Summary
여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.
Abstract
여성의 생식력과 생식 수명은 난소 난모세포 예비의 질과 양에 달려 있습니다. meiotic prophase I에 들어가는 여성 생식 세포의 약 80 %는 태아 난모세포 감소 (FOA)와 산후 생후 첫 주 동안 제거됩니다. 세 가지 주요 메커니즘은 발달 중에 생존하는 난모세포의 수를 조절하고 사춘기에 들어가는 여성의 난소 예비를 확립합니다. 난모세포 손실의 첫 번째 파동에서, 난모세포의 30-50 %가 초기 FOA 동안 제거되며, 이는 높은 Long interspersed 핵 요소 -1 (LINE-1) 발현에 기인하는 현상입니다. 난모세포 손실의 두 번째 물결은 meiotic 품질 체크 포인트에 의해 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 것입니다. 난모세포 손실의 세 번째 파동은 일부 난모세포가 모낭을 형성하지 못할 때 원시적 인 난포 형성 중에 주산기적으로 발생합니다. 난모세포 손실의이 세 가지 파동 각각을 조절하는 것이 무엇인지, 그리고 그들이 쥐 나 인간에서 난소 예비를 어떻게 형성하는지는 분명하지 않습니다.
면역 형광 및 3D 시각화는 덜 유익한 2D 섹션보다는 전체 난소의 맥락에서 난모세포 발달을 이미지화하고 분석 할 수있는 새로운 길을 열었습니다. 이 기사에서는 전체 난소 면역 염색 및 광학 클리어링을위한 포괄적 인 프로토콜을 제공하여 다중 광자 현미경을 사용한 이미징 및 상용 소프트웨어를 사용한 3D 모델링 제제를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 C57BL / 6J 마우스에서 난소 발달 중 난모세포 감소의 역학을 보여주고 난모세포 제거의 세 가지 파동 동안 난모세포 손실을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 난모세포 시각화 및 정량화뿐만 아니라 다른 정량적 접근법을 위해 산전 및 산후 산후 난소에 적용될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석의 요구를 충족시킬 수 있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용하기 위해 전략적으로 개발되었습니다.
Introduction
대부분의 포유류 암컷은 원시적 난포 내에 저장된 유한한 수의 meiotically arrested 난모세포로 태어나 난소 예비군 (OR)1,2를 구성합니다. OR은 전체 여성의 생식 수명과 건강을 결정합니다3. OR은 일반적으로 노화와 함께 크기가 감소하고 특정 유전 독성제 (방사선 / 화학 요법) 및 환경 스트레스 (영양 실조)에 노출되면 조기에 고갈 될 수 있으며 불임 4,5,6으로 이어질 수 있습니다. 특발성 여성 불임은 종종 OR에서 발생하는 난자의 유전 적 및 생리적 품질에 기인 할 수 있으며 잘 이해되지 않는 상태로 남아 있습니다 7,8. 여성 여포 기부는 출생에 의해 크게 미리 결정되기 때문에 OR 설립 및 유지 보수와 관련된 규제 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다.
마우스에서, OR 형성은 배아일(E) 7.52 주위의 원발생식세포(PGCs)의 사양으로 시작한다. PGC는 생식기 능선으로 이동하여 약 E10.59에 거주합니다. 다음과 같은 광범위한 증식은 불완전한 사이토 카인 (cytokinesis)으로 발생하여 나중에 발달10,11에서 분해 될 낭종의 형성을 초래합니다. 대략 E12.5에서, 생식선 성관계가 결정되고, PGC 증식은 난소에서 정지된다. 암컷에서, 현재 난모세포인 PGCs는 대략 E13.512,13에서 meiotic prophase I (MPI)에 들어간다. 난모세포는 연장 된 MPI를 통해 진행되며 출생 시점 주변의 지시 단계에서 체포됩니다. 출생 후 첫 주 동안, 체포 된 각 난모세포는 과립 세포에 둘러싸여있어 원시적 인 여포를 형성합니다.
여성의 OR에서 원시적 인 여포의 수는 아폽토시스, 자가포식 또는 괴사를 통해 MPI 체포 전과 중에 발생하는 난모세포 제거의 파동에서 얼마나 많은 난모세포가 살아남 았는지에 달려 있습니다14,15. 첫 번째 파동은 태아 발달 중에 발생하며 FOA로 알려져 있습니다. FOA는 암컷 (포유류 및 비 포유류)에서 진화적으로 보존 된 과정으로, 여성 종 16,17,18,19에 따라 난모세포의 약 50-80 %가 제거됩니다. 마우스에서, FOA는 E15.5 내지 E18.5 동안 발생하며, 난모세포 사멸을 야기하는 레트로트랜스포존 LINE-1 서열의 재활성화 및 발현에 기인한다20,21. 난모세포 제거의 두 번째 파동은 복구되지 않은 DNA 이중 가닥 파단 (DSBs)22,23과 같은 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 meiotic 체크 포인트를 통해 발생합니다. 난모세포 제거의 다음 파동은 낭종 붕괴 중에 발생하며, 원시적 인 난포가 형성되는 동안 절정에 달하며, 각각은 단일 난모세포10,11,24,25를 포함합니다.
생쥐에서, 원시적 인 여포 예비는 사춘기에 의해 크게 확립되며, 그 후에 원시적 인 여포가 규칙적인 생식주기 동안 성장을 위해 활성화됨에 따라 감소합니다. OR 크기는 개별 여성 및 마우스의 다른 유전 적 균주에 따라 다릅니다. 그러나, OR 크기의 유전적 조절은 잘 이해되지 않는다26,27,28,29. OR 조절에 대한 유전 연구는 산전 및 산후 발달 동안 난모세포 제거의 파동을 연구하기위한 표준화 된 프로토콜의 부족으로 인해 방해받습니다. 몇몇 난모세포 정량화 방법론이 마우스에서 개발되었으며, 가장 보편적이고 널리 사용되는 것은 조직학적 절편30,31의 조직형태학적 평가이다. 이 기술에서, 난모세포는 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 및 주기적 산 쉬프 (PAS) 또는 형광 마커와 같은 조직 학적 얼룩이있는 연속 절편에서 확인됩니다. 이 기술은 단면 두께, 난소 전체의 모든 섹션의 효율적인 회복 및 개별 실험실의 계수 체계를 포함하여 모든 조건이 일정하게 유지되면 신뢰할 수 있습니다. 그러나 다른 실험실에서보고 된 숫자는 종종 크게 다르므로 쉽게 비교할 수 없습니다.
또한, 유전 적 차이를 감안할 때, 다른 마우스 균주의 사용은 또한 난모세포 수에 영향을 줄 수 있습니다. 조직 형태 평가를 위해 추가 전산 접근법이 개발되었으며 분별기 접근법을 사용한 난모세포의 자동 검출, 계산 알고리즘을 사용한 자동 계산 및 동일한 난모세포의 다중 카운트를 방지하기 위한 조직학적 이미지의 3D 재구성 31,32,33,34,35,36 . 이러한 개선이 조직 형태 측정법 평가에 추가되더라도이 기술은 특히 대규모 및 고처리량 연구의 경우 상대적으로 노동 집약적입니다. 수집 된 데이터는 계산 체계, 컴퓨터 알고리즘 및 사용 된 소프트웨어의 차이로 인해 연구 간에 재현 가능하고 비교할 수 없을 수 있습니다.
최근에, 새로운 중간 분해능 다중 광자 및 광 시트 현미경 및 광학 조직 제거 방법의 개발에 의해 가속화되고, 온전한 난소에 대한 3D 모델링 및 분석 기술은 난모세포 수를 효율적으로 정량화하고 단백질 국소화 및 역학을 연구하기 위한 선택의 방법이 되고 있다(37,38). 이러한 3D 방법은 일반적으로 조직 및 장기가 더 잘 보존되고 온전하게 유지되기 때문에 조직학적 방법에 비해 유리합니다. 또한 3D 분석 및 모델링은 2D 분석에서 놓칠 수있는 기관 내의 세포 틈새 또는 하위 구조 내와 세포 간의 기능 및 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공합니다.
전체 장기의 3D 분석에는 조직 왜곡이나 손상 없이 난소와 같은 개별 장기에 대한 고정, 면역 염색 및 광학 클리어링 프로토콜의 최적화가 필요합니다. 이미징을 위한 샘플 마운팅의 추가적인 최적화는 고해상도 현미경 검사에 필요하며 사용 가능한 이미징 플랫폼에 따라 달라질 수 있습니다. 마지막으로, 전체 손상되지 않은 난소의 이미징은 후속 계산 분석을 위해 많은 양의 데이터를 생성합니다. 따라서 비교 연구 및 발달 단계에 걸쳐 난모세포를 계수하기위한 표준화 된 3D 방법을 개발할 필요가 있습니다.
이 프로토콜은 표준 면역 염색 및 이전에 보고된 클리어링 프로토콜을 사용하며, 단순하고 사용자 친화적이며 높은 처리량 접근법 38,39,40,41에 초점을 맞춥니다. 이 프로토콜은 산후 28 일 (P28)까지의 많은 수의 산전 및 산후 난소와 다양한 마우스 유전 적 배경의 다양한 크기의 난소를 분석하도록 최적화되어 있습니다. 면역염색 단계는 모든 단계에 대해 유사하고; 그러나 사춘기 난소의 경우 클리어링 프로토콜이 더 큰 크기 인 ScaleS4 (0) 및 소형 난소의 경우 CUVIC이 각각40,41 개로 인해 다릅니다. 또한, 전신 관류는 혈액 세포로부터의 자기 형광을 방지하기 위해 고정 전에 P28 마우스에서 수행된다. 다중 광자 현미경은 이미지를 얻기 위해 라이트 시트 현미경의 대안으로 라이카 DIVE/4Tune 플랫폼에 구축되었으며, 다양한 분석 도구를 갖춘 IMARIS 3D 시각화 및 분석 소프트웨어가 이 프로토콜을 위해 선택되었습니다. 이 프로토콜은 따르기 쉽고 실습이 적기 때문에 시간을 절약 할 수 있습니다. 또한, 난모세포 정량화는 난소의 크기와 난모세포의 배열에 따라 상대적으로 빠릅니다.
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Protocol
사용된 모든 마우스는 C57BL/6J 유전자 균주 중 하나였다( 표 참조). 이 균주는 완전히 서열화되었으며 난소 구조와 기능에 대한 많은 연구의 표준입니다. 마우스는 NIH 지침에 따라 수용되었으며, 수행 된 절차는 잭슨 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 시약 및 조성물은 각각 표 및 표 1에 열거되어 있다.
1. 시약의 제조
- 고정제: 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비한다. 예를 들어, 24개의 샘플(0.5 mL/샘플 = 12 mL 총 부피)의 경우, 1x PBS 9 mL에 16% PFA 전자 현미경 등급 3 mL를 첨가한다.
- 투과화 완충액
- 폴리비닐알코올(PVA)을 투과 완충액이 필요하기 전날 1x PBS를 함유하는 250 mL 플라스틱 비이커에 넣고 측정한다. PVA가 완전히 용해되도록 용액을 밤새 저어줍니다.
- 용해된 PVA에 소듐 보로하이드라이드를 첨가하고, 혼합물이 대략 3-5분 동안 균질화되도록 한다. 용액이 거품이 될 것으로 기대하십시오.
- 트리톤 X-100을 용액에 첨가하고 트리톤 X-100이 용해되면 버퍼를 사용하십시오.
참고 : PVA는 용해하는 데 오랜 시간이 걸리며 (적어도 3 시간), 항체의 침투는 항체가 얼마나 잘 용해되는지에 달려 있습니다. 더 큰 난소의 경우 PVA를 완전히 용해시키는 것이 중요합니다.
- 차단 버퍼
- 소 혈청 알부민(BSA)을 1x PBS로 비이커에 넣고 측정한다. BSA가 용해 될 때까지 용액을 저어줍니다.
- 글리신, 트리톤 X-100, 페니실린 스트렙토마이신 및 나트륨 아지드를 첨가하십시오. 용액이 균질화 될 때까지 저어줍니다. 완충제를 병으로 옮기고 4°C에서 보관한다. 사용하기 전에 일반 염소 혈청을 첨가하십시오.
- 세척 완충액: 1x PBS를 함유하는 비이커에 PVA를 측정한다. PVA가 용해되도록 용액을 밤새 저어준다. 트리톤 X-100과 나트륨 아지드를 추가하십시오. 완충제가 혼합되면, 이를 4°C에서 보관한다.
- ScaleS4(0) 용액(pH 8.1): ≤100°C에서 교반하면서 비이커에 D-소르비톨을 용해시킨다. 용액에 우레아를 넣고 우레아가 용해되면 열을 끄고 용액이 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다. 글리세롤과 디메틸 설폭사이드를 첨가하고, 용액이 균질해질 때까지 저어준다. 용액을 어둠 속에서 실온에서 보관하십시오.
참고 : ScaleS4 (0) 용액은 난소를 맑게 한 첫날에 신선하게 만들어야합니다. - 스케일큐빅-1 용액
- PBS를 함유하는 비이커에 우레아를 용해시키고 온도 ≤100°C에서 교반한다. N,N,N ',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필)에틸렌디아민을 별도의 비이커에 넣은 다음 용해된 우레아를 첨가하고, 시약이 완전히 용해될 때까지 ≤100°C의 온도에서 교반한다. 모든 시약이 용액에 들어가면 열을 끄고 실온에서 식히십시오. 어둠 속에 보관하십시오.
- 용액을 여과 플라스크로 옮겨 탈기하십시오. 플라스크를 튜브로 진공에 부착하고 플라스크를 덮은 다음 용액의 거품이 사라질 때까지 진공을 켭니다. 이 탈기 후에 용액을 사용하십시오.
참고 : 솔루션은 어둠 속에 보관하여 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.
- 수크로오스 용액: 수크로스를 1x PBS에 용해시키고; 그런 다음 사용하기 전에 용액을 탈기하십시오.
참고: 사용하기 전에 용액을 새로 준비하십시오. - 스케일큐빅-2 용액
- 수크로스를 PBS를 함유하는 비이커에 용해시키고 온도 ≤100°C에서 교반한다. 우레아를 첨가하고 우레아가 용해될 때까지 ≤100°C의 온도에서 저어준다. 열을 끕니다.
- 트리에탄올아민과 트리톤 X-100을 첨가한다. 용액이 균질화 될 때까지 저어줍니다. 용액을 실온으로 식히고 어둠 속에 보관하십시오. 사용하기 전에 용액을 탈기하십시오.
참고 : 솔루션은 어둠 속에 보관하여 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.
2. 산전 난소의 해부와 고정(그림 1A)
- 승인 된 제도적 프로토콜에 따라 성인 여성 (≥8 주)과 남성을 짝짓기하십시오. 매일 아침 질 플러그가 있는지 확인하십시오.
참고 : 질 플러그의 아침은 0.5 일 후 coitum (d.p.c) 또는 E0.5로 지정됩니다. - 해부 당일, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 분취량 ~ 0.5 mL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 벤치 측면 (임신 한 여성 당 ~ 4 명)에 놓습니다.
참고: PFA는 유해 물질이므로 화학 후드 아래에서 처리해야 합니다. - 각 임산부를 위해 ~10mL의 1x 인산완충식염수(PBS)를 함유하는 세 개의 100mm 플레이트를 준비한다(자궁 채취용, 메소네프로스-난소 복합체 해부용, 난소 분리용).
- 선호하는 발달 단계의 배아를 운반하는 임신 한 여성을 안락사시키고 해부를 진행하십시오. 한 번에 1-2 명 이하의 여성을 안락사시킵니다. 임신한 마우스의 안락사를 위해 승인된 프로토콜을 사용하십시오 (예를 들어,CO2 노출에 이어 자궁경부 탈구).
- 여성이 안락사되면 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 포셉을 사용하여 복부 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 복부와 체벽을 통해 V 자형 절개를 만듭니다. 절개의 양면을 따라 자르고 피부를 다시 벗겨 자궁의 내부 장기와 태아를 노출시킵니다.
- 포셉과 가위로 복부 지방과 난소 동맥 및 정맥에서 태아와 자궁을 자르고 분리하십시오. 자궁을 제거하고 1x PBS를 함유하는 100 mm 플레이트에 놓는다. 자궁벽을 자르고 노른자 주머니에 구멍을 뚫어 태아를 PBS로 방출하십시오. 탯줄을 자르십시오.
참고 : 임신 15 일 미만의 태아의 경우, 어머니의 안락사와 자궁에서 제거하면 태아가 빠르게 사망 할 수 있습니다. 임신 후 출생 15 일 이상 된 태아는 감금으로 안락사해야합니다. - 태아를 신선한 1x PBS로 새 접시에 옮깁니다. E15.5 태아를 무력화시키려면 포셉으로 접시에 두 뒷다리를 섬세하게 고정시켜 태아를 고정시킵니다. 지배적 인 손에 잡힌 두 번째 포셉 쌍을 사용하여 포셉 갈퀴 사이에 목을 잡고 쥐어 짜서 태아의 머리를 자르거나 가위를 사용하여 목을 자릅니다.
- 지배적 인 손 집게로 앞다리 아래를 자르고 상체를 부드럽게 당깁니다. 다음으로, 지배적 인 손 포셉의 한 끝점을 복강에 수직으로 삽입하여 복부 영역의 개구부에 넣고 포셉의 다른 끝점은 외부에 남아 있습니다. 포셉을 닫고 몸 벽을 꼬집어 자르고 내부 장기를 노출시킵니다.
- 동일한 포셉으로 신장과 생식 기관이 보일 때까지 창자와 간을 포함한 장기를 부드럽게 제거하십시오. 태아의 성별을 결정하십시오 : E15.5에서 난소는 길쭉한 소시지와 같은 모양을 가지고 있으며 고환은 타원형입니다.
참고 : 초기 단계에서 성별을 결정하기 위해 유전 형이 필요할 수 있습니다. - 한 쌍의 포셉을 사용하여 여성 태아를 아래로 잡고 다른 포셉을 사용하여 각 메소네프로스 - 난소 복합체를 잡고 신장과 뮐레리아 덕트에서 부드럽게 분리하십시오. 난소를 1x PBS로 새 플레이트에 놓고 메소네프로스가 부착된 상태로 두되 난소가 노출되도록 주변 조직을 제거합니다. 두 난소 모두 마이크로원심분리 튜브에 ∼0.5 mL의 4% PFA에 넣고 하룻밤 사이에 4°C에서 고정시킨다. 다음날 PFA를 70 % 에탄올로 교체하십시오.
- E18.5 난소의 해부 및 고정을 위해, 위에서 설명한 바와 같이 자궁으로부터 태아를 분리한 다음, 섹션 3에 설명된 사춘기 새끼를 위한 프로토콜을 따르십시오(도 1B).
3. 사춘기 난소의 해부와 고정(그림 1B)
- 4% PFA와 분취량 ~0.5 mL를 1.5 mL 튜브에 준비하여 벤치 측면(강아지 당 1개 튜브)에 놓습니다. 1x PBS (강아지 당 1 개)로 35mm 플레이트를 준비하십시오. 승인 된 제도적 프로토콜을 사용하여 새끼를 안락사시킵니다.
참고 : 감금은 생후 8 일 이하의 마우스에 대한 안락사의 선호되는 방법입니다. 신생아 마우스는 3-4 "해부 가위 또는 5-7"Mayo 가위를 사용하여 목을 졸라 버릴 수 있습니다. - 암컷보다 남성에서 더 큰 생식기 거리를 측정하여 강아지의 성별을 결정하십시오. 날카로운 감금 가위를 사용하여 여성 강아지를 무력화시킵니다. 몸을 열어 놓은 쪽을 종이 타월에 올려 놓고 혈액을 배출하십시오 (~ 5-10 초).
- 각 발의 발 패드에 핀을 배치하여 강아지를 뒤쪽에 고정시킵니다. 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오. 포셉을 사용하여 강아지의 피부를 몸에서 멀리 떨어 뜨리고 가위를 사용하여 하복부의 피부에 작은 V 자형 절개를 만듭니다.
- 가위를 피부 아래의 절개에 삽입하고 복부의 양쪽을 따라 자릅니다. 포셉을 사용하여 피부를 부드럽게 벗겨 내고 하복부를 드러냅니다. 부드럽게 장을 위로 움직이고 방광 옆에있는 자궁 뿔을 찾으십시오. 신장쪽으로 각 자궁 경적을 따라 가면서 각 신장 아래에 주변 지방 조직이있는 난소를 찾으십시오.
- 난소를 해부하려면 난소와 난관 아래의 자궁 경적을 한 쌍의 포셉 (포셉 A, 그림 1B)으로 잡고 몸에서 부드럽게 들어 올립니다. 다른 한 쌍의 포셉 (포셉 B)을 사용하여 첫 번째 포셉 쌍 아래에서 부드럽게 잡아서 지방 패드의 난소와 난관이 두 번째 포셉 쌍 위에 보이도록하십시오. 그런 다음 가위로 두 번째 포셉 쌍 아래를 자르거나 조심스럽게 당겨 난소와 부착 된 조직을 분리하십시오.
- 단리된 장기를 1x PBS로 플레이트에 놓는다. 여분의 지방 조직, 난관 및 자궁 뿔을 다듬어 난소를 청소하고 분리하십시오. 난소를 둘러싼 부르사를 섬세하게 열고 난소 전체를 노출시킵니다.
- 난소를 손상시키지 않고 부르사 막을 다듬고 힐룸 주위의 조직(난소와 생식관 사이의 인대-유사 구조)을 남기고 난소를 처리하여, 도 1B, P5에 도시된 바와 같다. 난소가 트리밍되면 4 % PFA에 넣고 난소를 4 °C에서 밤새 고정하십시오. 다음날, 4% PFA를 70% 에탄올로 교체하고 면역염색 프로토콜 단계가 될 때까지 난소를 4°C에서 저장한다.
4. 사춘기 난소의 관류, 해부 및 고정 (그림 1C)
- 기관적으로 승인 된 프로토콜에 따라 마우스를 화학 흄 후드에서 깊은 마취하에 마우스와 함께 퍼퓨즈하십시오. 관류 장비 및 시약을 준비하십시오. 42에서 상세한 프로토콜을 참조하십시오.
참고 : 관류는 혈관 시스템 전체의 혈액을 조직 고정제로 대체하는 말단 안락사 절차입니다. - 사춘기 암컷 마우스 (P28)의 무게를 측정하고 마우스의 체중 (일반적으로 13g에서 15g 사이)을 기록하십시오. 사용할 승인된 마취제의 양을 계산하십시오.
참고: 여기서, 체중 10 g 당 0.35 mL의 트리브로모에탄올이 이 프로토콜에 사용되었다. - 20 G 바늘이 있는 10 mL 일회용 주사기를 사용하여 승인된 마취제로 주사기를 채웁니다. 20G 바늘을 26G x 3/8 바늘로 교체합니다.
- 한 손으로 등쪽 목 피부를 닦아 마우스를 조심스럽게 제지하십시오. 복부를 노출시키기 위해 마우스를 뒤집습니다. 이전에 계산 된 마취제를 복강에 주입하십시오. 마취가 적용될 때까지 마우스를 덮개가있는 용기에 넣으십시오 (즉, 마우스가 더 이상 움직이지 않음).
- 마우스가 움직이지 않으면 발을 부드럽게 꼬집어 반응이 없는지 확인하고 관류를 시작하기 전에 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 발 패드를 통해 네 다리를 모두 보드에 부드럽게 고정하여 마우스를 뒤쪽에 놓고 고정시킵니다. 다리가 과도하게 늘어나지 않고 편안한 자세로 고정되어 있는지 확인하십시오.
- 복부에서 가슴 부위까지 70 % 에탄올로 마우스를 뿌리십시오. 포셉을 사용하여 복부 피부를 부드럽게 꼬집고 들어 올린 다음 가위를 사용하여 피부와 체벽을 통해 작은 V 자형 컷을 만듭니다.
- 체강에서 피부 플랩을 들어 올리고 피부와 체벽 아래에 가위를 삽입하십시오. 피부와 체벽을 흉골의 흉강 가장자리까지 머리 쪽으로 똑바로 자릅니다.
- 흉골의 양쪽에있는 갈비뼈를 견갑골 바로 아래로 조심스럽게 절단하여 흉강을 엽니 다. 흉곽 아래의 폐에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 포셉으로 피부 / 갈비뼈 플랩을 잡고 고정하여 내부 장기를 노출시킵니다.
- 흉선과 같은 심장에 대한 명확한 접근을 방해 할 수있는 조직을 부드럽게 다듬으십시오. 위장관을 포함한 모든 장기를 노출시켜 하복부를 포함한 전신이 관류되어 있음을 시각적으로 확인할 수 있습니다.
- 해부 가위를 사용하여 심장의 오른쪽 심방을 자르고 시스템에서 혈액을 방출하십시오. 포셉으로 심장을 부드럽게 잡고 관류 바늘 (연동 펌프 컨트롤러에 연결됨)을 좌심실에 삽입하십시오.
- 간, 신장 및 생식관과 같은 조직 (그림 1E, F)이 분홍색에서 흰색으로 바뀔 때까지 부드럽지만 일정한 압력으로 PBS ~ 10mL를 펌핑하십시오. 다음에, PBS를 갓 만들어진 1% PFA로 교체하고, 대략 10 mL의 PFA로 관류를 계속하거나 마우스의 하체(예를 들어, 꼬리)에서 경련이 발생할 때까지 계속한다.
참고 : 이러한 고정 떨림은 성공적인 관류를 나타냅니다. - 관류가 완료되면 신장 아래의 난소가있는 지방 패드를 찾아 지방 패드, 난소 및 자궁 뿔을 포함한 전체 생식관을 부드럽게 해부하고 4 % PFA가있는 바이알에 관을 놓습니다. 밤새 실온에서 난소를 고정하십시오 (~ 16-24 h). 이어서, 4% PFA를 적어도 1일 동안 70% 에탄올로 교체하고, 면역염색 프로토콜을 시작하기 전에 전술한 바와 같이 난소를 트리밍한다(도 1E, F).
5. 전체 탑재형 난소 면역염색(도 2A)
참고: 면역 염색 프로토콜 동안, 특히 버퍼를 변경할 때 연장된 잠복기 동안 오염을 방지하기 위해 멸균 기술을 연습하십시오.
- 도 2A에 도시된 바와 같이 24-웰 플레이트에서 모든 면역염색 단계를 수행한다. 다른 형식에 대한 시약 볼륨을 조정합니다. 작은 산전 및 사춘기 난소를 잃지 않도록 버퍼를 조심스럽게 변경하십시오.
참고: 48웰 및 96웰 플레이트와 같은 다른 포맷을 사용할 수 있지만, 더 깊은 웰과 좁은 개구부는 난소를 잃거나 손상시키지 않으면서 버퍼를 흡인하는 것을 어렵게 만듭니다. - 1일차
- PBS/웰 1mL를 깨끗한 24웰 플레이트에 필요한 웰 수에 피펫팅합니다. 200μL 피펫 팁의 팁을 잘라 넓은 개구부를 만들고 이를 사용하여 70% 에탄올이 있는 1.5mL 튜브의 전유 난소를 웰로 부드럽게 옮깁니다. 사춘기 난소의 경우, 이송을 위해 팁이 잘린 1000μL 피펫 팁을 사용하십시오.
참고: 팁의 더 넓은 개구부는 전송 중 조직 손상을 방지합니다. - 모든 샘플이 웰로 옮겨지면 새로운 팁을 사용하여 PBS를 흡인하고 신선한 0.8 mL의 PBS / 웰로 교체하십시오. 샘플을 실온에서 ∼100-150 rpm의 진탕기 상에서 밤새 인큐베이션한다. 투과 완충액의 제조를 시작한다(표 1 및 섹션 1 참조).
참고: 새로운 팁은 난소가 팁에 달라붙는 것을 방지하고, PBS 인큐베이션 단계는 난소가 PBS에서 평형을 이루고 염색 전에 재수화되도록 합니다.
- PBS/웰 1mL를 깨끗한 24웰 플레이트에 필요한 웰 수에 피펫팅합니다. 200μL 피펫 팁의 팁을 잘라 넓은 개구부를 만들고 이를 사용하여 70% 에탄올이 있는 1.5mL 튜브의 전유 난소를 웰로 부드럽게 옮깁니다. 사춘기 난소의 경우, 이송을 위해 팁이 잘린 1000μL 피펫 팁을 사용하십시오.
- 2일째
- 투과 완충액의 준비를 마칩니다. 웰로부터 PBS를 흡인하고, 이를 웰 당 0.8 mL의 투과 완충액으로 교체한다. 플레이트를 다시 진탕기 위에 놓고 샘플을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
- 4시간의 인큐베이션 후, 투과 완충액을 완전히 흡인하고 이를 0.5 mL의 블로킹 완충액으로 교체한다(표 1 및 섹션 1 참조). 증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 진탕기 상의 안전하게 덮인 용기에 넣고, 실온에서 밤새도록(16-24 h) 블로킹 버퍼에서 부드럽게 교반하면서 샘플을 인큐베이션한다.
- 3 일째
- 차단 완충액에서 희석하여 일차 항체를 준비한다. 난모세포를 시각화하기 위해, 난모세포 마커, 예를 들어, 쥐 항-생식세포 핵 산성 펩티다제(GCNA)/TRA98을 산전 및 사춘기 난소 둘 다에 사용하고, 토끼 항-DEAD-box 헬리콥터 4(DDX4)/마우스 바사 상동체(MVH)를 사춘기 및 사춘기 난소 둘 다에 사용한다. 산전 난소에서 LINE-1 ORF1p 발현을 정량화하기 위해, 토끼 항-LINE-1 ORF1p 또는 다른 이용가능한 항체를 사용한다.
참고: GCNA/TRA98 신호는 사춘기 난소에서 검출할 수 없습니다. - 블로킹 완충액을 샘플로부터 흡인하고 0.5 mL의 희석된 일차 항체로 교체한다. 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 인큐베이션 중에 샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 덮개가있는 용기에 플레이트를 넣으십시오. 용기를 진탕기 위에 놓고 실온에서 3-4일 동안 샘플을 인큐베이션한다.
- 차단 완충액에서 희석하여 일차 항체를 준비한다. 난모세포를 시각화하기 위해, 난모세포 마커, 예를 들어, 쥐 항-생식세포 핵 산성 펩티다제(GCNA)/TRA98을 산전 및 사춘기 난소 둘 다에 사용하고, 토끼 항-DEAD-box 헬리콥터 4(DDX4)/마우스 바사 상동체(MVH)를 사춘기 및 사춘기 난소 둘 다에 사용한다. 산전 난소에서 LINE-1 ORF1p 발현을 정량화하기 위해, 토끼 항-LINE-1 ORF1p 또는 다른 이용가능한 항체를 사용한다.
- 7 일째
- 플레이트로부터 파라필름을 부드럽게 제거하고 샘플로부터 일차 항체 혼합물을 흡인한다. 일차 항체 혼합물을 4°C에서 (최대 한 달 또는 세 번의 용도 동안) 저장하고, 나중에 신선한 항체 (예를 들어, 이전에 사용된 혼합물의 5 mL 당 2 μL의 신선한 항체 분취액)로 보충함으로써 재사용한다.
- 웰 당 1 mL의 세척 완충액 (표 1 및 섹션 1 참조)을 샘플에 첨가하고 , 플레이트를 몇 초 동안 부드럽게 흔들어 잔류 항체를 헹구어낸다. 조심스럽게 흡인하고 세척 완충액을 0.8 mL의 신선한 세척 완충액으로 교체하고 플레이트를 실온에서 밤새 흔들어 라.
- 8 일째
- 밤새 세척 완충액을 흡인하고, 0.8 mL의 신선한 세척 완충액으로 교체하고, 실온에서 2시간 동안 진탕한다. 신선한 세척 버퍼로 세척 단계를 2 시간 더 반복하십시오.
- 마지막 세척 후, 세척 완충액을 블로킹 완충액, 예를 들어 염소 항-래트 알렉사 플루오르 555 및 염소 항토끼 알렉사 플루오르 647에 희석된 0.5 mL의 이차 항체 혼합물로 교체하여 1:1,000으로 희석한다. 각 면역염색 실험에 대해 신선한 이차 항체 혼합물을 준비한다.
- 인큐베이션 중에 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 샘플을 어둠 속에서 또는 알루미늄 호일로 덮인 플레이트에서 실온에서 3 일 동안 온화한 교반으로 인큐베이션하십시오.
참고: 이 단계와 모든 후속 단계는 어두운 곳이나 알루미늄 호일 랩에서 수행됩니다.
- 11 일째
- 이차 항체 혼합물을 흡인하고, 1 mL의 세척 완충액으로 초기 세척을 수행한다. 플레이트를 몇 초 동안 부드럽게 흔들어 잔류 이차 항체를 헹구십시오.
- 세척 완충액을 흡인하고, 0.8 mL의 신선한 세척 완충액으로 교체하고, 샘플을 진탕으로 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호한다. 총 3 번의 세척에 대해 세척 단계를 2 번 반복하십시오. 세 번째 세척 후 클리어링 단계(섹션 6)로 진행하십시오.
6. 면역염색된 전체 마운트 난소의 제거(그림 2A).
참고: 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸거나 불투명 한 용기에 배치하여 어둠 속에서 모든 클리어링 단계를 수행하십시오. 청산 단계는 사춘기 및 사춘기 난소에 따라 다릅니다.
- 11 일째 [산전 및 사춘기 난소는 한 단계 프로토콜로 지워집니다]
- 마지막 세척 후, 세척 완충액을 흡인하고 0.8 mL의 갓 만들어진 ScaleS4(0) 용액으로 교체한다(표 1 및 섹션 1 참조). 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 이미징 전에 사흘 내지 나흘 동안 실온에서 진탕하면서 어둠 속에서 샘플을 인큐베이션한다.
- 필요한 경우 ScaleS4 (0) 솔루션을 매일 신선한 솔루션으로 교체하십시오. 용액을 교체하는 동안 맑은 난소가 투명해지고 보기 어렵기 때문에 조심하십시오. 클리어링 후, 샘플 셋업 및 이미징으로 진행한다(섹션 7).
참고: 솔루션을 변경해도 이미지 품질이 크게 향상되지는 않았습니다. 매일 변경하면 작고 대부분 투명한 샘플이 손실 될 가능성이 높아집니다.
- 11-15 일 [사춘기 난소는 두 단계 프로토콜로 지워집니다]
- 마지막 면역염색 세척 후, 세척 완충액을 흡인하고 이를 0.8 mL의 ScaleCUBIC-1로 교체한다(표 1 및 섹션 1 참조). 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 어둠 속에서 3일 동안 37°C에서 샘플을 부드럽게 흔들어준다. ScaleCUBIC-1 용액을 매일 신선한 용액으로 교체하십시오.
- 15일째에, 샘플을 실온에서 PBS 0.8 mL에 10분 동안 3회 부드럽게 진탕하면서 세척한다. PBS를 PBS로 갓 제조한 0.8 mL의 탈기된 20% 수크로오스로 교체한다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주십시오.
- 20% 수크로오스 용액을 0.8 mL의 ScaleCUBIC-2 용액으로 교체하고( 표 1 및 섹션 1 참조), 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, ScaleCUBIC-2 용액의 매일 변화로 실온에서 부드럽게 흔들어준다. 4-5 일 동안 지우고 이미지로 진행하십시오. 맑은 난소가 투명하고 보기 어렵기 때문에 시료 손실을 피하기 위해 용액을 교환할 때는 주의해야 합니다. 샘플 설정 및 이미징으로 진행합니다(섹션 7).
7. 다중 광자 현미경을 사용한 샘플 설정 및 이미징
참고: 아래에 설명된 모든 단계는 최대 작동 거리가 2.2mm인 다중 침지 16x/NA0.6 목표물(침지 액체 = 글리세롤)을 사용하여 펄스 지속 시간이 120fs인 라이카 DICE/4TUNE/FALCON을 사용하여 수행되었습니다. 이미지 수집 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오. 보충 표 S1 및 보충 그림 S1은 이 프로토콜에 사용되는 설정을 보여줍니다. 다른 이미징 플랫폼의 경우 현미경 코어에 문의하거나 제조업체의 사양/권장 사항을 따르십시오.
- 샘플 설정
- 샘플을 장착하기 위한 설정을 준비합니다. 예를 들어, 끈적 끈적하고 유연한 실리콘 개스킷을 사용하여 접착제를 잘 만듭니다. 접착제를 25mm x 25mm No. 1.5 마이크로 커버슬립 위에 올려 놓고 난소가 놓일 웰을 만듭니다(그림 2B).
참고: 1mm 두께의 개스킷은 모든 크기의 난소를 수용합니다. 이 설정은 난소가 유리 바닥 접시의 장착제에 놓일 때 발생할 수있는 이미징 중에 난소 움직임을 제거하기 때문에 권장됩니다. - 팁이 잘린 피펫 팁(산전 및 사유의 경우 20μL)을 사용하여 난소를 ~5-10μL의 ScaleS4(0) 용액으로 도 2B에 표시된 접착제의 중간으로 옮깁니다. 사춘기 난소의 경우, 난소를 옮기기에 충분히 멀리 잘린 팁이있는 200 μL 피펫 팁을 사용하십시오. ~15-20 μL의 ScaleCUBIC-2 용액을 접착제 웰의 중간에 첨가한다.
참고: 용액이 너무 많으면 현미경 단계로 누출될 수 있으며 솔루션이 너무 적으면 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 해부 현미경을 사용하여 제거 된 난소가 투명 해지고 볼 수 없게되면 샘플을 옮깁니다. - 난소가 클리어링 용액 한 방울로 개별 웰로 옮겨지면 접착제 웰에 다른 커버 글라스를 부드럽게 놓고 씰을 만들기 위해 프레스한 다음 샘플을 두 커버슬립 사이에 끼워진 작은 클리어링 용액 풀에 보관합니다(그림 2B). 이미징을 위해 커버슬립 "샌드위치"를 3D 인쇄 현미경 어댑터 슬라이드(예: 43 )에 넣습니다.
참고: 접착제 웰은 "샌드위치"를 분해하고 물로 세척한 후 재사용할 수 있습니다.
- 샘플을 장착하기 위한 설정을 준비합니다. 예를 들어, 끈적 끈적하고 유연한 실리콘 개스킷을 사용하여 접착제를 잘 만듭니다. 접착제를 25mm x 25mm No. 1.5 마이크로 커버슬립 위에 올려 놓고 난소가 놓일 웰을 만듭니다(그림 2B).
- 이미징(보충 표 S1 및 보충 그림 S1)
- 현미경 코어 또는 제조업체의 지침에 따라 현미경 및 소프트웨어를 켭니다. 장착 된 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 접안 렌즈를 통해 저전력 LED 형광 램프로 조명 된 샘플을 찾습니다.
- 샘플이 발견되면 레이저를 켜고 각 검출기를 특정 Alexa Fluor 염료 / 마커에 할당하십시오. 다중 레이저의 경우 순차적 이미지 획득을 허용합니다. 레이저를 전환하기 전에 전체 스택을 확보하십시오.
참고: 이 프로토콜의 경우, 하나의 레이저를 555nm 및 647nm 형광단의 이미지 획득에 사용하였다. - 현미경 코어 또는 제조업체의 사양에 따라 이미지 수집을 위한 파라미터를 설정합니다. 가능한 경우 양방향 이미지 획득을 사용하여 스캔 시간을 줄이고 효율성을 향상시킵니다. 라인 평균(1), 프레임 평균 (1) 및 프레임 누적 (1)을 포함한 다른 설정을 조정합니다.
참고: 양방향 이미지 수집을 통해 레이저는 X축에서 이동할 때 양방향으로 스캔할 수 있습니다. - 시작(샘플 하단/하단 유리 커버)과 끝 위치(샘플 상단/상단 유리 커버)를 식별하여 Z-Stack을 설정합니다. 사춘기 난소의 경우 2μm, 사춘기 난소의 경우 5μm의 Z단계 크기를 선택합니다.
- Z 보정 피쳐를 활성화하면 이 피쳐 내에서 여기 게인을 활성화합니다. 바닥(저강도)과 상부 스택(고강도) 모두에 대해 레이저 강도 를 선택하여 시료의 바닥과 위쪽에 대한 Z 보정을 설정합니다. 보충 그림 S1, 여기 이득 박스가 선택되는 선형 Z 보상, 하단(0) 및 상단(347.75)에 대한 레이저 강도는 각각 10 및 12로 설정됨을 참조하십시오.
- 단일 시야각에서 캡처할 수 없는 더 큰 샘플의 경우 바둑판식 모드를 사용합니다. 이미지 탐색기를 활성화하고 직사각형 표시 도구를 사용하여 전체 샘플을 캡처하는 데 필요한 타일 수를 표시합니다.
- 이미지 획득을 시작합니다. 타일이 여러 개인 이미지의 경우 네비게이터 로 이미지 수집을 시작하여 모든 타일을 캡처합니다. 이미지 수집이 완료되면 먼저 모든 이미지를 저장하고 여러 타일을 획득한 경우 모자이크 병합 도구를 실행하여 타일을 단일 이미지로 병합합니다.
- 병합된 파일을 별도의 프로젝트 폴더에 저장하여 기가바이트 크기의 이미지로 보다 쉽게 작업할 수 있습니다. 3D 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어로 이미지 처리를 위해 파일을 전송합니다. 그림 3은 두 개의 마커 (GCNA 및 DDX4)로 서로 다른 단계에서 촬영 한 대표적인 이미지를 보여줍니다.
8. 이미지 처리
참고: 아래에 설명된 모든 단계는 IMARIS 3D 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 개발 및 수행되었습니다.
- 이미지를 3D 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어로 가져오고 필요한 경우 파일을 원래 형식(예: .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2)에서 .ims 형식으로 변환합니다.
- 필요한 경우 가우시안 필터로 이미지를 처리하여 픽셀화를 줄입니다(그림 4A). 3D 보기 피쳐를 사용하여 이미지를 배치하고 프레임 옵션(프레임 제거)의 선택을 취소합니다.
참고: 픽셀화를 줄이고 배경 강도를 줄이는 데 사용할 수 있는 다른 선택적 필터도 있습니다. - 이미지를 특정 배율로 확대하고 스냅샷 기능을 사용합니다. 다음과 같이 기본 설정을 지정합니다: 300 DPI를 선택하고 TIFF 이미지로 저장하며 투명 배경으로 저장합니다. 이미지의 스냅 샷을 찍어 저장하십시오. 그림 3은 조립된 전체 이미지를 보여줍니다.
9. 난모세포 정량화
참고: 전체 난소 면역형광 및 3D 이미지 시각화 및 분석은 스팟 기능을 사용하여 전체 난소에서 난자 수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다(그림 3 및 그림 4). GCNA 신호는 도 4(P5)에 도시된 바와 같이 산전 및 전후 난소에서 난모세포를 정량화하는데 사용될 수 있다. 사춘기 난소에서 DDX4 신호를 사용하여 성장하지 않는 난포 ( "고리 모양"구조, 닫힌 화살표)와 성장하는 난포 (큰 구조, 열린 화살표, 그림 4, P28)에서 두 개의 난모세포 집단을 정량화하십시오.
- 단계 9.2에서 스팟 특징을 갖는 난모세포를 정량화하기 위한 파라미터로서 사용될 난모세포의 크기를 결정한다.
- 이미지를 열고 [슬라이스] 옵션을 선택하여 Z-스택 이미지를 엽니다.
- [측정] 패널에서 선 옵션을 선택하고 가장 넓은 지점에서 난모세포/마커의 한쪽 가장자리에서 다른 가장자리까지 선을 그려 거리를 측정하여 계산할 난모세포 유형/크기의 XY 직경을 결정합니다. 스택을 통해 이동하고 동일한 유형의 여러 난모세포에 대한 직경 범위를 구하십시오. 난모세포 수에 대한 크기 선택 기준으로 가장 짧은 길이를 사용하십시오.
-
스팟 기능: 3D 뷰 옵션을 선택하고 [장면] 패널에서 [새 스팟 추가] 기능을 활성화하여 [알고리즘] 패널을 엽니다. 단계 9.1에서 수득된 난모세포 크기를 갖는 크기 선택 필터로서 모든 알고리즘 설정을 선택 취소하는 것이 사용될 것이다.
- 단일 앞으로 화살표를 클릭하여 소스 채널로 이동합니다. 기본 마커가 있는 채널을 선택하고 9.1단계에서 얻은 예상 XY 직경을 입력합니다. 예를 들어, 산전 난모세포의 경우 7μm, P5 난모세포의 경우 11μm의 추정된 XY 직경을 사용하십시오(GCNA = 녹색 신호; 도 3 및 도 4A).
- DDX4 신호에 대해 30 μm를 사용하여 P5 난소에서 성장하는 난포에서 난모세포의 수를 추정하십시오 (DDX4 = 자홍색 신호; 도 3 및 도 4A). 사춘기 난소의 경우, 난모세포 정량화를 위해 DDX4 신호를 사용하십시오. 예를 들어, 도 4A에 도시된 바와 같이, 15 μm 및 80 μm의 XY 직경을 사용하여 성장하지 않는 난포 및 성장하는 난포 내의 난모세포를 각각 확인한다.
참고: 선택한 크기는 이미지 수집 기준 및 사용된 현미경 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 선택은 또한 더 많은 난모세포를 가진 난소가 더 나은 자동화 된 난자 검출을 위해 더 작은 크기의 선택을 필요로하기 때문에 유전 적 균주마다 다를 수 있습니다. - 크기를 선택한 후 모델 PSF 신장 및 배경 뺄셈을 활성화하면 자동으로 결정됩니다. 단일 앞으로 화살표 를 선택하여 스팟 필터 패널로 이동합니다. 품질 필터를 추가하고 임계값을 결정합니다. 난모세포 수의 정확한 추정을 보장하기 위해, 역치가 조정되어 대부분의 난모세포를 선택하는 역치가 선택될 때 이미지를 확대한다. 이중 화살표 를 클릭하여 자동 카운트를 완료합니다.
- 편집 탭을 사용하여 선택한 난모세포를 수동으로 확인하여 놓친 난모세포를 선택하거나 자동 임계값에 의해 선택된 비 난모세포 입자를 선택 해제합니다. 추가 분석을 위해 전체 탭 아래의 통계 탭에 데이터를 기록합니다.
참고: 스팟 계산에 사용되는 매개 변수는 저장하고 다른 샘플 세트에 사용할 수 있지만 배치 분석을 실행하기 전에 수동 검사를 수행하는 것이 좋습니다. - 매개 변수를 저장하려면 만들기 탭을 클릭하고 배치에 대한 저장소 매개 변수를 클릭하십시오.
참고: 핵 마커(GCNA+ 난모세포, 도 4A)는 스팟 특징에 의해 쉽게 식별되며 많은 수동 조정이 필요하지 않을 수 있습니다. 그러나 세포질 마커 (DDX4 + 난모세포, 그림 3 (P28, 닫힌 화살표) 및 그림 4A)는 난모세포의 정확한 크기 / 유형의 식별을 보장하기 위해보다 수동 조정이 필요합니다.
10. 난소에서의 단백질 발현 정량화
참고: 스팟 기능(섹션 9 및 단계 10.1) 및 표면 기능(단계 10.2)을 모두 사용하여 특정 마커의 난모세포 발현 을 정량화하는 몇 가지 방법이 있습니다. 스팟 특징은 핵 마커 (GCNA)와 같은 뚜렷한 국소화 패턴을 가진 단백질에 사용할 수 있으며 , 표면 특징은 E15.5 및 E18.5 난소에서 LINE-1 ORF1p 강도가 측정 된 그림 5A 와 같이 불균일 한 국소화 패턴을 가진 단백질에 사용할 수 있습니다. 두 샘플 (예를 들어, 시간점, 치료 또는 유전자형) 사이의 관심있는 단백질의 강도를 계산하고 비교하기 위해, 동일한 특성을 갖는 이미지를 수집한다. 더 강렬한 신호를 가진 샘플을 사용하여 다른 샘플에 저장하고 사용할 수있는 매개 변수를 결정하십시오.
- 스팟 기능을 가진 단백질 발현을 얻으려면, 먼저 강조된 난모세포를 확인한다(섹션 9).
- 그런 다음 스팟 기능에서 통계 탭을 선택하고 세부 정보 탭을 선택합니다. 아래쪽 화살표 를 클릭하고 특정 값을 선택하면 그 아래에 다른 측정값이 포함된 다른 탭이 열립니다. 표면 생성에 사용되는 채널의 강도 평균 을 선택합니다(또는 강도 중앙값과 같은 다른 강도 측정값 선택).
- 결합/평균 통계 정보를 얻으려면 평균 값 기준을 선택합니다. 완료되면 추가 분석을 위해 데이터를 내보내고 저장합니다.
- [서피스] 피쳐로 단백질 발현을 얻으려면 이미지를 열고 3D 뷰 옵션을 선택한 다음 [장면] 패널에서 [새 서피스 추가] 기능을 활성화하여 [알고리즘] 패널을 엽니다. 필요하지 않은 경우 모든 알고리즘 설정을 선택 취소하고 단일 앞으로 화살표를 클릭하여 소스 채널로 이동합니다.
- 측정할 항체 신호가 있는 채널을 선택합니다. 선택할 다른 속성은 사용자별 옵션입니다. 여기서, LINE-1 신호를 마커로 사용하였다. 서피스 디테일 및 배경 빼기(로컬 대비) 값은 각각 1.42 및 5.33의 기본값으로 유지되었습니다.
- 앞으로 화살표를 클릭하여 임계값 패널로 이동합니다. 두 샘플 모두에서 필적할만한 역치값을 선택하십시오 (예를 들어, 여기서, E18.5에서의 LINE-1 발현은 역치를 선택하기 위해 사용되었다). 기본 시드 포인트 지름이 7.10인 상태에서 사용을 선택합니다(이 값은 이미지에 최적으로 발견되었지만 예상되는 픽셀 크기의 피처에 따라 달라질 수 있음).
- 앞으로 화살표를 클릭하여 서피스 필터 패널로 이동합니다. 품질 필터를 사용하여 사용하였고, 역치 값과 마찬가지로, 두 난소 샘플에서 단백질의 발현에 대한 값을 기초로 하였다. 필터 속성이 선택되면 앞으로 두 번 화살표를 클릭하여 서피스 생성을 완료합니다.
- 강도 값을 가져오려면 통계 탭을 선택하고 세부 정보 탭을 차례로 선택합니다. 아래쪽 화살표 를 클릭하고 특정 값을 선택하면 그 아래에 다른 측정값이 포함된 다른 탭이 열립니다.
- 표면 생성에 사용되는 채널의 강도 평균 을 선택합니다(또는 강도 중앙값과 같은 다른 강도 측정값 선택).
- 결합/평균 통계 정보를 얻으려면 평균 값 기준을 선택합니다. 완료되면 추가 분석을 위해 데이터를 내보내고 저장합니다(그림 5C).
11. 전산 교정을 통한 손상된 난소의 총 난모세포 수 추정
참고: 해부 중에 경미한 난소 손상이 발생하면 총 난모세포 수를 계산적으로 추정할 수 있습니다. 도 6에 도시된 바와 같이 난모세포 수 추정을 위해 동일한 균주 및 발달 단계의 온전한 난소를 사용하는 것이 좋습니다. E15.5에서 난소로 수행된 시뮬레이션은 ≥30% 손실을 보정하면 실제 숫자와 상당한 편차가 발생한다는 것을 나타냅니다(그림 6C).
- IMARIS로 손상되지 않은 난소의 이미지를 열고 프레임 피쳐를 선택합니다. 프레임 설정에서 상자, 격자, 눈금표 및 축 레이블을 선택합니다. 위치 X/Y/Z 탭에서 200μm를 선택하여 모든 X/Y/Z 위치에 200μm 공백이 있는 눈금이 생성됩니다.
참고: 눈금은 X, Y 및 Z 평면에서 격자/눈금자를 만들어 특정 영역 내의 난모세포를 식별합니다. - 스팟 기능을 활성화하여 섹션 9에서 강조 표시된 난모세포를 확인합니다(그림 4). 스팟 피쳐의 포인트 스타일/품질 탭에서 구를 선택하여 시뮬레이션에 사용되는 모든 손상되지 않은 난소에서 식별된 난모세포를 사용하여 3D 모델을 생성합니다.
참고: 픽셀 너비 는 포인트 스타일/품질 탭에서도 변경할 수 있습니다. - 단계 11.1에서 생성된 박스로, 무손상 난소의 3D 모델을 도 6A에 도시된 바와 같은 방향으로 정렬한다.
- 200 μm 틱마크(단계 11.1)를 사용하여, 각 난소의 부피의 50% 내에 속하는 난모세포를 선택한다. 스팟 기능을 클릭하고 라벨 편집을 선택하여 그림 6A와 같이 50% 영역에 속하는 난모세포를 색상별로 분류합니다.
참고: 일단 난모세포가 한 영역에서 분류되면, 각 부류에 속하는 난모세포의 수가 제공될 것이다. - 50% 영역을 확대하고 눈금표를 200μm에서 50μm로 변경하여 난모세포 식별을 위한 더 작은 눈금자를 만듭니다. 모든 이미지에서 확대/축소 %를 유지합니다. 50μm 눈금이 가이드로 표시된 상태에서 50% 영역을 5등분으로 나눕니다.
참고: 각 부분 내의 난모세포는 도 6A에서 강조된 바와 같이 부피의 10%를 나타낼 것이며, 여기서 무손상 난소는 다섯 가지 색으로 분류된 난소의 위쪽 절반에 있는 난모세포를 나타내며, 각 색은 10% 용적 영역 내의 난모세포를 나타낸다. - 도 6A, B에 도시된 바와 같이 각 10% 영역에서 난모세포 수를 기록한다. 10, 20, 30, 40 및 50% 증가에 대한 난모세포의 평균 수를 계산합니다.
- 단계 11.1 내지 11.6에서 강조된 것을 사용하여 손상된 부분 난소에서 난모세포 번호를 얻는다. 손상된 난소를 손상되지 않은 난소와 동일한 방향으로 배치하고 위에서 설명한 것처럼 누락 된 부피 / 백분율을 추정하십시오.
- 전체 난소에서 총 난모세포 수를 추정하려면, 부분 난소로부터 수득된 수와 유사한 부피에 대해 계산된 난모세포의 평균 수를 추가한다(도 6B).
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Representative Results
전체 난소의 면역 염색 및 이미징은 동일한 기술 및 마커를 사용하여 다양한 발달 단계에서 난소에서 난모세포 또는 단백질 발현의 시각화 및 정량화를 가능하게합니다 (그림 3). 이 프로토콜은 여러 단계의 난소 분석과 여러 마우스 균주의 분석이 필요한 대규모 프로젝트를 위해 개발되었습니다. 여기에서는 유전자 분석을 위한 표준 균주인 C57BL6/J 균주에 대해 수집된 데이터를 제시합니다. 여기에 제시된 기술은 간단하며 14-19 일 이내에 결과를 얻을 수 있으며 (그림 2D) 산전, 사춘기 및 사춘기 암컷의 난소에 사용할 수 있습니다 (그림 1 및 그림 2A, B).
이 접근법은 난소 난모세포 예비의 형성 동안 자연적으로 발생하는 난모세포 손실의 역학을 연구하는데 사용되었다. 마우스를 포함한 많은 유기체에서, 난모세포 수는 난모세포가 meiosis ~ E13.5에 들어갈 무렵에 태아 생활 동안 최고조에 달하는 것으로 생각됩니다. 난모세포 수는 아직 완전히 이해되지 않은 태아 난모세포 감소 (FOA) 과정 (~E15.5에서 E18.5까지)으로 인해 감소하며, 이는 레트로트랜스포존 LINE-120,21의 발현과 기계적으로 연결되어 있다. E18.5 내지 P0 이후 더 많은 난모세포가 제거되는데, 이는 meiotic quality 체크포인트22,23에 의한 비정상적인 난모세포의 제거로 인한 것이다. 이 프로토콜을 사용하여 이러한 과정을 조사하기 위해 우리는 그림 3과 같이 DDX4 및 GCNA를 난모세포 마커로 사용하여 다양한 발달 단계에서 난소를 면역염색하고 이미지화했습니다.
GCNA 및 DDX4를 발현하는 작은 난모세포는 E15.5 이상에서 볼 수 있으며 MPI 동안 난모세포를 나타내거나 원시적 인 여포 내에서 dictyate에서 체포됩니다. 강한 DDX4 발현을 갖는 더 큰 성장하는 난모세포는 P2 난소에서 이미 검출되며, 여기서 그들은 모낭44의 첫 번째 파동을 나타낼 가능성이 가장 큽니다. P5 및 P28 난소에서 더 큰 난모세포의 수가 증가하고 있습니다. 다중 광자 현미경으로 얻은 이미지 (그림 4A)는 IMARIS 소프트웨어를 사용하여 처리되었으며 3D 렌더링을 수행하여 핵 GCNA 신호 및 DDX4 신호로 묘사 된 크기를 기반으로 작고 큰 성장하는 난모세포를 식별했습니다 (그림 4A 및 비디오 1). 난모세포는 프로토콜에 기재된 바와 같이 계수되었고, 결과는 도 4B에 요약되어 있다. 이전 연구와 일치하여, 우리는 E15.5에서 E18.5 (~ 32 %)로, E18.5에서 P2 (~ 24 %)까지의 상당한 난모세포 손실을 관찰했습니다. 암컷이 사춘기 (P28)에 도달 할 때까지 E15.5에 존재하는 난모세포의 ~ 30 % 만 생존했습니다.
이 방법은 또한 조사와 같은 유전 독성 치료의 결과를 관찰하는 데 사용될 수 있으며, 이는 일주일 이내에 원시적 인 난포 예비를 완전히 제거하는 것으로 나타났습니다 23,38,45. 도 3에서 방사선으로 처리된 전체 난소와 처리되지 않은 대조군 사이에 유의한 시각적 차이가 명백하다(치료된 암컷과 처리되지 않은 암컷의 P28 난소 비교). 방사선 노출이 없는 P28 난소에서, 우리는 DDX4로 표지된 두 개의 난모세포 집단을 관찰하였다; 원시적 인 난포에 풍부한 작은 난모세포 (닫힌 화살표); 다양한 크기의 더 큰 난모세포는 성장 난포 (예를 들어, 원발성, 이차 및 전치)에서 전형적으로 발견된다 (도 3). 대조적으로, P7에서 0.5Gy의 γ 방사선에 노출 된 여성의 난소는 이전에 2D 섹션에서 관찰 된 바와 같이 원시적 인 난포에서 작은 난모세포가 전혀 없습니다. 흥미롭게도, 비슷한 크기의 더 큰 난모세포 만이 방사선에서 살아남았습니다. 이들은 P7 난소에서 이미 자라는 첫 번째 파낭일 수 있는데, 이는 방사선(46)에 내성이 있는 것으로 알려져 있기 때문이다(도 3, P28).
난모세포 수의 정량화 외에도,이 프로토콜은 난모세포 발달에 관여하는 다른 단백질의 면역 염색 및 정량 분석에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 LINE-1 레트로트랜스포존에 의해 생산된 RNA 결합 샤페론 단백질인 LINE-1ORF1p 단백질에 대한 항체를 사용하였다(도 5). E15.5에서 E18.5로의 LINE-1 요소의 풍부도의 증가는 난모세포 제거20,21을 야기하는 것으로 제안되었다. 실제로, IMARIS에서의 다중 광자 캡처 이미지 및 신호 강도 분석을 사용하여, LINE-1 ORF1p 수준은 이 시간 동안 난모세포에서 유의하게 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 도 4B에 도시된 바와 같이 난모세포 수의 현저한 감소와 상관관계가 있다.
난소의 일부가 손상되거나 소실되는 상황에서, 동일한 균주 및 발달 단계의 난소는 도 6에 도시된 바와 같이 누락된 영역 내의 난모세포의 수를 계산적으로 추정하는데 사용될 수 있다. E15.5 난소의 데이터는 계산 교정의 정확성을 테스트하기 위해 시뮬레이션에 사용되었습니다. 최대 30 %의 조직 손상을 가진 난소의 난모세포는 무손상 난소의 난소에 비해 ≤10 % 편차를 갖는 것으로 계산적으로 추정 될 수 있으며, 이는 3D 난소 염색 및 모델링이 귀중한 조직으로부터의 데이터를 구제하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 시사합니다. E15.5에서 난소로 수행된 시뮬레이션은 ≥30% 손실을 보정하면 실제 숫자와 상당한 편차가 발생한다는 것을 나타냅니다(그림 6C).
그림 1: 산전 및 산후 단계에서 암컷으로부터의 난소 해부 및 관류. (A-C) 다른 단계의 난소 해부에는 비디오의 설명을 보완하기 위해 개략적으로 묘사 된 다른 기술이 필요합니다. (d) 산후 5일째(P5)의 난소는 P28에서보다 훨씬 작으며, 이는 프로토콜에 설명된 바와 같이 상이한 클리어링 프로토콜을 필요로 한다. (E, F) 난소의 적절한 관류는 적혈구에서 배경 염색을 제거하는 데 중요합니다. 비 관류 생식관과 난소는 분홍색 색조를 띠고 관류 된 기관은 흰색으로 변합니다. 약어: RI = 비관류 생식관. 이미지 A-C는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전체 마우스 난소의 면역염색, 지우기 및 이미징. (A) 흐름도는 산전/사춘기 및 사춘기 난소에 대한 면역염색 및 클리어링 프로토콜을 위한 공유 및 특정 단계를 묘사합니다. (B) 클리어 난소는 두 개의 커버 슬립 사이에 잘 끼워진 접착제의 중간에있는 클리어링 용액 한 방울에 장착됩니다. 이미징을 위해 장착된 샘플은 3D 프린팅된 어댑터 슬라이드에 배치됩니다. (c) 난모세포 마커 DDX4로 면역염색된 비관류 대 관류 난소의 그레이스케일 다중광자 이미지로, 관류 후 개선된 화질 및 낮은 비특이적 염색을 보여준다. 닫힌 화살표는 원시성 난포에 전형적인 세포질 DDX4 염색의 얇은 층을 갖는 난모세포를 나타내고, 열린 화살표는 성장하는 모낭 내에서 더 큰 난모세포를 나타낸다. 별표는 혈관으로부터의 자가형광을 나타낸다. (D) 난모세포 마커 GCNA (녹색) 및 DDX4 (자홍색)로 면역염색된 P5 난소의 공초점 대 다중 광자 이미지에서 3D 렌더링하여 공초점 현미경에서 상당한 구형 수차를 나타내며 다중 광자에서는 거의 없음을 보여줍니다. 스케일 막대 = 100μm(C, D) 및 50μm( D의 인셋). 약어: GCNA = 생식세포 핵산성 펩티다제; DDX4 = 데드 박스 헬리콥터 4. 이미지 A는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 다른 발달 단계의 난소의 대표적인 3D 렌더링 이미지. 산전 및 산후 난소에서 각각 GCNA (녹색) 및 LINE-1 ORF1p (파란색) 또는 DDX4 (자홍색)로 면역 염색 된 전체 마운트 난소의 다중 광자 이미지에서 3D 렌더링. 개별 채널은 핵 및 세포질 신호를 보여주기 위해 회색조로 표시됩니다. 흰색 상자 윤곽선은 왼쪽 아래쪽 인셋에서 확대된 영역을 나타냅니다. P28에 대해 두 개의 다른 난소가 표시됩니다. 대조구로부터의 난소는 조사되지 않은 암컷 (상부)에서 원시적 난포에서 작은 난모세포의 큰 집단을 함유한다 (삽입물 참조). 대조적으로, 0.5 Gy의 γ 방사선 (IR)으로 P7에서 조사 된 암컷의 난소는 원시적 인 난포에서 작은 난모세포가 전혀 없다 (삽입 참조). 닫힌 화살표는 원시적 여포에 전형적인 세포질 DDX4 염색의 얇은 층을 갖는 난모세포를 나타내고, 열린 화살표는 성장하는 모낭 내에서 더 큰 난모세포를 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm; P28 인셋을 위한 30 μm; 다른 모든 인셋에 대해 10 μm. 인셋에는 IMARIS에서 생성된 3D 렌더링 이미지의 확대된 뷰가 포함되어 있으며 원근감으로 인해 배율이 낮은 이미지와 약간 다를 수 있습니다. 약어: 비 IR = 비-조사된 대조군; IR = 0.5 Gy의 γ-방사선으로 P7에서 조사; GCNA = 생식세포 핵산성 펩티다제; DDX4 = 데드박스 헬리케이스 4; LINE-1 = 긴 산재된 핵 원소-1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이미지 처리, 난모세포의 3D 표시 및 정량화 결과. (A) 다중 광자 이미지로부터의 3D 렌더링(왼쪽)은 가우시안 필터(중간)를 사용하여 IMARIS에서 처리되었고, 작고 큰 크기의 난모세포는 스팟 특징(오른쪽)을 사용하여 식별되었다. P5 및 P28 난소를 예로 나타내었다. 스케일 바 = 100 μm (P5); 10 μm (P5 인셋); 300 μm (P28); 50 μm (P28 인셋). (B) GCNA에 대해 양성인 작은 난모세포는 반점 특징(상단)을 사용하여 상이한 단계의 난소에서 정량화되었다. 발달 동안 난모세포의 수가 감소하는 것을 설명하기 위해, E15.5 (하단)에서 계산 된 초기 단계에 존재하는 평균 수와 비교하여 각 단계에서 난모세포의 평균 %를 계산했습니다. E15.5에서 E18.5로 난모세포 수가 크게 감소한 것을 주목하십시오. 데이터는 SD± 수단으로 제시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되고 단방향 ANOVA로 분석되었으며 중요성은 Bonferroni의 사후 다중 비교 테스트에 의해 결정되었습니다. * P ≤ 0.05; P ≤ 0.0001; ns >0.05. 약어: GCNA = 생식세포 핵산성 펩티다제; ns = 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 태아 난모세포에서 LINE-1 ORF1p 발현의 검출 및 정량화. (A) 다중 광자 이미지로부터의 3D 렌더링은 E15.5 및 E18.5 태아 난모세포(녹색 GCNA로 표시됨)에서 LINE-1 ORF1p(파란색) 발현을 보여준다. (B) 패널 A의 맨 위 행 이미지를 사용하여 IMARIS에서 생성된 3D 서피스. (c) LINE-1 ORF1p 강도 분석은 E15.5보다 E18.5에서 난모세포당 LINE-1 ORF1p의 더 높은 발현을 보여준다. 스케일 바 = 100 μm; 10 μm (패널 A 인셋); 30 μm (패널 B 인셋). 데이터는 SD± 수단으로 제시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되고 스튜던트 t-test로 분석되었으며 중요성은 Mann-Whitney U 테스트에 의해 결정되었습니다. P ≤ 0.0001; ns >0.05. 약어: GCNA = 생식세포 핵산성 펩티다제; LINE-1 = 긴 산재된 핵 원소-1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 전산 보정을 통해 손상된 난소 샘플에서 총 난모세포 수를 추정하는 방법. (A) 온전한 난소에서 적색, 청색, 회색, 자홍색 및 갈색으로 강조 표시된 5 개의 10 % 영역을 가진 GCNA 양성 (녹색) E15.5 난모세포의 모델. 손상되지 않은 난소 뒤의 각 후속 이미지는 10 % 증분 영역이 최대 50 %까지 누락 된 시뮬레이션 된 난소를 나타냅니다. (B) 손상된 샘플에서 난모세포 수를 추정하는 전산 방법의 개략도. (c) 모의 난소의 총 난모세포 수는 원래의 무손상 난소의 숫자와 비교되었으며 (100 %로 간주됨) 그 차이는 % 편차로 표시됩니다. 10-50 % 부피가 누락 된 여섯 개의 개별 난소에서 시뮬레이션. 스케일 바 = 80 μm. 약어 : GCNA = 생식 세포 핵 산성 펩티다제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : P5 난소에서 난모세포의 3D 렌더링 및 3D 모델링. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 및 버퍼 | 시약 | 구성 |
| 고정 | 파라포름알데히드 | 4% (v/v) |
| 투과화 완충액 | 폴리비닐알코올(PVA) | 0.2%(v/v) |
| 나트륨 보로 하이드라이드 | 0.1%(v/v) | |
| 트리톤 X-100 | 1.5% (v/v) | |
| 차단 버퍼 | 소 혈청 알부민 (BSA) | 3% (승 / v) |
| 1 M 글리신 (pH 7.4) | 2% (승 / v) | |
| 트리톤 X-100 | 0.1% (v/v) | |
| 200x 페니실린-스트렙토마이신 | 1% (v/v) | |
| 10% 나트륨 아지드 | 0.2% (v/v) | |
| 염소 혈청 | 10% (v/v) | |
| 세척 완충액 | PVA | 0.2%(v/v) |
| 트리톤 X-100 | 0.15% (v/v) | |
| 10% 나트륨 아지드 | 0.1% (v/v) | |
| 스케일S4(0) 용액(pH 8.1) | D-소르비톨 | 40%(승 v) |
| 요소 | 24% (승 / v) | |
| 글리세롤 | 10% (v/v) | |
| 증권 시세 표시기 | 20% (v/v) | |
| 스케일큐빅-1 용액 | 요소 | 25% (승 / v) |
| N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필)에틸렌디아민 | 25% (v/v) | |
| 트리톤 X-100 | 15% (v/v) | |
| 수크로오스 솔루션 | 자당 | 20%(승 v) |
| 스케일큐빅-2 용액 | 자당 | 50% (승 / v) |
| 요소 | 25% (승 / v) | |
| 트리에탄올아민 | 10% (승 / v) | |
| 트리톤 X-100 | 0.1% (v/v) |
표 1: 용액 및 버퍼.
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Discussion
이 기사에서는 생식 세포 정량화 및 단백질 국소화에 대한 높은 처리량 및 비교 연구를 위해 산전 및 산후 난소에 대한 상세한 3D 면역 염색 및 이미징 프로토콜을 제시합니다. 우리는 10-16 개의 다른 균주에서 6 개의 발달 시점에서 난소 (N = 6-12)의 난자 수를 분석하기 위해이 프로토콜을 개발했으며, 2-4 개의 24 웰 플레이트는 일반적으로 한 번에 처리됩니다. 이 방법은 다른 기관 또는 세포 마커에 적합할 수 있다. 예를 들어, 이 프로토콜은 적절한 항체를 사용하여 난소의 과립 세포와 같은 체세포를 표지하고 시각화하는데 사용될 수 있으며, 따라서 체세포-생식 세포 상호작용 또는 다른 난소 세포 유형의 발달에 대한 연구를 용이하게 한다.
이러한 프로토콜과 항체 조합의 한 가지 한계는 상이한 소낭선 단계의 결정적인 확인이다. 과립 세포 핵의 층에 의한 여포 단계를 확인하기 위해 면역 형광 및 2D 이미징에 사용되는 DNA 염색은 3D 접근법에 충분하지 않습니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 또는 Hoechst는 큰 조직의 중간에서 제한된 빛 침투 및 붕괴 신호로 인해 전체 장기 염색에 거의 사용되지 않습니다. 요오드화 프로피듐(PI)은 조직 깊숙이 침투할 수 있는 소분자이지만 스펙트럼 중첩으로 인해 다광자 이미징 시스템에서 캡처하기가 어렵습니다. 소낭선 단계의 더 나은 분해능은 항-뮬러리안 호르몬 (AMH) 또는 FOXL247,48과 같은 과립상 세포에 특이적인 추가적인 마커에 의해 달성될 수 있다. 그러나 이러한 마커는 더 큰 성장하는 모낭을 구별하는 데 도움이되지만 원발성 모낭과 원발성 모낭을 구별하지는 않습니다. 이러한 초기 단계에 대한 특정 마커가 제공 될 때까지 DDX4 또는 GCNA와 같은 난모세포 마커는 모낭 발달의 가장 좋은 지표를 제공합니다. 또한,이 프로토콜은 태아 남성 생식선에 대해 작동하지만 그 크기가 제한 요인 일 수있는 산후 고환에서 아직 테스트되지 않았습니다. 다양한 크기의 난소에서 생식 세포의 더 나은 시각화 및 정량화를 위해 중요한 문제가 아래에 나열되어 있으며 다운 스트림 분석을위한 양질의 면역 염색을 보장하기 위해 취해진 기술과 단계가 강조됩니다.
첫 번째 중요한 단계는 고정 전후에 난소의 손상을 방지하는 것입니다. 손상된 난소는 장기 구조의 일부가 부족하여 난자 수에 영향을 미치고 실험 결과를 왜곡 할 수 있습니다. 손상을 방지하기 위해, 여분의 체세포 조직은 난소를 옮기기 위해 포셉으로 잡기 위해 해부 후 더 큰 난소에 부착되어 있습니다. 또한, 더 작은 난소의 경우, 난소가 팁 내에 쉽게 들어갈 수 있도록 충분히 넓게 자른 피펫 팁으로 운반하면 손상을 피할 수 있습니다. 경미한 조직 손상으로 인해 난소의 일부가 누락되면 손상된 샘플의 총 난모세포 수를 동일한 유형의 무손상 샘플을 사용하여 외삽 할 수있는 전산 방법으로 완화 할 수 있습니다 (그림 6).
그러나 계산 시뮬레이션을 통해 손상된 영역의 크기가 커짐에 따라 예측 정확도가 감소하는 것으로 나타났습니다 ( 그림 6C의 경우 각각 100.8 % ± 0.2 %, 1.5± 97.2 %, 1 ± 90.3 % 및 1). 시뮬레이션을 기반으로 손실이 >30%인 샘플을 분석에서 제외하는 것이 좋습니다. 동일한 샘플 유형으로부터의 다중 무손상 난소를 사용하여 손상된 샘플에서 누락된 난자와 유사한 영역의 평균 난모세포 수를 계산하였다. 이 숫자는 그런 다음 난소에서 손상이있는 난모세포의 총 수를 예측하는 데 사용되었습니다. 누락 된 영역과 맞닿은 동일한 난소에서 유사한 크기의 영역을 사용하여 대안으로 사용할 수 있지만 테스트되지는 않았습니다.
또 다른 문제는 자기 형광을 일으킬 수있는 세포를 오염시키는 것을 피하는 것입니다. 사춘기 난소의 경우, 자가형광을 일으킬 혈액 세포를 제거하기 위해 위에서 설명한 바와 같이 1x PBS 및 1% PFA를 모두 사용한 관류를 수행해야 합니다(그림 2C). PBS를 사용한 관류는 장기, 특히 난소와 신장이 혈액을 제거하고 1% PFA로 전환하기 전에 흰색이 될 때까지 계속되어야 합니다(그림 1E, F). PBS를 사용한 비효율적인 관류는 작은 난모세포의 가려움을 가릴 수 있고 시각화를 어렵게 만들 수 있는 높은 배경을 초래할 것이다. PFA의 더 낮은 (1%) 또는 더 높은 비율 (4%)을 갖는 관류는 PBS 단독을 사용한 관류보다 더 나은 이미지 품질을 초래한다; 따라서, PFA의 더 낮은 백분율이 사용되었다.
항체 염색의 최적화는 몇 가지 변수에주의를 기울여야합니다. 투과화 단계의 경우, 4h가 이 분석에 이상적인 것으로 밝혀졌으며, 4시간(6-8시간 시험)보다 긴 기간으로 염색이 전혀 나타나지 않았다. 대규모 면역염색 실험에 사용되는 항체의 양과 비용이 높을 수 있기 때문에, 이 프로토콜은 면역염색 품질의 손실 없이 항체 믹스를 재사용하기 위해 시험되고 최적화되었다. 재사용을 위해, 항체 혼합물은 프로토콜에 기재된 바와 같이 신선한 항체로 보충되어야 한다. 세척 단계는 또한 면역 염색의 품질에 중요하며 이미징 중에 더 나은 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 더 오래 수행되어야하며 선택한 각 항체에 대해 결정되어야합니다. 최상의 결과를 얻으려면 ScaleS4(0) 클리어링 솔루션을 사용할 때마다 신선하게 준비하는 것이 좋으며, ScaleCUBIC-1 및 ScaleCUBIC-2는 어두운 곳에서 실온에서 ~1-2개월 동안 보관할 수 있습니다.
ScaleCUBIC-1 클리어링은 37°C에서 수행되고; 중요한 것은, 더 높은 온도는 시약 침전을 초래할 것이므로 피해야하며, 이는 면역 염색의 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 이미징을 위해 여러 샘플을 장착하는 것은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 다른 프로토콜에 사용되는 한천 또는 다른 임베딩 방법은 노동 집약적이며, 샘플(47,49,50)의 추가적인 재제거가 필요할 수 있다. 재사용 가능한 실리콘 개스킷은 커버슬립과 함께 사용하기 쉽고 다른 샘플 크기를 수용하기 위해 다양한 크기와 깊이로 제공되는 접착제 웰로 사용할 수 있습니다. 고품질 이미지를 얻으려면 충분한 양의 클리어링 솔루션을 사용해야합니다. 너무 적으면 이미지 품질이 저하되고 너무 많은 솔루션이 현미경으로 누출 될 수 있습니다. 이 단계는 크기에 따라 특정 샘플에 대해 최적화되어야 합니다. 유리 바닥 접시를 사용할 수 있지만 가장 작은 움직임으로도 이미지가 왜곡되므로 이미징을 위해 샘플을 고정해야합니다. 실리콘 개스킷은 이미징을 위해 샘플을 고정화하기 위해 유리 바닥 접시 및 상단 커버슬립과 함께 사용될 수 있습니다. 그러나 이것은 난소의 크기 때문에 양쪽에서 이미징이 필요한 경우 샘플을 뒤집는 능력을 제한합니다.
이 대규모의 고처리량 접근 방식의 또 다른 중요한 선택은 두 개의 조정 가능한 스펙트라-피직스 멀티광자(MP) 레이저를 사용하여 라이카 DIVE/4TUNE/FALCON 플랫폼에서 이미징하는 것이었습니다. DIVE 플랫폼 사용의 이점으로는 샘플 장착의 용이성(위에서 설명), 광학 왜곡 최소화(공초점 플랫폼과 비교), 그리고 가장 중요한 것은 획득한 이미지 데이터의 이미징 속도 및 관리 등이 있습니다. 더 높은 배율(16x)에서 다중 광자 레이저로 샘플을 이미징하는 것은 LAS X 소프트웨어로 이미지 수집을 위해 유사한 설정을 사용하는 라이카 DIVE 또는 SP8의 공초점 레이저보다 훨씬 빠르고 광손상을 덜 유발합니다. MP 빔은 낮고, 형광단 여기는 초점에 고도로 국한되어 있으며 더 많은 수의 공간 / 축 이미징 단계 (공초점 : 최대 ~ 300-400 섹션, MP : >800 섹션)에도 불구하고 광손상을 입히지 않고 낮은 배율에서 더 많은 깊이를 달성합니다.
16x/NA0.6 목표는 최대 신호에 대해 최적으로 설정되는 기계적 보정 칼라를 통해 광축을 따라 샘플 및 장착 물질 분포로 인한 약간의 굴절률 불일치를 보정할 수 있습니다. 더욱이, 난모세포와 같은 구형 구조는, 주어진 핀홀 설정에서 실장제 및 샘플 굴절률 불일치로 인한 공초점 평면(신호)의 깊이 의존적 국재화로서 공초점 이미지 획득에 의해 왜곡될 수 있다(도 2D). 형광 신호가 초점이 맞지 않는 신호를 제거하기 위해 기기의 내부 핀홀을 통해 포착됨에 따라 고유 한 광학 왜곡 (구형 수차)이 샘플의 깊숙이 악화 될 수 있으며 이는 더 큰 난소 (즉, ~ 400-600 마이크로 미터 두께)에 문제가됩니다.
동일한 매칭 렌즈 보정 설정을 사용하면 다양한 방출 파장을 가진 DIVE MP 시스템에서 구형 수차를 거의 감지할 수 없으므로 정량화 및 공동 현지화 연구가 간소화됩니다(그림 2D). 마지막으로, 고출력 펄스 레이저는 특히 Z 깊이 여기 보정과 함께 사용될 때 샘플 내부 깊숙한 곳에서 흥미로운 낮은 형광단 농도를 허용합니다. 또한, 일반 광배수 튜브와 눈사태 광자 계수 검출기의 조합인 MP 하이브리드 검출기(HyD-RLD)에 의해 약한 신호의 포착도 향상되어 광범위한 방출 파장에서 30배 이상 높은 신호 검출이 가능합니다.
라이트 시트(LS) 다중 광자 현미경은 3D 조직 이미징(47)을 위한 또 다른 신흥 플랫폼이다. 그러나 LS는 한천 임베딩 및 이미징 설정을 포함하여 거시적 샘플에 대해 더 많은 설정 시간을 요구합니다. 또한, 샘플 회전으로 더 높은 배율로 획득한 이미지는 >100GB의 큰 파일을 생성할 수 있으며, 이는 라이트 시트 섀도잉 아티팩트를 제거하는 데 필요할 수 있습니다(외부 매체와 샘플 내부의 굴절률 불일치 또는 샘플 표면 왜곡으로 인해). 접착제 웰의 용액에 샘플을 장착하는 제시된 방법은 간단하고 빠릅니다.
또한,이 접근법은 하나의 설정으로 뒤집거나 회전하지 않고 하나의 우물에서 여러 난소를 이미징 할 수있게합니다. 그러나 커버 슬립 "샌드위치"를 뒤집는 것은 더 큰 난소에 필요할 수 있습니다. DIVE 시스템 이미징은 공초점 및 LS보다 빠릅니다. 16x 배율에서, 사춘기 난소는 3-5 분 (Z 단계 2 μm)에서 영상화되고 사춘기 난소는 1 h (Z 단계 5 μm)로 영상화된다. 또한 LAS X에서 생성된 파일은 관리 가능한 크기(2-20GB)로, 다운스트림 분석을 위한 많은 수의 샘플에도 중요합니다. 이 면역염색 프로토콜은 DIVE 플랫폼과 함께 사용하도록 최적화되었지만, 면역염색된 샘플은 일부 변형이 있는 다른 MP/LS 플랫폼을 사용하여 이미징할 수 있습니다.
3D 모델링 프로토콜을 사용한 전체 난소 염색의 장점은 2D 분석에서 수동 데이터 수집에 비해 효율적이고 상대적으로 쉬운 데이터 분석입니다. IMARIS 3D 시각화 및 분석 소프트웨어는 상용화되어 있으며 많은 현미경 코어에서 제공되며 프로그래밍 기술이 필요하지 않으며 라이카의 LAS X 또는 자이스의 ZEN과 같은 많은 이미지 수집 소프트웨어 플랫폼과 호환되기 때문에 선택되었습니다. IMARIS를 사용하면 프로토콜 섹션에서 강조 표시된 대로 표준 매개 변수를 설정하고, 이러한 매개 변수를 사소한 변경으로 다른 이미지 및 샘플에 사용할 수 있으므로 재현성과 효율성이 향상됩니다.
이미지 분석 및 정량화는 IMARIS 소프트웨어에 최적화되어 있습니다. 그러나 유사한 원칙에 따라 다른 상업용 또는 오픈 소스 데이터 시각화 소프트웨어에서도 유사한 분석을 수행 할 수 있습니다. 결론적으로, 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하기 위해 최적화 된 프로토콜이 제시되었습니다. 이것은 독성학 테스트, 임상 및 진단 목적, 난소 충분성 및 기능의 조절자에 대한 게놈 전체 분석에 점점 더 요구될 고처리량 처리의 요구에 맞게 의도적으로 조정되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 보조금 (R01 HD093778에서 E.B-F로, T32 HD007065에서 R.B로)에 의해 지원되었습니다. 방사선 실험에 도움을 주신 Zachary Boucher에게 감사드립니다. 우리는 원고를 비판적으로 읽은 Mary Ann Handel에게 감사드립니다. 우리는 Sonia Erattupuzha와 Jackson Laboratory의 Microscopy Core Service가 본 간행물에 설명 된 현미경 검사에 대한 전문가의 도움과 잭슨 연구소의 과학 기기 서비스 (Scientific Instrument Services)의 Jarek Trapszo가 3D 인쇄 어댑터 슬라이드를 설계한 것에 대해 감사하게 생각합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchtop Incubator | Benchmark Scientific | H2200-H | 37 °C incubator |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | mouse inbred strain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D1435 | Hazardous material |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S6021 | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| FastWells Reagent Barriers | GraceBio | 664113 | Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | Dilution 1:1000 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | Dilution 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS Software | Oxford Instruments | Version 9.7.0 | Image visualization and analysis software |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight X3 Tunable Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| LASX software | Leica | Version 3.5.6 | Image acquisition software |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 | Multiphoton Microscope |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser | Laser for Multiphoton Imaging |
| Masterflex Pump Controller | SPW Industrial | Model: 7553-50 | Peristaltic pump for perfusion |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | Benchmark Scientific | B3D1020 | shaker/nutator for 37 °C incubator |
| Nikon Ergonomic SMZ1270 | Leica | SMZ1270 | stereomicroscope |
| Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous material |
| PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Dissolve in Milli-Q water |
| Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Rabbit anti-DDX4/MVH | Abcam | ab27591 | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-TRA98/GCNA | Abcam | ab82527 | Dilution 1:500 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Hazardous material |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | Hazardous material |
| Sucrose | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK Infusion Set | MYCO Medical | 7001-23 | needles for perfusion |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S/N XT640-W-0147 | low-power LED fluorescence lamp |
References
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