة.

يتم تحسين تحليل الصور والقياس الكمي لبرنامج IMARIS. ومع ذلك ، يمكن إجراء تحليلات مماثلة على برامج أخرى لتصور البيانات التجارية أو مفتوحة المصدر وفقا لمبادئ مماثلة. في الختام ، تم تقديم بروتوكول محسن هنا لتصوير المبايض بأكملها للتحليلات الكمية والنوعية. وقد تم تكييف ذلك بشكل هادف لتلبية متطلبات المعالجة عالية الإنتاجية التي ستكون مطلوبة بشكل متزايد لاختبار السموم، والأغراض السريرية والتشخيصية، والتحليلات على نطاق الجينوم لمنظمي كفاية المبيض ووظيفته.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 HD093778 إلى E.B-F و T32 HD007065 إلى R.B). نشكر زاكاري باوتشر على مساعدته في التجربة الإشعاعية. نشكر ماري آن هاندل على قراءتها النقدية للمخطوطة. نحن نقدر بامتنان مساهمة سونيا إيراتوبوزا وخدمة الفحص المجهري الأساسية في مختبر جاكسون لمساعدة الخبراء في عمل الفحص المجهري الموصوف في هذا المنشور وجاريك ترابزو من خدمات الأدوات العلمية في مختبر جاكسون لتصميم شريحة المحول المطبوعة 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 175 ،
التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter