Whole Ovary Immunofluorescentie, Clearing en Multiphoton Microscopie voor kwantitatieve 3D-analyse van de zich ontwikkelende ovariële reserve bij muizen

Summary

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het in beeld brengen van hele eierstokken voor kwantitatieve en kwalitatieve analyses met behulp van whole-mount immunostaining, multifotonenmicroscopie en 3D-visualisatie en -analyse. Dit protocol biedt een hoge doorvoer, betrouwbare en herhaalbare verwerking die van toepassing is op toxicologie, klinische diagnostiek en genomische testen van de ovariële functie.

Abstract

Vrouwelijke vruchtbaarheid en reproductieve levensduur zijn afhankelijk van de kwaliteit en kwantiteit van de oöcytenreserve voor de eierstokken. Naar schatting 80% van de vrouwelijke geslachtscellen die meiotische profase I binnenkomen, worden geëlimineerd tijdens foetale oöcyattritie (FOA) en de eerste week van het postnatale leven. Drie belangrijke mechanismen reguleren het aantal eicellen dat tijdens de ontwikkeling overleeft en vestigen de ovariële reserve bij vrouwen die de puberteit ingaan. In de eerste golf van eicelverlies wordt 30-50% van de eicellen geëlimineerd tijdens vroege FOA, een fenomeen dat wordt toegeschreven aan hoge lange interspersed nucleaire element-1 (LINE-1) expressie. De tweede golf van oöcytenverlies is de eliminatie van eicellen met meiotische defecten door een meiotisch kwaliteitscontrolepunt. De derde golf van oöcytverlies treedt perinataal op tijdens primordiale follikelvorming wanneer sommige eicellen er niet in slagen follikels te vormen. Het blijft onduidelijk wat elk van deze drie golven van eicelverlies reguleert en hoe ze de ovariële reserve vormen bij muizen of mensen.

Immunofluorescentie en 3D-visualisatie hebben een nieuwe weg geopend om de ontwikkeling van eicellen in beeld te brengen en te analyseren in de context van de hele eierstok in plaats van in minder informatieve 2D-secties. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor immunostaining van de hele eierstokken en optische clearing, wat voorbereidingen oplevert voor beeldvorming met behulp van multifotonenmicroscopie en 3D-modellering met behulp van commercieel beschikbare software. Het laat zien hoe deze methode kan worden gebruikt om de dynamiek van oöcytenafbraak tijdens de oövarieuze ontwikkeling bij C57BL / 6J-muizen aan te tonen en het verlies van eicellen tijdens de drie golven van oöcytuitschakeling te kwantificeren. Dit protocol kan worden toegepast op prenatale en vroege postnatale eierstokken voor oöcytvisualisatie en kwantificering, evenals andere kwantitatieve benaderingen. Belangrijk is dat het protocol strategisch is ontwikkeld om plaats te bieden aan een hoge doorvoer, betrouwbare en herhaalbare verwerking die kan voldoen aan de behoeften in toxicologie, klinische diagnostiek en genomische testen van de ovariële functie.

Introduction

De meeste vrouwtjes van zoogdieren worden geboren met een eindig aantal meiotisch gearresteerde eicellen die zijn opgeslagen in primordiale follikels, die de ovariële reserve (OR)^1,2 vormen. De OK bepaalt de totale vrouwelijke reproductieve levensduur en gezondheid³. De OK neemt normaal gesproken in omvang af met het ouder worden en kan voortijdig worden uitgeput bij blootstelling aan bepaalde genotoxische middelen (bestraling / chemotherapie) en omgevingsstress (ondervoeding), wat leidt tot onvruchtbaarheid ^4,5,6. Idiopathische vrouwelijke onvruchtbaarheid kan vaak worden toegeschreven aan de genetische en fysiologische kwaliteit van eieren die zich ontwikkelen uit de OK en blijft slecht begrepen ^7,8. Omdat vrouwelijke follikelbegiftiging grotendeels vooraf wordt bepaald door de geboorte, is het essentieel om de regulerende mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij de oprichting en het onderhoud van de OK.

Bij muizen begint OR-vorming met de specificatie van primordiale geslachtscellen (PPC's) rond Embryonale dag (E) 7,5². De PPC's migreren naar de genitale richels, waar ze zich ongeveer E10,5⁹ zullen bevinden. De volgende uitgebreide proliferatie treedt op met onvolledige cytokinese, wat resulteert in de vorming van cysten die later in de ontwikkeling zullen worden afgebroken^10,11. Bij ongeveer E12,5 wordt gonadale seks bepaald en stopt de PGC-proliferatie in de eierstokken. Bij vrouwen komen PPC's, nu eicellen, in meiotische profase I (MPI) bij ongeveer E13,5^12,13. Eicellen vorderen door uitgebreide MPI en arrestatie in het dictyaatstadium rond het tijdstip van geboorte. Tijdens de eerste week na de geboorte wordt elke gearresteerde eicel omgeven door granulosacellen, waardoor een primordiale follikel wordt gevormd.

Het aantal primordiale follikels in de OK van een vrouw hangt af van hoeveel eicellen de golven van oöcytenverwijdering hebben overleefd die vóór en tijdens MPI-arrestatie optreden door apoptose, autofagie of necrose ^14,15. De eerste golf treedt op tijdens de foetale ontwikkeling en staat bekend als FOA. FOA is een evolutionair geconserveerd proces bij vrouwtjes (zoogdieren en niet-zoogdieren), waarbij naar schatting 50-80% van de eicellen wordt geëlimineerd, afhankelijk van de vrouwelijke soort 16,17,18,19. Bij muizen treedt FOA op tijdens E15.5 tot E18.5 en is toegeschreven aan de reactivering en expressie van retrotransposon LINE-1-sequenties die oöcytsterfte veroorzaken^20,21. De tweede golf van oöcytenexplosie vindt plaats via een meiotisch controlepunt dat eicellen elimineert met meiotische defecten zoals ongerepareerde DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's)^22,23. De volgende golf van oöcytuitschakeling vindt plaats tijdens cysteafbraak, culminerend in de vorming van primordiale follikels, die elk een enkele eicel 10,11,24,25 bevatten.

Bij muizen wordt de primordiale follikelreserve grotendeels vastgesteld door de puberteit, waarna deze afneemt naarmate primordiale follikels worden geactiveerd voor groei tijdens regelmatige voortplantingscycli. De OR-grootte varieert tussen individuele vrouwen en tussen verschillende genetische muizenstammen; toch is de genetische regulatie van OR-grootte niet goed begrepen 26,27,28,29. Genetische studies van OR-regulatie worden belemmerd door het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen om de golven van oöcyten eliminatie tijdens prenatale en postnatale ontwikkeling te bestuderen. Bij muizen zijn verschillende methoden voor het kwantificeren van eicellen ontwikkeld, met als meest voorkomende en meest gebruikte histomorfometrische evaluatie van histologische secties^30,31. In deze techniek worden eicellen geïdentificeerd op seriële secties met histologische vlekken, zoals hematoxyline en eosine (H & E) en periodieke zuur-Schiff (PAS) of fluorescerende markers. Deze techniek is betrouwbaar als alle omstandigheden constant blijven, inclusief sectiedikte, efficiënt herstel van alle secties in de eierstok en de telschema's van individuele laboratoria. De aantallen die door verschillende laboratoria worden gerapporteerd, verschillen echter vaak aanzienlijk en zijn dus niet gemakkelijk vergelijkbaar.

Bovendien kan, gezien genetische verschillen, het gebruik van verschillende muizenstammen ook het aantal eicellen beïnvloeden. Aanvullende computationele benaderingen zijn ontwikkeld voor histomorfometrische evaluatie en omvatten de geautomatiseerde detectie van eicellen met behulp van de fractionatorbenadering, automatisch tellen met behulp van computationele algoritmen en 3D-reconstructie van histologische beelden om meerdere tellingen van dezelfde eicel te voorkomen 31,32,33,34,35,36 . Zelfs met deze verbeteringen toegevoegd aan histomorfometrische evaluatie, is de techniek relatief arbeidsintensief, met name voor grootschalige en high-throughput studies. De verzamelde gegevens zijn mogelijk niet reproduceerbaar en vergelijkbaar tussen studies vanwege verschillen in telschema's, computeralgoritmen en gebruikte software.

Onlangs, versneld door de ontwikkeling van nieuwe medium-resolutie multifoton en lichtplaatmicroscopie en optische weefselverwijderingsmethoden, worden 3D-modellerings- en analysetechnieken voor intacte eierstokken de voorkeursmethode om het aantal eicellen efficiënt te kwantificeren en eiwitlokalisatie en -dynamiek te bestuderen^37,38. Deze 3D-methoden zijn meestal voordelig in vergelijking met histologische methoden, omdat weefsels en organen beter worden bewaard en intact worden gehouden. Bovendien bieden 3D-analyse en modellering aanvullende inzichten in functie en interacties binnen en tussen celniches of substructuren binnen het orgaan die kunnen worden gemist in 2D-analyse.

3D-analyse van hele organen vereist optimalisatie van fixatie-, immunostaining- en optische clearingprotocollen voor individuele organen, zoals eierstokken, zonder weefselvervorming of schade. Aanvullende optimalisatie van monstermontage voor beeldvorming is vereist voor microscopie met hoge resolutie en kan afhankelijk zijn van het beschikbare beeldvormingsplatform. Ten slotte genereert beeldvorming van de hele intacte eierstok een grote hoeveelheid gegevens voor daaropvolgende computationele analyses. Daarom is er behoefte aan gestandaardiseerde 3D-methoden voor het tellen van eicellen voor vergelijkende studies en in verschillende ontwikkelingsstadia.

Dit protocol maakt gebruik van standaard immunostaining en eerder gerapporteerde clearingprotocollen, gericht op een eenvoudige, gebruiksvriendelijke en high-throughput aanpak 38,39,40,41. Het protocol is geoptimaliseerd om grote aantallen prenatale en postnatale eierstokken te analyseren tot postnatale dag 28 (P28) en verschillende groottes van eierstokken met verschillende genetische achtergronden van muizen. De immunostaining stappen zijn vergelijkbaar voor alle stadia; de clearingprotocollen verschillen echter voor puberale eierstokken vanwege hun grotere omvang, ScaleS4(0) en CUBIC voor kleine en grote eierstokken, respectievelijk^40,41. Verder wordt perfusie van het hele lichaam uitgevoerd in P28-muizen vóór fixatie om autofluorescentie uit bloedcellen te voorkomen. Een multifotonenmicroscoop werd gebouwd op het Leica DIVE/4Tune-platform als alternatief voor lichtplaatmicroscopie om beelden te verkrijgen, en IMARIS 3D Visualisatie- en Analysesoftware met verschillende analytische hulpmiddelen werd gekozen voor dit protocol. Dit protocol is eenvoudig te volgen en minder hands-on, dus tijdbesparend. Bovendien is de kwantificering van eicellen relatief snel, afhankelijk van de grootte van de eierstok en de rangschikking van de eicellen.

Protocol

Alle gebruikte muizen waren van de genetische stam C57BL/6J (zie de Tabel met Materialen). Deze stam is volledig gesequenced en is standaard voor veel studies naar de structuur en functie van de eierstokken. Muizen werden gehuisvest volgens de NIH-richtlijnen en de uitgevoerde procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van The Jackson Laboratory. De in dit protocol gebruikte reagentia en samenstellingen zijn respectievelijk vermeld in de tabel met materialen en tabel 1.

1. Bereiding van reagentia

1. Fixatief: Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS. Voeg bijvoorbeeld voor 24 monsters (0,5 ml / monster = 12 ml totaal volume) 3 ml van 16% PFA-elektronenmicroscopie-kwaliteit toe aan 9 ml 1x PBS.
2. Buffer voor permeabilisatie
   1. Meet polyvinylalcohol (PVA) in een plastic bekerglas van 250 ml met 1x PBS de dag voordat de permeabilisatiebuffer nodig is. Roer de oplossing een nacht om PVA volledig te laten oplossen.
   2. Voeg natriumboorhydride toe aan de opgeloste PVA en laat het mengsel ongeveer 3-5 minuten homogeniseren. Verwacht dat de oplossing schuimt.
   3. Voeg Triton X-100 toe aan de oplossing en gebruik de buffer zodra de Triton X-100 is opgelost.
      OPMERKING: PVA duurt lang om op te lossen (ten minste 3 uur) en de penetratie van het antilichaam hangt af van hoe goed het oplost. Voor grotere eierstokken is het cruciaal om PVA volledig op te lossen.
3. Buffer blokkeren
   1. Meet runderserumalbumine (BSA) in een bekerglas met 1x PBS. Roer de oplossing totdat het BSA is opgelost.
   2. Voeg glycine, Triton X-100, Penicilline-streptomycine en natriumazide toe. Roer tot de oplossing homogeniseert. Breng de buffer over in een fles en bewaar bij 4 °C. Voeg voor gebruik een normaal geitenserum toe.
4. Wasbuffer: Meet de PVA in een bekerglas met 1x PBS. Roer de oplossing een nacht om de PVA te laten oplossen. Voeg Triton X-100 en natriumazide toe. Zodra de buffer is gemengd, bewaart u deze bij 4 °C.
5. SchaalS4(0)-oplossing (pH 8,1): Los D-sorbitol in PBS op in een bekerglas met roeren bij ≤100 °C. Voeg ureum toe aan de oplossing en zodra het ureum is opgelost, zet u het vuur uit en laat u de oplossing roeren totdat deze volledig is opgelost. Voeg glycerol en dimethylsulfoxide toe en roer tot de oplossing homogeniseert. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur in het donker.
   OPMERKING: ScaleS4(0)-oplossing moet vers worden gemaakt op de eerste dag van het opruimen van de eierstokken.
6. ScaleCUBIC-1 oplossing
   1. Los ureum op in een bekerglas dat PBS bevat onder roeren bij een temperatuur ≤100 °C. Meet N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethyleendiamine in een afzonderlijk bekerglas, voeg vervolgens het opgeloste ureum toe en roer bij een temperatuur van ≤100 °C totdat de reagentia volledig zijn opgelost. Zodra alle reagentia in oplossing zijn, schakelt u de verwarming uit en koelt u af bij kamertemperatuur. Bewaren in het donker.
   2. Ontgas de oplossing door deze over te brengen in een filtreerkolf. Bevestig de kolf aan een vacuüm met slang, dek de kolf af en zet het vacuüm aan totdat de belletjes in de oplossing verdwijnen. Gebruik de oplossing na deze ontgassing.
      OPMERKING: De oplossing kan in het donker worden bewaard om maximaal een maand te gebruiken.
7. Sucrose-oplossing: Los sucrose op in 1x PBS; ontgas de oplossing vervolgens voor gebruik.
   OPMERKING: Bereid de oplossing voor gebruik vers.
8. ScaleCUBIC-2 oplossing
   1. Los sucrose op in een bekerglas dat PBS bevat, onder roeren bij een temperatuur ≤100 °C. Voeg ureum toe en roer bij een temperatuur van ≤100 °C tot het ureum is opgelost. Zet het vuur uit.
   2. Voeg triethanolamine en Triton X-100 toe. Roer tot de oplossing homogeniseert. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar in het donker. Ontgas de oplossing voor gebruik.
      OPMERKING: De oplossing kan in het donker worden bewaard om maximaal een maand te gebruiken.

2. Dissectie en fixatie van prenatale eierstokken (figuur 1A)

1. Paren volwassen vrouwtjes (≥8 weken) en mannetjes volgens het goedgekeurde institutionele protocol. Controleer elke ochtend op vaginale pluggen.
   OPMERKING: De ochtend van een vaginale plug wordt aangeduid als 0,5 dagen post coitum (d.p.c) of E0.5.
2. Bereid op de dag van dissectie 4% paraformaldehyde (PFA) en aliquot ~ 0,5 ml in microcentrifugebuizen, geplaatst aan de bankzijde (~ 4 per zwangere vrouw).
   OPMERKING: PFA is een gevaarlijke stof en moet onder een chemische kap worden behandeld.
3. Bereid drie platen van 100 mm met ~ 10 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor elke zwangere vrouw (voor het oogsten van de baarmoeder, voor het ontleden van mesonephros-ovariumcomplex en het isoleren van eierstokken).
4. Euthanaseer zwangere vrouwtjes die embryo's van het gewenste ontwikkelingsstadium dragen en ga over tot dissectie. Euthanaseer niet meer dan 1-2 vrouwtjes tegelijk. Gebruik een goedgekeurd protocol voor de euthanasie van zwangere muizen (bijv. BLOOTSTELLING AAN CO₂ gevolgd door cervicale dislocatie).
5. Zodra een vrouw is geëuthanaseerd, spuit de buik met 70% ethanol. Til met een tang de buikhuid op en gebruik een schaar om een V-vormige incisie door de buik en lichaamswand te maken. Snijd langs de twee zijden van de incisie en pel de huid terug om de inwendige organen en foetussen in de baarmoeder bloot te leggen.
6. Knip en scheid met een tang en schaar de baarmoeder met de foetussen van het buikvet en de eierstokslagaders en aderen. Verwijder de baarmoeder en plaats deze in een 100 mm plaat met 1x PBS. Laat de foetussen los in PBS door de baarmoederwand door te snijden en de dooierzak te doorboren. Knip de navelstreng door.
   OPMERKING: Voor foetussen jonger dan 15 dagen in de zwangerschap zorgt euthanasie van de moeder en verwijdering uit de baarmoeder voor een snelle dood van de foetus. Foetussen ouder dan 15 dagen in de zwangerschap tot de geboorte moeten worden geëuthanaseerd door onthoofding.
7. Breng een foetus over in een nieuw bord met verse 1x PBS. Om een E15.5-foetus te onthoofden, speldt u de twee achterpoten voorzichtig uit elkaar op de plaat met een tang om de foetus te immobiliseren. Gebruik een tweede tang die in de dominante hand wordt gehouden, houd de nek tussen de tangpennen en knijp om het hoofd van de foetus af te snijden, of gebruik een schaar om de nek te knippen.
8. Snijd met de dominante handtang onder de voorpoten en trek het bovenlichaam voorzichtig weg. Breng vervolgens een eindpunt van de dominante handtang verticaal in de peritoneale holte in de opening van het abdominale gebied, terwijl het andere eindpunt van de tang buiten blijft. Sluit de tang, knijp in de lichaamswand om deze te snijden en stel de inwendige organen bloot.
9. Verwijder met dezelfde tang voorzichtig de organen, inclusief de darmen en de lever, totdat de nier en de voortplantingsorganen zichtbaar worden. Bepaal het geslacht van de foetus: bij E15.5 hebben de eierstokken een langwerpige worstachtige vorm terwijl de teelballen ovaal zijn.
   OPMERKING: In eerdere stadia kan genotypering nodig zijn om het geslacht te bepalen.
10. Houd met behulp van een tang de vrouwelijke foetus naar beneden en gebruik de andere tang om elk mesonephros-ovariumcomplex vast te pakken en voorzichtig te scheiden van de nieren en de Mülleriaanse kanalen. Plaats de eierstokken in een nieuwe plaat met 1x PBS, laat de mesonephros zitten, maar verwijder de omliggende weefsels om ervoor te zorgen dat de eierstokken worden blootgesteld. Plaats beide eierstokken in ~0,5 ml 4% PFA in microcentrifugebuizen en fixeer 's nachts op 4 °C. Vervang PFA de volgende dag door 70% ethanol.
11. Voor de dissectie en fixatie van E18.5-eierstokken scheidt u de foetussen van de baarmoeder zoals hierboven beschreven en volgt u vervolgens het protocol voor prepuberale pups beschreven in rubriek 3 (figuur 1B).

3. Dissectie en fixatie van prepuberale eierstokken (figuur 1B)

1. Bereid 4% PFA en aliquot ~ 0,5 ml in buizen van 1,5 ml en plaats ze aan de bankzijde (~ één buis per pup). Bereid 35 mm borden met 1x PBS (~ één per pup). Euthanaseer de pups met behulp van het goedgekeurde institutionele protocol.
   OPMERKING: Onthoofding is de voorkeursmethode voor euthanasie voor muizen van 8 dagen of jonger. Neonatale muizen kunnen worden onthoofd met behulp van een 3-4 "ontleedschaar of een 5-7" Mayo-schaar.
2. Bepaal het geslacht van pups door de anogenitale afstand te meten, die groter is bij mannen dan bij vrouwtjes. Gebruik een scherpe onthoofdingsschaar om vrouwelijke pups te onthoofden. Plaats het lichaam, open gesneden met de zijkant naar beneden, op een papieren handdoek om het bloed af te voeren (~ 5-10 s).
3. Zet de pup vast op zijn rug door een speld in het voetkussen van elke voet te plaatsen. Spuit de buik in met 70% ethanol. Gebruik een tang om de huid van de pup weg te houden van het lichaam en gebruik een schaar om een kleine V-vormige incisie in de huid van de onderbuik te maken.
4. Steek de schaar in de incisie onder de huid en knip langs beide zijden van de buik. Gebruik de tang om de huid voorzichtig af te pellen en de onderbuik te onthullen. Beweeg de darm voorzichtig omhoog en lokaliseer de baarmoederhoorns naast de blaas. Volg elke baarmoederhoorn naar de nier en lokaliseer de eierstok met het omliggende vetweefsel onder elke nier.
5. Om de eierstokken te ontleden, houdt u de baarmoederhoorn onder de eierstok en eileider met één tang (tang A, figuur 1B) en tilt u deze voorzichtig weg van het lichaam. Gebruik een andere tang (tang B) om voorzichtig onder het eerste paar tangen te grijpen, zodat de eierstok en eileider in het vetkussen zichtbaar zijn boven het tweede paar tangen. Knip vervolgens onder het tweede paar tangen met een schaar of trek voorzichtig om de eierstokken en aangehechte weefsels los te maken.
6. Plaats de geïsoleerde organen in een plaat met 1x PBS. Snijd het extra vetweefsel, de eileider en de baarmoederhoorn weg om de eierstok schoon te maken en te isoleren. Open de slijmbeurs rond de eierstok en stel de hele eierstok bloot.
7. Trim het slijmbeursmembraan zonder de eierstok te beschadigen en laat weefsel rond het hilum (ligamentachtige structuur tussen de eierstok en het voortplantingskanaal) om de eierstok te hanteren, zoals weergegeven in figuur 1B, P5. Zodra de eierstokken zijn bijgesneden, plaatst u ze in 4% PFA en fixeert u de eierstokken 's nachts op 4 °C. Vervang de volgende dag 4% PFA door 70% ethanol en bewaar de eierstokken bij 4 °C tot de stap van het immunostainingprotocol.

4. Perfusie, dissectie en fixatie van de puberale eierstokken (figuur 1C)

1. Perfuseer muizen volgens institutioneel goedgekeurde protocollen met de muis onder diepe anesthesie in een chemische zuurkast. Bereid de perfusieapparatuur en reagentia voor. Zie het gedetailleerde protocol op ⁴².
   OPMERKING: Perfusie is een terminale euthanasieprocedure die het bloed in het hele vasculaire systeem vervangt door een weefselfixatief.
2. Weeg een puberale vrouwelijke muis (P28) en noteer het gewicht van de muis (meestal tussen 13 g en 15 g). Bereken de hoeveelheid van het goedgekeurde anesthesiemiddel dat moet worden gebruikt.
   OPMERKING: Hier werd 0,35 ml tribromoethanol per 10 g lichaamsgewicht gebruikt in dit protocol.
3. Gebruik een wegwerpspuit van 10 ml met een naald van 20 G om de spuit te vullen met het goedgekeurde verdovingsmiddel. Vervang de naald van 20 G door een naald van 26 G x 3/8.
4. Houd de muis voorzichtig in bedwang door de ruggenhalshuid met één hand te krabben. Draai de muis om om de buik bloot te leggen. Injecteer de eerder berekende hoeveelheid verdoving in de peritoneale holte. Plaats de muis in een container met een deksel totdat de anesthesie in werking treedt (d.w.z. de muis beweegt niet meer).
5. Zodra de muis stopt met bewegen, knijp je voorzichtig in zijn voeten om te controleren of er geen reactie is en zorg je ervoor dat de muis volledig is verdoofd voordat de perfusie wordt gestart. Plaats en bevestig de muis op zijn rug door alle vier de poten voorzichtig door de voetzolen op een bord te pinnen. Zorg ervoor dat de poten in een ontspannen positie zijn vastgepind, niet overbelast.
6. Spuit de muis met 70% ethanol van de buik naar het borstgebied. Gebruik een tang om de buikhuid voorzichtig te knijpen en op te tillen en gebruik vervolgens een schaar om een kleine V-vormige snede door de huid en lichaamswand te maken.
7. Verwijder de huidflap uit de lichaamsholte en steek de schaar onder de huid en lichaamswand. Snijd de huid en de lichaamswand recht omhoog naar het hoofd naar de rand van de thoracale holte bij het borstbeen.
8. Open de thoracale holte door de ribben aan beide zijden van het borstbeen voorzichtig door te snijden tot net onder het schouderblad. Zorg ervoor dat u de longen onder de ribbenkast niet doorboort. Pak de huid/ribflappen vast met een tang en speld ze vast om de inwendige organen bloot te leggen.
9. Trim voorzichtig alle weefsels, zoals de thymus, die de vrije toegang tot het hart kunnen belemmeren. Stel alle organen bloot, inclusief het maagdarmkanaal, om visuele bevestiging mogelijk te maken dat het hele lichaam is doordrenkt, inclusief de onderbuik.
10. Gebruik een dissectieschaar om het rechteratrium van het hart te knippen en bloed uit het systeem af te geven. Houd het hart voorzichtig vast met een tang en steek een perfusienaald (aangesloten op een peristaltische pompregelaar) in de linker ventrikel.
11. Pomp ~ 10 ml PBS, met zachte maar constante druk, totdat weefsels zoals de lever, nieren en voortplantingsorganen (figuur 1E, F) van roze naar wit veranderen. Vervang vervolgens de PBS door vers gemaakte 1% PFA en ga door met de perfusie met ongeveer 10 ml PFA of totdat er spiertrekkingen optreden in het onderlichaam van de muis (bijv. staart).
    OPMERKING: Deze fixatietremoren duiden op succesvolle perfusie.
12. Zodra de perfusie is voltooid, lokaliseer je het vetkussen met de eierstokken onder de nier en ontleed je voorzichtig het hele voortplantingskanaal, inclusief het vetkussen, de eierstokken en de baarmoederhoorns, en plaats je het kanaal in een injectieflacon met 4% PFA. Zet de eierstokken 's nachts op kamertemperatuur (~ 16-24 uur). Vervang vervolgens de 4% PFA door 70% ethanol gedurende ten minste één dag en trim de eierstokken (figuur 1E, F), zoals hierboven beschreven, voordat u met het immunostainingprotocol begint.

5. Immunostaining van de eierstokken in de hele houder (figuur 2A)

OPMERKING: Oefen steriele technieken tijdens het immunostainingprotocol, vooral bij het veranderen van buffers, om besmetting tijdens langere incubatieperioden te voorkomen.

1. Voer alle immunostainingstappen uit in een plaat met 24 putten, zoals weergegeven in figuur 2A. Pas reagensvolumes aan voor andere indelingen. Verander buffers zorgvuldig om te voorkomen dat kleine prenatale en prepuberale eierstokken verloren gaan.
   OPMERKING: Andere formaten, zoals 48- en 96-putplaten, kunnen worden gebruikt, maar de diepere putten en smallere openingen maken het moeilijk om buffers op te zuigen zonder eierstokken te verliezen of te beschadigen.
2. Dag 1
   1. Pipetteer 1 ml PBS/put in het aantal benodigde putten in een schone plaat met 24 putten. Snijd de punt van een pipetpunt van 200 μL af om een brede opening te maken en gebruik deze om prepuberale eierstokken voorzichtig over te brengen van 1,5 ml buizen met 70% ethanol in de putten. Gebruik voor puberale eierstokken een pipetpunt van 1000 μL met de punt afgesneden voor de overdracht.
      OPMERKING: De bredere opening van de punt voorkomt weefselschade tijdens de overdracht.
   2. Zodra alle monsters in de putten zijn overgebracht, gebruikt u een nieuwe tip om de PBS op te zuigen en te vervangen door verse 0,8 ml PBS / put. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur op een shaker bij ~ 100-150 rpm 's nachts. Begin met de voorbereiding van de permeabilisatiebuffer (zie tabel 1 en rubriek 1).
      OPMERKING: De nieuwe tip voorkomt dat eierstokken aan de punt blijven plakken en de PBS-incubatiestap zorgt ervoor dat de eierstokken in PBS in evenwicht kunnen komen en opnieuw kunnen hydrateren voordat ze worden gekleurd.
3. Dag 2
   1. Voltooi de voorbereiding van de permeabilisatiebuffer. Zuig PBS uit de putten en vervang deze door 0,8 ml van de permeabilisatiebuffer per put. Plaats de platen terug op de shaker en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
   2. Na 4 uur incubatie, zuig de permeabilisatiebuffer volledig op en vervang deze door 0,5 ml blokkerende buffer (zie tabel 1 en rubriek 1). Sluit de plaat af met parafilm om verdamping te voorkomen, plaats deze in een goed afgedekte container op een shaker en incubeer de monsters met zachte agitatie in de blokkerende buffer gedurende een nacht (16-24 uur) bij kamertemperatuur.
4. Dag 3
   1. Bereid de primaire antilichamen voor door verdunning in de blokkerende buffer. Gebruik voor het visualiseren van eicellen eicelmarkers, bijvoorbeeld rat anti-kiemcelkernzuurzuur peptidase (GCNA)/TRA98 voor zowel prenatale als prepuberale eierstokken en konijn anti-DEAD-box helicase 4 (DDX4)/muis vasa homoloog (MVH) voor zowel prepuberale als puberale eierstokken. Gebruik voor het kwantificeren van LINE-1 ORF1p-expressie in prenatale eierstokken konijn anti-LINE-1 ORF1p of een ander beschikbaar antilichaam.
      OPMERKING: GCNA/TRA98-signaal is niet detecteerbaar in de puberale eierstokken.
   2. Zuig de blokkerende buffer uit de monsters op en vervang deze door 0,5 ml verdunde primaire antilichamen. Sluit de plaat af met parafilm om verdamping te voorkomen. Plaats de platen in een container met een deksel om te voorkomen dat monsters tijdens de incubatie opdrogen. Plaats de container op de shaker en incubeer de monsters gedurende 3-4 dagen bij kamertemperatuur.
5. Dag 7
   1. Verwijder voorzichtig de parafilm van de platen en zuig het primaire antilichaammengsel uit de monsters. Bewaar de primaire antilichaammengsels bij 4 °C (voor maximaal een maand of drie toepassingen) en hergebruik ze later door ze aan te vullen met verse antilichamen (bijv. 2 μL vers antilichaam aliquot per 5 ml van het eerder gebruikte mengsel).
   2. Voeg 1 ml wasbuffer (zie tabel 1 en rubriek 1) per putje toe aan de monsters en laat de platen voorzichtig enkele seconden schommelen om de resterende antilichamen weg te spoelen. Aspiraleer en vervang de wasbuffer voorzichtig door 0,8 ml verse wasbuffer en schud de borden een nacht op kamertemperatuur.
6. Dag 8
   1. Zuig de nachtelijke wasbuffer aan, vervang deze door 0,8 ml verse wasbuffer en schud gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap met verse wasbuffer nog eens 2 uur.
   2. Vervang na de laatste wasbeurt de wasbuffer door 0,5 ml secundaire antilichaammengsels verdund in een blokkerende buffer, bijvoorbeeld geiten-anti-rat Alexa Fluor 555 en geiten-anti-konijn Alexa Fluor 647 bij 1:1.000 verdunning. Bereid het secundaire antilichaammengsel vers voor elk immunostaining-experiment.
   3. Sluit de plaat af met parafilm om verdamping tijdens de incubatie te voorkomen. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur in het donker of in platen bedekt met aluminiumfolie met zachte agitatie gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Deze stap en alle volgende stappen vinden plaats in het donker of met aluminiumfoliefolie.
7. Dag 11
   1. Zuig het secundaire antilichaammengsel op en voer een eerste wasbeurt uit met 1 ml wasbuffer. Schommel de platen voorzichtig een paar seconden om de resterende secundaire antilichamen weg te spoelen.
   2. Zuig de wasbuffer aan, vervang deze door 0,8 ml verse wasbuffer en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 uur met schudden, beschermd tegen licht. Herhaal de wasstap 2 keer voor een totaal van 3 wasbeurten. Ga na de derde wasbeurt verder met de opruimstap (rubriek 6).

6. Opruimen van immunostained whole-mount eierstokken (figuur 2A).

OPMERKING: Voer alle opruimstappen in het donker uit door de platen in aluminiumfolie te wikkelen of in ondoorzichtige containers te plaatsen. De clearingstappen verschillen voor prepuberale en puberale eierstokken.

1. Dag 11 [Prenatale en prepuberale eierstokken worden geklaard in een eenstapsprotocol]
   1. Zuig na de laatste wasbeurt de wasbuffer aan en vervang deze door 0,8 ml vers gemaakte ScaleS4(0)-oplossing (zie tabel 1 en rubriek 1). Sluit de plaat af met parafilm en incubeer de monsters in het donker met schudden bij kamertemperatuur gedurende drie tot vier dagen voordat u de beeldvorming afbeeldt.
   2. Vervang de ScaleS4(0)-oplossing indien nodig dagelijks door een nieuwe oplossing; Wees voorzichtig bij het vervangen van de oplossingen, omdat vrijgemaakte eierstokken transparant worden en moeilijk te zien zijn. Ga na het wissen verder met het instellen van het monster en het afbeelden (rubriek 7).
      OPMERKING: Veranderende oplossingen hebben de beeldkwaliteit niet significant verbeterd. Dagelijkse veranderingen verhogen de kans op het verliezen van kleine en meestal transparante monsters.
2. Dag 11-15 [Pubertale eierstokken worden geklaard in een protocol in twee stappen]
   1. Na de laatste immunostainingwassing zuigt u de wasbuffer aan en vervangt u deze door 0,8 ml ScaleCUBIC-1 (zie tabel 1 en rubriek 1). Sluit de plaat af met parafilm en schud de monsters voorzichtig bij 37 °C gedurende 3 dagen in het donker. Vervang de ScaleCUBIC-1 oplossing dagelijks door de verse oplossing.
   2. Was de monsters op dag 15 3 keer gedurende 10 minuten telkens in 0,8 ml PBS bij kamertemperatuur met zacht schudden. Vervang de PBS door 0,8 ml ontgaste 20% sucrose, vers bereid met PBS. Schud zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   3. Vervang de 20% sucrose-oplossing door 0,8 ml ScaleCUBIC-2-oplossing (zie tabel 1 en sectie 1), sluit de plaat af met parafilm en schud voorzichtig bij kamertemperatuur met dagelijkse wisselingen van de ScaleCUBIC-2-oplossing. Verwijder gedurende 4-5 dagen en ga verder met het beeld. Wees voorzichtig bij het uitwisselen van oplossingen om monsterverlies te voorkomen, omdat gewiste eierstokken transparant en moeilijk te zien zijn. Ga verder met het instellen van monsters en beeldvorming (sectie 7).

7. Monsteropstelling en beeldvorming met een multifotonenmicroscoop

OPMERKING: Alle hieronder beschreven stappen werden uitgevoerd met een Leica DIVE/4TUNE/FALCON met twee instelbare modus-vergrendelde Ti:Sapphire multifoton lasers met een pulsduur van 120 fs met een multi-immersie 16x/NA0.6 objectief (immersievloeistof = glycerol) met een maximale werkafstand van 2,2 mm. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de software voor het verkrijgen van afbeeldingen. Aanvullende tabel S1 en aanvullende figuur S1 tonen de instellingen die voor dit protocol worden gebruikt. Raadpleeg voor andere beeldvormingsplatforms de microscopiekern of volg de specificaties/aanbevelingen van de fabrikant.

1. Voorbeeld van een installatie
   1. Bereid de installatie voor voor het monteren van de monsters. Gebruik bijvoorbeeld een kleverige en flexibele siliconen pakking om een kleefput te maken. Plaats de lijm goed op een 25 mm x 25 mm nr. 1,5 microdeksel om een put te creëren waarin de eierstokken worden geplaatst (figuur 2B).
      OPMERKING: Een pakking van 1 mm dikte is geschikt voor alle maten eierstokken. Deze opstelling wordt aanbevolen omdat het ovariumbewegingen tijdens beeldvorming elimineert, wat kan optreden wanneer eierstokken in mountant in een schotel met glazen bodem worden geplaatst.
   2. Gebruik een pipetpunt met afgesneden punt (20 μL voor prenataal en prepuberaal), breng de eierstokken met ~ 5-10 μL ScaleS4(0) -oplossing over in het midden van de lijm, zoals weergegeven in figuur 2B. Gebruik voor puberale eierstokken een pipetpunt van 200 μL met de punt ver genoeg afgesneden om de eierstokken over te brengen. Voeg ~15-20 μL van de ScaleCUBIC-2 Solution toe aan het midden van de lijmput.
      OPMERKING: Te veel oplossing kan leiden tot lekkage op het microscoopstadium en te weinig oplossing zal resulteren in een slechte beeldkwaliteit. Gebruik een dissectiemicroscoop om monsters over te brengen als vrijgemaakte eierstokken transparant worden en moeilijk te zien zijn.
   3. Zodra de eierstokken met een druppel opruimoplossing in individuele putten zijn overgebracht, plaatst u voorzichtig een ander dekglas op de lijmput, drukt u om een afdichting te maken en houdt u de monsters op hun plaats in een kleine pool van opruimoplossing ingeklemd tussen de twee dekzeilen (figuur 2B). Voor beeldvorming plaatst u de coverslip "sandwich" in een 3D-geprinte microscoopadapterglaasje (bijv.,⁴³ ).
      OPMERKING: Lijmputten zijn herbruikbaar na het deconstrueren van de "sandwich" en het wassen met water.
2. Beeldvorming (aanvullende tabel S1 en aanvullende figuur S1)
   1. Schakel de microscoop en software in volgens de richtlijnen van de microscopiekern of de fabrikant. Plaats de gemonteerde monsters op het microscooppodium en kijk door het oculair om het monster te lokaliseren dat wordt verlicht met een energiezuinige LED-fluorescentielamp.
   2. Zodra de monsters zijn gelokaliseerd, schakelt u de laser (s) in en wijst u elke detector toe aan een specifieke Alexa Fluor-kleurstof / marker. Houd voor meerdere lasers rekening met sequentiële beeldacquisitie. Verkrijg de hele stack voordat u van laser wisselt.
      OPMERKING: Voor dit protocol werd één laser gebruikt voor de beeldacquisitie van zowel 555 nm als 647 nm fluoroforen.
   3. Stel de parameters voor beeldacquisitie in volgens de specificaties van de microscopiekern of de fabrikant. Gebruik bidirectionele beeldacquisitie, indien beschikbaar, om de scantijd te verkorten en de efficiëntie te verbeteren. Pas andere instellingen aan, waaronder het lijngemiddelde (1), het framegemiddelde (1) en de frameaccumulatie (1).
      OPMERKING: Bidirectionele beeldacquisitie stelt lasers in staat om in beide richtingen te scannen terwijl ze op de X-as bewegen.
   4. Stel de Z-Stack in door het begin (onderkant van het monster/de onderste glasafdekking) en de eindpositie (bovenkant van het monster/de bovenste glasafdekking) te identificeren. Selecteer een Z-stapgrootte van 2 μm voor prepuberale eierstokken en 5 μm voor puberale eierstokken.
   5. Activeer de Z-compensatiefunctie en activeer binnen deze functie de excitatieversterking. Stel de Z-compensatie in voor de onderkant en bovenkant van het monster door een laserintensiteit te selecteren voor zowel de onderste (lage intensiteit) als de bovenste stapel (hoge intensiteit). Zie aanvullende figuur S1, Lineaire Z-compensatie, waarbij de excitatieversterkingsdoos is geselecteerd en de laserintensiteit voor de onderkant (0) en bovenkant (347,75) is ingesteld op respectievelijk 10 en 12.
   6. Gebruik de tegelmodus voor grotere monsters die niet in één gezichtsveld kunnen worden vastgelegd. Activeer de afbeeldingsnavigator en geef het aantal tegels aan dat nodig is om het volledige monster vast te leggen met behulp van het rechthoekige markeergereedschap.
   7. Start de beeldacquisitie. Voor afbeeldingen met meerdere tegels begint u met het verwerven van afbeeldingen met de navigator om alle tegels vast te leggen. Zodra de afbeeldingsacquisitie is voltooid, slaat u eerst alle afbeeldingen op en als er meerdere tegels zijn verkregen, voert u vervolgens het gereedschap mozaïek samenvoegen uit om de tegels samen te voegen tot één afbeelding.
   8. Sla de samengevoegde bestanden op in een aparte projectmap om het werken met de gigabytegrote afbeeldingen te vergemakkelijken. Breng de bestanden over voor beeldverwerking met 3D-beeldvisualisatie- en analysesoftware. Figuur 3 toont representatieve beelden genomen in verschillende stadia met twee markers (GCNA en DDX4).

8. Beeldverwerking

OPMERKING: Alle hieronder beschreven stappen zijn ontwikkeld en uitgevoerd met behulp van IMARIS 3D-beeldvisualisatie- en analysesoftware.

1. Importeer de afbeelding(en) in de 3D-beeldvisualisatie- en analysesoftware en converteer indien nodig de bestanden van de oorspronkelijke indeling (bijv. .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) naar de .ims-indeling.
2. Verwerk de afbeeldingen indien nodig met het gaussiaanse filter om pixelvorming te verminderen (afbeelding 4A). Gebruik de 3D-weergavefunctie om de afbeelding te positioneren en de frameoptie uit te schakelen (om het frame te verwijderen).
   OPMERKING: Er zijn andere optionele filters, die ook kunnen worden gebruikt om pixelvorming te verminderen en de achtergrondintensiteit te verminderen.
3. Vergroot de afbeelding tot een specifieke schaal en gebruik de functie Momentopname. Stel de voorkeuren als volgt in: selecteer 300 DPI, opslaan als TIFF-afbeelding en Transparante achtergrond. Maak een momentopname van de afbeelding en sla deze op. Figuur 3 toont volledig geassembleerde beelden.

9. Kwantificering van eicellen

OPMERKING: Immunofluorescentie van de hele eierstokken en visualisatie en analyse van 3D-beelden kunnen worden gebruikt voor de schatting van het aantal eicellen in hele eierstokken (figuur 3 en figuur 4) met behulp van de Spot-functie. Het GCNA-signaal kan worden gebruikt om eicellen in prenatale en prepuberale eierstokken te kwantificeren, zoals weergegeven in figuur 4 (P5). Gebruik in puberale eierstokken het DDX4-signaal om twee eicelpopulaties te kwantificeren in niet-groeiende follikels ("ringachtige" structuur, gesloten pijl) en groeiende follikels (grote structuren, open pijl, figuur 4, P28).

1. Bepaal de grootte van de eicellen die als parameter zullen worden gebruikt om eicellen te kwantificeren met de functie Vlekken in stap 9.2.
   1. Open de afbeelding en selecteer de optie Segmenteren om de Z-stackafbeelding te openen.
   2. Selecteer de optie Lijn in het deelvenster Meten en meet de afstand door een lijn te trekken van de ene rand van een eicel/marker naar de andere rand op het breedste punt om de XY-diameter van het te tellen oöcyttype/-grootte te bepalen. Beweeg door de stapel en verkrijg het bereik van diameters voor meerdere eicellen van hetzelfde type. Gebruik de kortste lengte als het grootteselectiecriterium voor het aantal eicellen.
2. Spots-functie : Selecteer de optie 3D-weergave en activeer de functie Nieuwe spots toevoegen in het deelvenster Scène om het deelvenster Algoritme te openen. Deselecteer alle algoritme-instellingen omdat het grootteselectiefilter met de eicelgrootte verkregen in stap 9.1 zal worden gebruikt.
   1. Klik op de enkele pijl vooruit om naar het bronkanaal te gaan. Selecteer het kanaal met de gewenste markering en typ de geschatte XY-diameter die is verkregen in stap 9.1. Gebruik bijvoorbeeld een geschatte XY-diameter van 7 μm voor prenatale eicellen en 11 μm voor P5-eicellen (GCNA = groen signaal; Figuur 3 en figuur 4A).
   2. Gebruik 30 μm voor het DDX4-signaal om het aantal eicellen in groeiende follikels in P5-eierstokken te schatten (DDX4 = magenta-signaal; Figuur 3 en figuur 4A). Gebruik voor puberale eierstokken het DDX4-signaal voor oöcytkwantificeringen. Gebruik bijvoorbeeld XY-diameters van 15 μm en 80 μm om eicellen te identificeren in respectievelijk niet-groeiende follikels en groeiende follikels, zoals weergegeven in figuur 4A.
      OPMERKING: De geselecteerde grootte kan variëren als gevolg van criteria voor beeldacquisitie en het type microscoop dat wordt gebruikt. De selectie kan ook variëren tussen genetische stammen, omdat eierstokken met meer eicellen kleinere selecties vereisen voor een betere geautomatiseerde oöcytendetectie.
   3. Na de grootteselectie activeert u het model PSF-rek en achtergrondaftrek, die automatisch worden bepaald. Selecteer de pijl-vooruit om naar het deelvenster Filterpunten te gaan. Voeg het filter Kwaliteit toe en bepaal een drempelwaarde. Om de nauwkeurige schatting van het aantal eicellen te garanderen, vergroot u de afbeelding terwijl de drempel wordt aangepast om een drempelwaarde te kiezen die de meeste eicellen selecteert. Klik op de dubbele pijl om geautomatiseerde tellingen te voltooien.
   4. Controleer de geselecteerde eicellen handmatig met behulp van het tabblad Bewerken om gemiste eicellen te selecteren of de selectie van niet-eiceldeeltjes die zijn geselecteerd door de automatische drempel te deselecteren. Noteer de gegevens op het tabblad Statistieken onder het tabblad Algemeen voor verdere analyse.
      OPMERKING: De parameters die worden gebruikt voor het tellen van de vlekken kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor een andere monsterset, maar het wordt aanbevolen om een handmatige controle uit te voeren voordat u batchanalyse uitvoert.
   5. Om de parameters op te slaan, klikt u op het tabblad Maken en klikt u op Parameters opslaan voor batch.
      OPMERKING: Nucleaire markers (GCNA+ eicellen, figuur 4A) zijn gemakkelijk te herkennen aan de spotfunctie en vereisen mogelijk niet veel handmatige aanpassing. De cytoplasmatische marker (DDX4+ eicel, figuur 3 (P28, gesloten pijl) en figuur 4A) vereist echter meer handmatige aanpassing om de identificatie van de juiste grootte / type eicellen te garanderen.

10. Kwantificering van eiwitexpressie in eierstokken

OPMERKING: Er zijn verschillende manieren om de expressie van eicellen van specifieke markers te kwantificeren met behulp van zowel de functie Spots (sectie 9 en stap 10.1) als surfaces (stap 10.2). De Spots-functie kan worden gebruikt voor eiwitten met verschillende lokalisatiepatronen zoals nucleaire markers (GCNA), en de Surfaces-functie kan worden gebruikt voor eiwitten met niet-uniforme lokalisatiepatronen zoals weergegeven in figuur 5A waar LINE-1 ORF1p-intensiteiten in E15.5 en E18.5 eierstokken werden gemeten. Om de intensiteit van het eiwit van belang tussen twee monsters (bijvoorbeeld tijdpunten, behandelingen of genotypen) te berekenen en te vergelijken, verzamelt u afbeeldingen met dezelfde eigenschappen. Gebruik monsters met een intenser signaal om de parameters te bepalen die kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor de andere monsters.

1. Om de eiwitexpressie met de Spots-functie te verkrijgen, identificeert u eerst de eicellen als gemarkeerd (rubriek 9).
   1. Selecteer vervolgens onder de functie Spots het tabblad Statistieken , gevolgd door het tabblad Gedetailleerd . Klik op de pijl-omlaag en selecteer Specifieke waarden, die een ander tabblad eronder opent met verschillende metingen. Selecteer het intensiteitsgemiddelde van het kanaal dat wordt gebruikt voor de oppervlaktegeneratie (of selecteer andere intensiteitsmetingen, zoals de intensiteitsmediaan).
   2. Als u de gecombineerde/gemiddelde statistische informatie wilt verkrijgen, selecteert u het criterium Gemiddelde waarden . Als u klaar bent, exporteert u gegevens en slaat u deze op voor verdere analyse.
2. Als u de eiwitexpressie wilt verkrijgen met de functie Oppervlakken , opent u de afbeelding, selecteert u de optie 3D-weergave en activeert u de functie Nieuwe oppervlakken toevoegen in het deelvenster Scène om het deelvenster Algoritme te openen. Schakel alle algoritme-instellingen uit als dat niet nodig is en klik op de enkele pijl-vooruit om naar het bronkanaal te gaan.
   1. Selecteer het kanaal met het antilichaamsignaal dat u wilt meten. Andere eigenschappen die u moet selecteren, zijn gebruikersspecifieke opties. Hier werd het LINE-1 signaal als markering gebruikt. De waarden voor Surfaces Detail en Background Subtracction (Lokaal contrast) zijn bewaard op de standaardwaarden van respectievelijk 1,42 en 5,33.
   2. Klik op de pijl vooruit om naar het deelvenster Drempel te gaan. Kies een drempelwaarde die in beide steekproeven vergelijkbaar is (hier is bijvoorbeeld de LINE-1-expressie in E18.5 gebruikt om een drempelwaarde te kiezen). Selecteer Inschakelen met een standaarddiameter van 1,10 seedpunten (deze waarde is optimaal bevonden voor de afbeeldingen, maar kan afhankelijk zijn van de verwachte pixelgrootte van functies).
   3. Klik op de pijl vooruit om naar het deelvenster Filteroppervlakken te gaan. Gebruik een kwaliteitsfilter en baseer de waarde, net als bij de drempelwaarde , op de expressie van de eiwitten in beide eierstokmonsters. Zodra de filtereigenschap is geselecteerd, klikt u op de dubbele pijl-vooruit om het genereren van het oppervlak te voltooien.
   4. Als u de intensiteitswaarden wilt ophalen, selecteert u het tabblad Statistieken , gevolgd door het tabblad Gedetailleerd . Klik op de pijl-omlaag en selecteer Specifieke waarden, die een ander tabblad eronder opent met verschillende metingen.
   5. Selecteer het intensiteitsgemiddelde van het kanaal dat wordt gebruikt voor de oppervlaktegeneratie (of selecteer andere intensiteitsmetingen, zoals de intensiteitsmediaan).
   6. Als u de gecombineerde/gemiddelde statistische informatie wilt verkrijgen, selecteert u het criterium Gemiddelde waarden . Als u klaar bent, exporteert u de gegevens en slaat u deze op voor verdere analyse (figuur 5C).

11. Schatting van het totale aantal eicellen in beschadigde eierstokken met computationele correctie

OPMERKING: Als er tijdens de dissectie een kleine eierstokschade optreedt, kan het mogelijk zijn om het totale aantal eicellen computationeel te schatten. Het wordt aanbevolen om intacte eierstokken uit dezelfde stam- en ontwikkelingsstadia te gebruiken voor het schatten van het aantal eicellen als in figuur 6. Simulaties uitgevoerd met eierstokken bij E15,5 geven aan dat corrigeren voor een verlies van ≥30% resulteert in een significante afwijking van de werkelijke aantallen (figuur 6C).

1. Open afbeeldingen van intacte eierstokken met IMARIS en selecteer de functie Frame . Selecteer onder Frame-instellingen de labels Box, Grid, Tickmarks en Axis . Selecteer op het tabblad Positie X/Y/Z 200 μm om vinkjes te genereren met 200 μm-ruimten in alle X/Y/Z-posities.
   OPMERKING: De vinkjes maken een raster/liniaal in X-, Y- en Z-vlakken om eicellen binnen een specifiek gebied te identificeren.
2. Activeer de functie Spots om de eicellen te identificeren zoals aangegeven in rubriek 9 (figuur 4). Maak een 3D-model met behulp van de eicellen die zijn geïdentificeerd in alle intacte eierstokken die voor de simulatie worden gebruikt door Sphere te selecteren onder het tabblad Puntenstijl / Kwaliteit in de functie Spots .
   OPMERKING: De pixelbreedte kan ook worden gewijzigd op het tabblad Puntenstijl/kwaliteit .
3. Met de doos die in stap 11.1 is gegenereerd, lijnt u de 3D-modellen van de intacte eierstokken uit in dezelfde richting als in figuur 6A.
4. Gebruik de tickmarks van 200 μm (stap 11.1) om eicellen te selecteren die binnen 50% van het volume van elke eierstok vallen. Klik op de functie Vlekken en selecteer Labels bewerken om de eicellen die binnen het 50%-gebied vallen op kleur te classificeren, zoals weergegeven in figuur 6A.
   OPMERKING: Zodra eicellen in een regio zijn geclassificeerd, wordt het aantal eicellen dat binnen elke klasse valt, verstrekt.
5. Zoom in op het 50%-gebied en verander de vinkjes van 200 μm naar 50 μm om een kleinere liniaal te maken voor oöcytidentificatie. Behoud het zoompercentage in alle afbeeldingen. Met de 50 μm-vinkjes als leidraad, verdeel je het 50%-gebied in vijf gelijke delen.
   OPMERKING: Eicellen in elk deel vertegenwoordigen 10% van het volume zoals gemarkeerd in figuur 6A, waar een intacte eierstok eicellen toont in de bovenste helft van de eierstok, ingedeeld in vijf verschillende kleuren, waarbij elke kleur eicellen vertegenwoordigt binnen een 10% volumetrisch gebied.
6. Noteer de oöcytenaantallen in elk 10%-gebied zoals weergegeven in figuur 6A,B. Bereken het gemiddelde aantal eicellen voor stappen van 10, 20, 30, 40 en 50%.
7. Gebruik de markering in stap 11.1 tot en met 11.6 om eicellenaantallen in de beschadigde gedeeltelijke eierstok te verkrijgen. Plaats de beschadigde eierstok in dezelfde richting als de intacte eierstokken en schat het ontbrekende volume / percentage zoals hierboven beschreven.
8. Om het totale aantal eicellen in de hele eierstok te schatten, voegt u het gemiddelde aantal eicellen berekend voor een vergelijkbaar volume toe aan het aantal dat wordt verkregen uit de partiële eierstok (figuur 6B).

Representative Results

Immunostaining en beeldvorming van de hele eierstok maakt de visualisatie en kwantificering van eicellen of eiwitexpressie in eierstokken in verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk met behulp van dezelfde techniek en markers (figuur 3). Dit protocol is ontwikkeld voor een grootschalig project waarbij analyse van eierstokken in meerdere stadia en van meerdere muizenstammen nodig was. Hier presenteren we gegevens die zijn verzameld voor de C57BL6 / J-stam, een standaardstam voor genetische analyse. De hier gepresenteerde techniek is eenvoudig, resultaten kunnen binnen 14-19 dagen worden verkregen (figuur 2D) en kunnen worden gebruikt voor eierstokken van prenatale, prepuberale en puberale vrouwen (figuur 1 en figuur 2A, B).

Deze benadering werd gebruikt om de dynamiek van het oöcytenverlies te bestuderen dat van nature optreedt tijdens de vorming van de oöcytenreserve van de eierstokken. In veel organismen, waaronder de muis, wordt gedacht dat het aantal eicellen piekt tijdens het foetale leven rond de tijd dat eicellen meiose ~ E13.5 binnendringen. Het aantal eicellen neemt af als gevolg van het nog steeds niet volledig begrepen proces van foetale oöcytenattritie (FOA) (van ~ E15.5 tot E18.5), dat mechanistisch is gekoppeld aan de expressie van de retrotransposon LINE-1^20,21. Meer eicellen worden geëlimineerd na E18,5 tot P0 als gevolg van de eliminatie van abnormale eicellen door een meiotisch kwaliteitscontrolepunt^22,23. Om deze processen met behulp van dit protocol te onderzoeken, immunostained en beeldden we eierstokken in verschillende ontwikkelingsstadia met behulp van DDX4 en GCNA als oöcytmarkers zoals weergegeven in figuur 3.

Kleine eicellen die GCNA en DDX4 tot expressie brengen, worden gezien vanaf E15,5 en ze vertegenwoordigen eicellen tijdens MPI of gearresteerd bij dictyaat in primordiale follikels. Grotere groeiende eicellen met sterke DDX4-expressie worden al gedetecteerd in P2-eierstokken, waar ze hoogstwaarschijnlijk de eerste golf van follikels^{vertegenwoordigen 44}. Toenemende aantallen grotere eicellen worden gezien in P5 en P28 eierstokken. Beelden verkregen door multifotonenmicroscopie (figuur 4A) werden verwerkt met behulp van IMARIS-software en 3D-rendering werd uitgevoerd om kleine en grotere groeiende eicellen te identificeren op basis van het nucleaire GCNA-signaal en de grootte afgebakend door het DDX4-signaal (figuur 4A en video 1). Oöcyten werden geteld zoals beschreven in het protocol en de resultaten zijn samengevat in figuur 4B. In overeenstemming met eerdere studies zagen we een significant oöcytenverlies van E15,5 tot E18,5 (~ 32%) en E18,5 tot P2 (~ 24%). Tegen de tijd dat vrouwtjes de puberteit bereiken (P28), heeft slechts ~ 30% van de eicellen die aanwezig zijn op E15.5 overleefd.

Deze methode kan ook worden gebruikt om de gevolgen van genotoxische behandelingen zoals bestraling te observeren, waarvan is aangetoond dat het de primordiale follikelreserve binnen een week volledig elimineert 23,38,45. Een significant visueel verschil is duidelijk tussen de hele eierstok behandeld met straling en de onbehandelde controle in figuur 3 (vergelijking van P28-eierstokken van behandelde en onbehandelde vrouwtjes). In de P28-eierstok zonder blootstelling aan straling observeerden we twee eicelpopulaties gelabeld met DDX4; overvloedige kleine eicellen in primordiale follikels (gesloten pijl); en grotere eicellen van verschillende groottes die meestal worden aangetroffen in groeiende follikels (bijv. Primair, secundair en preantral) (figuur 3). Daarentegen is de eierstok van een vrouw die is blootgesteld aan 0,5Gy van γ-straling op P7 volledig verstoken van kleine eicellen in primordiale follikels zoals eerder waargenomen in 2D-secties. Interessant is dat alleen grotere eicellen van vergelijkbare grootte straling overleefden; dit kunnen de eerste golfzakjes zijn die al in de P7-eierstok groeien, omdat bekend is dat ze bestand zijn tegen straling⁴⁶ (figuur 3, P28).

Naast de kwantificering van het aantal eicellen, kan dit protocol worden gebruikt voor immunostaining en kwantitatieve analyses van andere eiwitten die betrokken zijn bij de ontwikkeling van eicellen. We gebruikten bijvoorbeeld antilichamen tegen LINE-1ORF1p-eiwit, een RNA-bindend chaperonne-eiwit, geproduceerd door LINE-1 retrotransposons (figuur 5). Verhoging van de abundantie van LINE-1-elementen van E15.5 tot E18.5 is voorgesteld om oöcytenafbraak ^20,21 te veroorzaken. Inderdaad, met behulp van multifoton-vastgelegde beelden en signaalintensiteitsanalyse in IMARIS, werden LINE-1 ORF1p-niveaus waargenomen die gedurende deze tijd significant toenamen in eicellen, wat correleert met een significante daling van het aantal eicellen zoals weergegeven in figuur 4B.

In omstandigheden waarin een deel van een eierstok beschadigd of verloren is gegaan, kunnen eierstokken uit dezelfde stam en hetzelfde ontwikkelingsstadium worden gebruikt om het aantal eicellen binnen het ontbrekende gebied computationeel te schatten, zoals weergegeven in figuur 6. Gegevens van E15.5-eierstokken werden gebruikt voor simulaties om de nauwkeurigheid van computationele correcties te testen. Eicellen in eierstokken met maximaal 30% weefselschade kunnen computationeel worden geschat op ≤10% afwijking in vergelijking met eicellen in een intacte eierstok, wat suggereert dat 3D-eierstokkleuring en modellering effectief kunnen worden gebruikt om gegevens uit kostbare weefsels te redden. Simulaties uitgevoerd met eierstokken bij E15,5 geven aan dat corrigeren voor een verlies van ≥30% resulteert in een significante afwijking van de werkelijke aantallen (figuur 6C).

Figuur 1: Ovariumdissectie en perfusie van vrouwen uit prenatale en postnatale stadia. (A-C) Ovariumdissectie uit verschillende stadia vereist verschillende technieken, die schematisch worden afgebeeld om de beschrijvingen in de video aan te vullen. (D) Eierstokken op postnatale dag 5 (P5) zijn veel kleiner dan op P28, wat een ander clearingprotocol vereist zoals beschreven in het protocol. (E,F) Een goede perfusie van de eierstokken is belangrijk om achtergrondkleuring van rode bloedcellen te elimineren. Niet-geperfundeerde voortplantingsorganen en eierstokken hebben een roze tint, terwijl doordrenkte organen wit worden. Afkorting: RI = niet-geperfundeerde voortplantingsorganen. Afbeeldingen A-C zijn gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Immunostaining, clearing en beeldvorming van de eierstokken van hele muizen. (A) Stroomdiagram toont gedeelde en specifieke stappen voor immunostaining en clearing protocol voor prenatale / prepuberale en puberale eierstokken. (B) Vrijgemaakte eierstokken worden gemonteerd in een druppel clearingoplossing in het midden van een lijm die goed is ingeklemd tussen twee dekslips. Voor beeldvorming worden de gemonteerde monsters in een 3D-geprinte adapterdia geplaatst. (C) Grijswaarden multifotonenbeelden van niet-geperfundeerde vs. geperfundeerde eierstokken, immunos gekleurd met de eicelmarker DDX4, met verbeterde beeldkwaliteit en lagere niet-specifieke kleuring na perfusie. De gesloten pijl duidt op een eicel met een dunne laag cytoplasmatische DDX4-kleuring die typisch is voor primordiale follikels, en de open pijlen tonen grotere eicellen in groeiende follikels. Asterisk duidt op autofluorescentie uit bloedvaten. (D) 3D-renders van confocale versus multifotonbeelden van P5-eierstokken, immunos gekleurd met oöcytmarkers GCNA (groen) en DDX4 (magenta), met een significante sferische aberratie van confocale microscopie en vrijwel geen van multifoton. Schaalstaven = 100 μm (C, D) en 50 μm (inzetstukken in D). Afkortingen: GCNA = kiemcelkernzuur peptidase; DDX4 = DEAD-box helicase 4. Afbeelding A is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve 3D-gerenderde beelden van eierstokken van verschillende ontwikkelingsstadia. 3D-renderings van multifotonenbeelden van hele mount eierstokken die immuun gekleurd zijn met GCNA (groen) en LINE-1 ORF1p (blauw) of DDX4 (magenta), respectievelijk in prenatale en postnatale eierstokken. Individuele kanalen worden gepresenteerd in grijstinten om nucleaire en cytoplasmatische signalen te tonen. De witte kaders omlijnen gebieden vergroot in de linker onderste inzetstukken. Twee verschillende eierstokken worden getoond voor P28. De eierstok van het niet-bestraalde vrouwelijke (boven) bevat een grote populatie van kleine eicellen in primordiale follikels (zie inzet). Daarentegen is de eierstok van het vrouwelijke bestraald op P7 met 0,5 Gy γ-straling (IR) volledig verstoken van kleine eicellen in primordiale follikels (zie inzet). De gesloten pijl duidt op een eicel met een dunne laag cytoplasmatische DDX4-kleuring die typisch is voor primordiale follikels, en open pijlen tonen grotere eicellen in groeiende follikels. Schaalbalken = 100 μm; 30 μm voor P28 inzetstukken; 10 μm voor alle andere inzetstukken. Inzetstukken bevatten vergrote weergaven van 3D-gerenderde afbeeldingen die zijn gegenereerd in IMARIS en kunnen door het perspectief enigszins afwijken van afbeeldingen met een lage vergroting. Afkortingen: Non-IR = controle niet-bestraald; IR = bestraald bij P7 met 0,5 Gy γ-straling; GCNA = kiemcelkernzuurzuur peptidase; DDX4 = DEAD-box helicase 4; LINE-1 = lang afgewisseld nucleair element-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Beeldverwerking, 3D-weergave van eicellen en kwantificeringsresultaten. (A) 3D-renders van multifotonenbeelden (links) werden verwerkt in IMARIS met behulp van Gauss-filter (midden) en eicellen van kleine en grote afmetingen werden geïdentificeerd met behulp van de spotfunctie (rechts). P5 en P28 eierstokken als voorbeeld. Schaalbalken = 100 μm (P5); 10 μm (P5 inzetstukken); 300 μm (P28); 50 μm (P28 inzetstukken). (B) Kleine eicellen die positief waren voor GCNA werden gekwantificeerd in eierstokken uit verschillende stadia met behulp van spotkenmerken (boven). Om het afnemende aantal eicellen tijdens de ontwikkeling te illustreren, werd het gemiddelde percentage eicellen in elk stadium berekend in vergelijking met het gemiddelde aantal aanwezigen in het vroegste stadium geteld bij E15,5 (onder). Let op de grote daling van het aantal eicellen van E15,5 naar E18,5. Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism-software en geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA, en de significantie werd bepaald door Bonferroni's post hoc meervoudige vergelijkingstest. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0,05. Afkorting: GCNA = kiemcelkernzuur peptidase; ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Detectie en kwantificering van de LINE-1 ORF1p-expressie in foetale eicellen. (A) 3D-renderings van multifotonenbeelden tonen LINE-1 ORF1p (blauw) expressie in E15.5 en E18.5 foetale eicellen (gemarkeerd door groen GCNA). (B) 3D-oppervlakken die in IMARIS worden gegenereerd met behulp van afbeeldingen op de bovenste rij in paneel A. (C) LINE-1 ORF1p-intensiteitsanalyse toont een hogere expressie van LINE-1 ORF1p per eicel bij E18,5 dan E15,5. Schaalbalken = 100 μm; 10 μm (paneel A inzetstukken); 30 μm (paneel B inzetstukken). Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism-software en geanalyseerd door de t-test van Student, en de significantie werd bepaald door de Mann-Whitney U-test . P ≤ 0,0001; ns >0,05. Afkortingen: GCNA = kiemcelkernzuur peptidase; LINE-1 = lang afgewisseld nucleair element-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Methode voor het schatten van het totale aantal eicellen in beschadigde ovariummonsters met computationele correctie. (A) Model van GCNA-positieve (groene) E15.5-eicellen met vijf 10% gebieden gemarkeerd in rood, blauw, grijs, magenta en bruin in een intacte eierstok. Elk volgend beeld, na de intacte eierstok, vertegenwoordigt een gesimuleerde eierstok met 10% incrementele gebieden die tot 50% missen. (B) Schematische berekeningsmethode voor het schatten van het aantal eicellen in beschadigd monster. (C) Het totale aantal eicellen in gesimuleerde eierstokken werd vergeleken met het aantal in de oorspronkelijke intacte eierstokken (beschouwd als 100%) en het verschil wordt gepresenteerd als % afwijking. Simulatie van zes individuele eierstokken waarbij 10-50% volume ontbreekt. Schaalbalken = 80 μm. Afkorting: GCNA = kiemcelkernzuur peptidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: 3D-rendering en 3D-modellering van eicellen in P5-eierstokken. Klik hier om deze video te downloaden.

Oplossingen en buffers	Reagens(en)	Compositie
Fixative	Paraformaldehyde	4% (v/v)
Buffer voor permeabilisatie	Polyvinylalcohol (PVA)	0,2% (w/v)
	Natriumboorhydride	0,1% (w/v)
	Triton X-100	1,5% (v/v)
Buffer blokkeren	Runderserumalbumine (BSA)	3% (w/v)
	1 M Glycine (pH 7,4)	2% (w/v)
	Triton X-100	0,1% (v/v)
	200x Penicilline-Streptomycine	1% (v/v)
	10% Natriumazide	0,2% (v/v)
	geitenserum	10% (v/v)
Wasbuffer	PVA	0,2% (w/v)
	Triton X-100	0,15% (v/v)
	10% Natriumazide	0,1% (v/v)
ScaleS4(0)-oplossing (pH 8,1)	D-Sorbitol	40% (met v)
	Ureum	24% (w/v)
	Glycerol	10% (v/v)
	DMSO	20% (v/v)
ScaleCUBIC-1 oplossing	Ureum	25% (met w/v)
	N, N, N′, N ′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethyleendiamine	25% (v/v)
	Triton X-100	15% (v/v)
Sucrose Oplossing	Sacharose	20% (w / v)
ScaleCUBIC-2 oplossing	Sacharose	50% (met v)
	Ureum	25% (met w/v)
	Triethanolamine	10% (w/v)
	Triton X-100	0,1% (v/v)

Tabel 1: Oplossingen en buffers.

Aanvullende figuur S1: Voorkeuren voor beeldacquisitie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Instellingen voor beeldacquisitie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit artikel presenteert een gedetailleerd 3D-immunostaining- en beeldvormingsprotocol voor prenatale en postnatale eierstokken voor high-throughput en vergelijkende studies voor kiemcelkwantificering en eiwitlokalisatie. We hebben dit protocol ontwikkeld om het aantal eicellen in de eierstokken (N = 6-12) op zes ontwikkelingstijdpunten in 10-16 verschillende stammen te analyseren, waar 2-4 24-well platen meestal in één keer worden verwerkt. Deze methode kan worden aangepast voor andere organen of cellulaire markers. Dit protocol kan bijvoorbeeld worden gebruikt om somatische cellen, zoals granulosacellen in de eierstok, te labelen en te visualiseren met behulp van geschikte antilichamen, waardoor studies van somatische-kiemcelinteracties of de ontwikkeling van andere ovariële celtypen worden vergemakkelijkt.

Een beperking van dit protocol en antilichaamcombinatie is de definitieve identificatie van verschillende folliculaire stadia. DNA-vlekken die worden gebruikt in immunofluorescentie en 2D-beeldvorming om folliculaire stadia te identificeren door lagen granulosacelkernen zijn onvoldoende voor 3D-benaderingen. De 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) of Hoechst worden zelden gebruikt voor kleuring van hele organen vanwege beperkte lichtpenetratie en rottend signaal in het midden van groot weefsel. Propidiumjodide (PI) is een klein molecuul dat diep in het weefsel kan doordringen, maar moeilijk te vangen is op het multifotonenbeeldvormingssysteem vanwege spectrale overlap. Een betere resolutie van folliculaire stadia kan worden bereikt door extra markers die specifiek zijn voor granulosacellen, zoals anti-Mullerian hormoon (AMH) of FOXL2^47,48. Hoewel deze markers nuttig zijn bij het onderscheiden van grotere groeiende follikels, zullen ze primordiale van primaire follikels niet onderscheiden. Totdat specifieke markers voor deze vroege stadia beschikbaar komen, bieden eicelmarkers zoals DDX4 of GCNA de beste indicator voor de ontwikkeling van follikels. Verder werkt dit protocol voor prenatale mannelijke geslachtsklieren, maar is nog niet getest in de postnatale testis, waar de grootte de beperkende factor kan zijn. Kritieke problemen worden hieronder vermeld voor een betere visualisatie en kwantificering van geslachtscellen in eierstokken van verschillende grootte en de technieken en stappen die zijn genomen om immunostaining van goede kwaliteit voor downstream-analyse te garanderen, worden benadrukt.

De eerste kritieke stap is om schade aan de eierstokken voor en na fixatie te voorkomen. Beschadigde eierstokken kunnen delen van de orgaanstructuur missen, waardoor de oöcytenaantallen worden beïnvloed en de experimentele resultaten worden scheefgetrokken. Om schade te voorkomen, wordt na dissectie extra somatisch weefsel aan de grotere eierstok gehecht om met een tang te grijpen voor het overbrengen van de eierstokken. Verder, voor kleinere eierstokken, het overbrengen ervan met een pipetpunt die breed genoeg is gesneden zodat de eierstokken gemakkelijk in de punt passen, voorkomt schade. Als kleine weefselschade ertoe leidt dat een deel van de eierstok ontbreekt, kan dit worden verzacht door een computationele methode waarbij het totale aantal eicellen in het beschadigde monster kan worden geëxtrapoleerd met behulp van intacte monsters van hetzelfde type (figuur 6).

Computationele simulaties toonden echter aan dat de nauwkeurigheid van de voorspelling afneemt met de toenemende omvang van het beschadigde gebied (100,8% ± 0,2, 97,2% ± 1,5 en 90,3% ± 1 voor respectievelijk 10, 20 en 30% schade, respectievelijk Figuur 6C). Op basis van simulaties raden we aan om monsters met >30% verlies uit te sluiten van analyse. Meerdere intacte eierstokken van hetzelfde monstertype werden gebruikt om het gemiddelde aantal eicellen in het gebied te berekenen dat vergelijkbaar is met het gebied dat ontbreekt in het beschadigde monster. Dit aantal werd vervolgens gebruikt om het totale aantal eicellen in de eierstok met schade te voorspellen. Het gebruik van een gebied van vergelijkbare grootte in dezelfde eierstok die grenst aan het ontbrekende gebied kan als alternatief worden gebruikt, maar is niet getest.

Een ander probleem is om te voorkomen dat cellen worden verontreinigd die autofluorescentie kunnen veroorzaken. Voor puberale eierstokken moet perfusie, zoals hierboven beschreven, met zowel 1x PBS als 1% PFA worden uitgevoerd om bloedcellen te elimineren die autofluorescentie veroorzaken (figuur 2C). Perfusie met PBS moet doorgaan totdat organen, vooral de eierstokken en nieren, van bloed zijn ontdaan en wit worden voordat wordt overgeschakeld op 1% PFA (figuur 1E, F). Inefficiënte perfusie met PBS zal resulteren in een hoge achtergrond die de visualisatie van kleine eicellen kan maskeren en bemoeilijken. Perfusie met lagere (1%) of hogere (4%) percentages PFA resulteert in een betere beeldkwaliteit dan perfusie met PBS alleen; vandaar dat het lagere percentage PFA werd gebruikt.

Optimalisatie van antilichaamkleuring vereist aandacht voor verschillende variabelen. Voor de permeabilisatiestap bleek 4 uur ideaal te zijn voor deze test, met perioden langer dan 4 uur (6-8 uur getest) wat resulteerde in helemaal geen kleuring. Omdat de hoeveelheid en kosten van antilichamen die worden gebruikt voor grootschalige immunostaining-experimenten hoog kunnen zijn, werd dit protocol getest en geoptimaliseerd voor het hergebruik van antilichaammengsels zonder verlies van immunostainingkwaliteit. Voor hergebruik moet het antilichaammengsel worden aangevuld met vers antilichaam zoals beschreven in het protocol. Wasstappen zijn ook van cruciaal belang voor de kwaliteit van immunostaining en moeten langer worden uitgevoerd om een betere signaal-ruisverhouding te bereiken tijdens beeldvorming en moeten worden bepaald voor elk antilichaam naar keuze. Voor het beste resultaat raden we aan om de ScaleS4(0)-clearingoplossing voor elk gebruik vers voor te bereiden, terwijl ScaleCUBIC-1 en ScaleCUBIC-2 gedurende ~ 1-2 maanden bij kamertemperatuur in het donker kunnen worden bewaard.

De ScaleCUBIC-1 clearing wordt uitgevoerd bij 37 °C; belangrijk is dat hogere temperaturen moeten worden vermeden, omdat ze zullen resulteren in reagensneerslag, wat de kwaliteit van de immunostaining kan beïnvloeden. Het monteren van meerdere monsters voor beeldvorming kan tijdrovend zijn. Agar of andere inbeddingsmethoden die in andere protocollen worden gebruikt, zijn arbeidsintensief en vereisen mogelijk een extra herzuivering van monsters 47,49,50. Herbruikbare siliconen pakkingen kunnen worden gebruikt als lijmputten die gemakkelijk te gebruiken zijn met coverslips en worden aangeboden in verschillende maten en diepten om andere monstergroottes te accommoderen. Om beelden van hoge kwaliteit te bereiken, moet een voldoende volume clearingoplossing worden gebruikt; te weinig zal resulteren in een slechte beeldkwaliteit en te veel oplossing kan op de microscoop lekken. Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor specifieke monsters, afhankelijk van hun grootte. Schotels met glazen bodem kunnen worden gebruikt, maar monsters moeten worden geïmmobiliseerd voor beeldvorming, omdat zelfs de kleinste bewegingen het beeld zullen vervormen. Siliciumpakkingen kunnen worden gebruikt in combinatie met een schotel met glazen bodem en een bovenste afdekplaat om de monsters te immobiliseren voor beeldvorming. Dit beperkt echter de mogelijkheid om het monster om te draaien als beeldvorming van beide kanten nodig is vanwege de grootte van de eierstok.

Een andere kritische keuze voor deze grootschalige, high-throughput benadering was beeldvorming op het Leica DIVE/4TUNE/FALCON platform met twee instelbare Spectra-Physics multiphoton (MP) lasers. De voordelen van het gebruik van het DIVE-platform zijn onder meer het gemak van monstermontage (hierboven beschreven), het minimaliseren van optische vervorming (in vergelijking met confocale platforms) en vooral de beeldsnelheid en het beheer van verkregen beeldgegevens. Beeldmonsters met de multifotonlasers bij een hogere vergroting (16x) zijn veel sneller en veroorzaken minder fotoschade dan de confocale lasers op de Leica DIVE of SP8 met vergelijkbare instellingen voor beeldacquisitie met LAS X-software. De MP-bundel is laag, de fluorofoor-excitatie is sterk gelokaliseerd op het brandpunt en bereikt meer diepte bij lage vergroting zonder fotoschade toe te brengen ondanks een hoger aantal ruimtelijke / axiale beeldvormingsstappen (confocaal: ~ 300-400 secties maximaal, MP: >800 secties).

Het 16x/NA0.6-objectief maakt correctie mogelijk voor lichte brekingsindexmismatches als gevolg van monster- en mountantverdeling langs de optische as via een mechanische correctiekraag, die optimaal is ingesteld voor maximaal signaal, halverwege het monster. Bovendien kunnen bolvormige structuren, zoals eicellen, worden vervormd door confocale beeldacquisitie, omdat diepteafhankelijke lokalisatie van het confocale vlak (signaal) als gevolg van mountant- en monsterbrekingsindexmismatches bij een bepaalde pinhole-instelling kan optreden (figuur 2D). Omdat het fluorescentiesignaal wordt opgevangen via het interne gaatje van het instrument om het onscherpe signaal te verwijderen, kan de intrinsieke optische vervorming (sferische aberratie) dieper in het monster erger worden, wat problematisch is voor grotere eierstokken (dwz ~ 400-600 micrometer dikte).

Met dezelfde overeenkomende lenscorrectie-instellingen kan vrijwel geen sferische aberratie worden gedetecteerd op het DIVE MP-systeem met verschillende emissiegolflengten, waardoor kwantificerings- en colokalisatiestudies worden vereenvoudigd (figuur 2D). Ten slotte zorgt de krachtige gepulseerde laser voor een opwindende lagere fluorofoorconcentratie diep in het monster, met name wanneer deze wordt gebruikt met de Z-diepte excitatiecorrectie. Bovendien wordt de opvang van zwakkere signalen ook verbeterd door de MP hybride detector (HyD-RLDs), een combinatie van reguliere fotomultiplicatorbuizen en lawinefotonenteldetectoren, waardoor meer dan 30 keer hogere signaaldetectie mogelijk is over een breed scala aan emissiegolflengten.

Light sheet (LS) multifotonenmicroscopie is een ander opkomend platform voor 3D-weefselbeeldvorming⁴⁷. LS vereist echter meer insteltijd voor macroscopische monsters, inclusief agar-inbedding en instelling voor beeldvorming. Bovendien kunnen afbeeldingen die bij een hogere vergroting met monsterrotatie zijn verkregen, grote bestanden van > 100 GB genereren, wat nodig kan zijn om schaduwartefacten van lichte vellen te verwijderen (vanwege brekingsindexverschillen van het buitenste medium en de binnenkant van het monster, of vervormingen van het monsteroppervlak). De gepresenteerde methode voor het monteren van monsters in oplossing in zelfklevende putten is eenvoudig en snel.

Bovendien maakt deze aanpak het mogelijk om meerdere eierstokken in één put in één put af te beelden met één opstelling en zonder omdraaien of draaien. Het omdraaien van de coverslip "sandwich" kan echter nodig zijn voor grotere eierstokken. De beeldvorming van het DIVE-systeem is sneller dan confocale en LS; bij 16x vergroting wordt de prepuberale eierstok in beeld gebracht in 3-5 min (Z-stap 2 μm) en de puberale eierstok in 1 uur (Z-stap 5 μm). Bovendien zijn bestanden die in LAS X worden gegenereerd van beheersbare grootte (2-20 GB), wat ook van cruciaal belang is voor een groot aantal monsters voor downstream-analyse. Hoewel dit immunostainingprotocol is geoptimaliseerd voor gebruik in combinatie met het DIVE-platform, kunnen immunostained monsters met enkele aanpassingen in beeld worden gebracht met behulp van andere MP / LS-platforms.

Het voordeel van de hele eierstokkleuring met 3D-modelleringsprotocol is de efficiënte en relatief eenvoudige gegevensanalyse in vergelijking met handmatige gegevensverzameling in 2D-analyse. De IMARIS 3D-visualisatie- en analysesoftware is gekozen omdat deze commercieel beschikbaar is en wordt aangeboden door veel microscopiekernen, geen programmeervaardigheden vereist en compatibel is met veel softwareplatforms voor beeldacquisitie zoals LAS X van Leica of ZEN van ZEISS. Met IMARIS worden de standaardparameters ingesteld zoals gemarkeerd in de protocolsectie en deze parameters kunnen worden gebruikt voor andere afbeeldingen en monsters met kleine wijzigingen, waardoor de reproduceerbaarheid en efficiëntie worden verbeterd.

Beeldanalyse en kwantificering zijn geoptimaliseerd voor IMARIS-software; vergelijkbare analyses kunnen echter worden uitgevoerd op andere commerciële of open-source datavisualisatiesoftware volgens vergelijkbare principes. Tot slot is hier een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het in beeld brengen van hele eierstokken voor kwantitatieve en kwalitatieve analyses. Dit werd doelbewust aangepast aan de eisen van de high-throughput verwerking die in toenemende mate nodig zal zijn voor toxicologische tests, klinische en diagnostische doeleinden en genoombrede analyses van regulatoren van ovariële toereikendheid en functie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp