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Developmental Biology

Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative utilizzando immunocolorazione a montaggio intero, microscopia multifotonica e visualizzazione e analisi 3D. Questo protocollo supporta un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile applicabile per tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Abstract

La fertilità femminile e la durata della vita riproduttiva dipendono dalla qualità e dalla quantità della riserva ovocitaria ovarica. Si stima che l'80% delle cellule germinali femminili che entrano nella profase meiotica I vengano eliminate durante l'attrito fetale degli ovociti (FOA) e la prima settimana di vita postnatale. Tre meccanismi principali regolano il numero di ovociti che sopravvivono durante lo sviluppo e stabiliscono la riserva ovarica nelle femmine che entrano nella pubertà. Nella prima ondata di perdita di ovociti, il 30-50% degli ovociti viene eliminato durante la FOA precoce, un fenomeno che viene attribuito all'elevata espressione dell'elemento nucleare-1 intervallato lungo (LINE-1). La seconda ondata di perdita di ovociti è l'eliminazione degli ovociti con difetti meiotici mediante un checkpoint di qualità meiotico. La terza ondata di perdita di ovociti si verifica perinatale durante la formazione del follicolo primordiale quando alcuni ovociti non riescono a formare follicoli. Non è chiaro cosa regoli ciascuna di queste tre ondate di perdita di ovociti e come modellano la riserva ovarica nei topi o negli esseri umani.

L'immunofluorescenza e la visualizzazione 3D hanno aperto una nuova strada per l'immagine e l'analisi dello sviluppo degli ovociti nel contesto dell'intera ovaia piuttosto che in sezioni 2D meno informative. Questo articolo fornisce un protocollo completo per l'immunocolorazione dell'ovaio intero e la compensazione ottica, producendo preparati per l'imaging utilizzando la microscopia multifotonica e la modellazione 3D utilizzando il software disponibile in commercio. Mostra come questo metodo può essere utilizzato per mostrare la dinamica dell'attrito degli ovociti durante lo sviluppo ovarico nei topi C57BL / 6J e quantificare la perdita di ovociti durante le tre ondate di eliminazione degli ovociti. Questo protocollo può essere applicato alle ovaie prenatali e postnatali precoci per la visualizzazione e la quantificazione degli ovociti, nonché altri approcci quantitativi. È importante sottolineare che il protocollo è stato sviluppato strategicamente per ospitare un'elaborazione ad alto rendimento, affidabile e ripetibile in grado di soddisfare le esigenze in tossicologia, diagnostica clinica e saggi genomici della funzione ovarica.

Introduction

La maggior parte delle femmine di mammifero nascono con un numero finito di ovociti meioticamente arrestati immagazzinati all'interno dei follicoli primordiali, costituendo la riserva ovarica (OR)1,2. La sala operatoria determina la durata complessiva della vita riproduttiva femminile e la salute3. La sala operatoria normalmente diminuisce di dimensioni con l'invecchiamento e può essere prematuramente impoverita in caso di esposizione a determinati agenti genotossici (radiazioni / chemioterapia) e stress ambientali (malnutrizione), portando a infertilità 4,5,6. L'infertilità femminile idiopatica può spesso essere attribuita alla qualità genetica e fisiologica delle uova che si sviluppano dalla sala operatoria e rimane poco compresa 7,8. Poiché la dotazione del follicolo femminile è in gran parte predeterminata dalla nascita, è essenziale comprendere i meccanismi di regolazione coinvolti nella creazione e nel mantenimento della sala operatoria.

Nei topi, la formazione di OR inizia con la specifica delle cellule germinali primordiali (PGC) intorno al giorno embrionale (E) 7.52. I PGC migrano verso le creste genitali, dove risiederanno di circa E10,59. La seguente proliferazione estesa si verifica con citochinesi incomplete con conseguente formazione di cisti che saranno scomposte più tardi nello sviluppo10,11. A circa E12,5, viene determinato il sesso gonadico e la proliferazione della PGC si arresta nelle ovaie. Nelle femmine, le PGC, ora ovociti, entrano nella profase meiotica I (MPI) a circa E13.5 12,13. Gli ovociti progrediscono attraverso MPI estese e arresto nella fase dictyate intorno al momento della nascita. Durante la prima settimana dopo la nascita, ogni ovocita arrestato è circondato da cellule di granulosa, formando così un follicolo primordiale.

Il numero di follicoli primordiali nella sala operatoria di una femmina dipende da quanti ovociti sono sopravvissuti alle onde di eliminazione degli ovociti che si verificano prima e durante l'arresto delle MPI attraverso apoptosi, autofagia o necrosi14,15. La prima ondata si verifica durante lo sviluppo fetale ed è nota come FOA. La FOA è un processo evolutivamente conservato nelle femmine (mammiferi e non mammiferi), per cui si stima che il 50-80% degli ovociti venga eliminato a seconda della specie femminile 16,17,18,19. Nei topi, foa si verifica durante E15.5 a E18.5 ed è stato attribuito alla riattivazione e all'espressione di sequenze line-1 di retrotrasposone che causano la morte degli ovociti20,21. La seconda ondata di eliminazione degli ovociti avviene attraverso un checkpoint meiotico che elimina gli ovociti con difetti meiotici come le rotture a doppio filamento del DNA non riparato (DSB)22,23. La successiva ondata di eliminazione degli ovociti si verifica durante la rottura della cisti, culminando durante la formazione dei follicoli primordiali, ognuno dei quali contiene un singolo ovocita 10,11,24,25.

Nei topi, la riserva follicolare primordiale è in gran parte stabilita dalla pubertà, dopo di che diminuisce quando i follicoli primordiali vengono attivati per la crescita durante i cicli riproduttivi regolari. La dimensione della sala operatoria varia tra le singole donne e tra i diversi ceppi genetici di topi; tuttavia, la regolazione genetica delle dimensioni or non è ben compresa 26,27,28,29. Gli studi genetici sulla regolazione della sala operatoria sono ostacolati dalla mancanza di protocolli standardizzati per studiare le onde di eliminazione degli ovociti durante lo sviluppo prenatale e postnatale. Diverse metodologie di quantificazione degli ovociti sono state sviluppate nei topi, con la più comune e ampiamente utilizzata è la valutazione istomorfometrica delle sezioniistologiche 30,31. In questa tecnica, gli ovociti vengono identificati su sezioni seriali con macchie istologiche, come ematossilina ed eosina (H & E) e marcatori periodici acido-Schiff (PAS) o fluorescenti. Questa tecnica è affidabile se tutte le condizioni rimangono costanti, compreso lo spessore della sezione, il recupero efficiente di tutte le sezioni in tutta l'ovaia e gli schemi di conteggio dei singoli laboratori. Tuttavia, i numeri riportati da diversi laboratori spesso differiscono in modo significativo e quindi non sono facilmente comparabili.

Inoltre, date le differenze genetiche, l'uso di diversi ceppi di topo può anche influenzare la conta degli ovociti. Ulteriori approcci computazionali sono stati sviluppati per la valutazione istomorfometrica e includono il rilevamento automatizzato degli ovociti utilizzando l'approccio del frazionatore, il conteggio automatico utilizzando algoritmi computazionali e la ricostruzione 3D di immagini istologiche per prevenire conteggi multipli dello stesso ovocita 31,32,33,34,35,36 . Anche con questi miglioramenti aggiunti alla valutazione istomorfometrica, la tecnica è relativamente laboriosa, in particolare per studi su larga scala e ad alto rendimento. I dati raccolti potrebbero non essere riproducibili e comparabili tra gli studi a causa delle differenze negli schemi di conteggio, negli algoritmi informatici e nel software utilizzato.

Recentemente, accelerata dallo sviluppo di nuovi metodi di microscopia multifotone e foglio luminoso a media risoluzione e metodi di compensazione ottica dei tessuti, le tecniche di modellazione e analisi 3D per le ovaie intatte stanno diventando il metodo di scelta per quantificare in modo efficiente il numero di ovociti e studiare la localizzazione e la dinamica delle proteine37,38. Questi metodi 3D sono in genere vantaggiosi rispetto ai metodi istologici in quanto i tessuti e gli organi sono meglio conservati e mantenuti intatti. Inoltre, l'analisi e la modellazione 3D forniscono ulteriori informazioni sulla funzione e le interazioni all'interno e tra nicchie o sottostrutture cellulari all'interno dell'organo che possono mancare nell'analisi 2D.

L'analisi 3D di interi organi richiede l'ottimizzazione dei protocolli di fissazione, immunocolorazione e clearing ottico per singoli organi, come le ovaie, senza distorsioni o danni ai tessuti. Per la microscopia ad alta risoluzione è necessaria un'ulteriore ottimizzazione del montaggio del campione per l'imaging e può dipendere dalla piattaforma di imaging disponibile. Infine, l'imaging dell'intera ovaia intatta genera una grande quantità di dati per le successive analisi computazionali. Pertanto, è necessario sviluppare metodi 3D standardizzati per il conteggio degli ovociti per studi comparativi e attraverso le fasi dello sviluppo.

Questo protocollo utilizza protocolli di immunocolorazione standard e di compensazione precedentemente riportati, concentrandosi su un approccio semplice, intuitivo e ad alto rendimento 38,39,40,41. Il protocollo è ottimizzato per analizzare un gran numero di ovaie prenatali e postnatali fino al giorno 28 postnatale (P28) e varie dimensioni di ovaie provenienti da diversi background genetici di topo. Le fasi di immunocolorazione sono simili per tutte le fasi; tuttavia, i protocolli di compensazione differiscono per le ovaie puberali a causa delle loro dimensioni maggiori, ScaleS4(0) e CUBIC per ovaie piccole e grandi, rispettivamente40,41. Inoltre, la perfusione di tutto il corpo viene eseguita nei topi P28 prima della fissazione per prevenire l'autofluorescenza dalle cellule del sangue. Un microscopio multifotone è stato costruito sulla piattaforma Leica DIVE/4Tune come alternativa alla microscopia a fogli luminosi per acquisire immagini, e per questo protocollo è stato scelto il software IMARIS 3D Visualization and Analysis con vari strumenti analitici. Questo protocollo è semplice da seguire e meno pratico, quindi consente di risparmiare tempo. Inoltre, la quantificazione degli ovociti è relativamente rapida, a seconda delle dimensioni dell'ovaio e della disposizione degli ovociti.

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Protocol

Tutti i topi utilizzati erano del ceppo genetico C57BL/6J (vedi tabella dei materiali). Questo ceppo è stato completamente sequenziato ed è standard per molti studi sulla struttura e la funzione ovarica. I topi sono stati ospitati secondo le linee guida NIH e le procedure eseguite sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Jackson Laboratory. I reagenti e le composizioni utilizzati in questo protocollo sono elencati rispettivamente nella Tabella dei materiali e nella Tabella 1.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Fissativo: Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS. Ad esempio, per 24 campioni (0,5 ml/campione = 12 mL di volume totale), aggiungere 3 mL di 16% di microscopia elettronica PFA a 9 mL di 1x PBS.
  2. Tampone di permeabilizzazione
    1. Misurare l'alcol polivinilico (PVA) in un becher di plastica da 250 ml contenente 1x PBS il giorno prima che sia necessario il tampone di permeabilizzazione. Mescolare la soluzione durante la notte per consentire al PVA di dissolversi completamente.
    2. Aggiungere boroidruro di sodio al PVA disciolto e lasciare omogeneizzare la miscela per circa 3-5 minuti. Aspettatevi che la soluzione faccia schiuma.
    3. Aggiungere Triton X-100 alla soluzione e utilizzare il buffer una volta che il Triton X-100 è stato sciolto.
      NOTA: il PVA richiede molto tempo per dissolversi (almeno 3 ore) e la penetrazione dell'anticorpo dipende da quanto bene si dissolve. Per le ovaie più grandi, è fondamentale sciogliere completamente il PVA.
  3. Buffer di blocco
    1. Misurare l'albumina sierica bovina (BSA) in un becher con 1x PBS. Mescolare la soluzione fino a quando il BSA non è sciolto.
    2. Aggiungere glicina, Triton X-100, Penicillina-streptomicina e azide di sodio. Mescolare fino a quando la soluzione si omogeneizza. Trasferire il tampone in un flacone e conservare a 4 °C. Aggiungere il normale siero di capra prima dell'uso.
  4. Tampone di lavaggio: misura il PVA in un becher contenente 1x PBS. Mescolare la soluzione durante la notte per consentire al PVA di dissolversi. Aggiungere Triton X-100 e azide di sodio. Una volta miscelato il tampone, conservarlo a 4 °C.
  5. Soluzione scaleS4(0) (pH 8.1): sciogliere il D-sorbitolo in PBS in un becher mescolando a ≤100 °C. Aggiungere l'urea alla soluzione e, una volta che l'urea si dissolve, spegnere il fuoco e lasciare che la soluzione si mescoli fino a completa dissoluzione. Aggiungere glicerolo e dimetilsolfossido e mescolare fino a quando la soluzione si omogeneizza. Conservare la soluzione a temperatura ambiente al buio.
    NOTA: La soluzione di ScaleS4(0) deve essere resa fresca il primo giorno di pulizia delle ovaie.
  6. Soluzione ScaleCUBIC-1
    1. Sciogliere l'urea in un becher contenente PBS mescolando a temperatura ≤100 °C. Misurare N,N,N′,N′-tetrakis(2-idrossipropil)etilendiammina in un becher separato, quindi aggiungere l'urea disciolta e mescolare a una temperatura di ≤100 °C fino a quando i reagenti si dissolvono completamente. Una volta che tutti i reagenti sono in soluzione, spegnere il calore e raffreddare a temperatura ambiente. Conservare al buio.
    2. Degassare la soluzione trasferendola in un pallone filtrante. Attaccare il pallone a un vuoto con tubo, coprire il pallone e accendere il vuoto fino a quando le bolle nella soluzione scompaiono. Utilizzare la soluzione dopo questo degasaggio.
      NOTA: la soluzione può essere conservata al buio per essere utilizzata per un massimo di un mese.
  7. Soluzione di saccarosio: sciogliere il saccarosio in 1x PBS; quindi degassare la soluzione prima dell'uso.
    NOTA: Preparare la soluzione fresca prima dell'uso.
  8. Soluzione ScaleCUBIC-2
    1. Sciogliere il saccarosio in un becher contenente PBS mescolando ad una temperatura ≤100 °C. Aggiungere l'urea e mescolare ad una temperatura di ≤100 °C fino a quando l'urea si scioglie. Spegnere il fuoco.
    2. Aggiungere trietanolamina e Triton X-100. Mescolare fino a quando la soluzione si omogeneizza. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e conservare al buio. Degassare la soluzione prima dell'uso.
      NOTA: la soluzione può essere conservata al buio per essere utilizzata per un massimo di un mese.

2. Dissezione e fissazione delle ovaie prenatali (Figura 1A)

  1. Accoppia femmine adulte (≥8 settimane) e maschi secondo il protocollo istituzionale approvato. Controlla i tappi vaginali ogni mattina.
    NOTA: La mattina di un tappo vaginale è designata come 0,5 giorni dopo il coito (d.p.c) o E0,5.
  2. Il giorno della dissezione, preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) e aliquote ~ 0,5 mL in tubi di microcentrifuga, posti sul lato del banco (~ 4 per femmina incinta).
    NOTA: il PFA è una sostanza pericolosa e deve essere maneggiato sotto un cappuccio chimico.
  3. Preparare tre piastre da 100 mm contenenti ~ 10 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ogni femmina incinta (per la raccolta dell'utero, per la dissezione del complesso mesonefro-ovaio e l'isolamento delle ovaie).
  4. Eutanasia delle femmine gravide che trasportano embrioni dello stadio di sviluppo preferito e procedere alla dissezione. Eutanasia non più di 1-2 femmine alla volta. Utilizzare un protocollo approvato per l'eutanasia di topi gravidi (ad esempio, esposizione a CO2 seguita da lussazione cervicale).
  5. Una volta che una femmina viene eutanasizzata, spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Usando la pinza, sollevare la pelle addominale e usare le forbici per fare un'incisione a forma di V attraverso l'addome e la parete del corpo. Tagliare lungo i due lati dell'incisione e staccare la pelle per esporre gli organi interni e i feti nell'utero.
  6. Con pinze e forbici, tagliare e separare l'utero con i feti dal grasso addominale e dalle arterie e dalle vene ovariche. Rimuovere l'utero e metterlo in una piastra da 100 mm contenente 1x PBS. Rilasciare i feti in PBS tagliando la parete uterina e perforando il sacco vitellino. Tagliare il cordone ombelicale.
    NOTA: Per i feti di età inferiore ai 15 giorni di gestazione, l'eutanasia della madre e la rimozione dall'utero assicurano una rapida morte del feto. I feti di età superiore a 15 giorni dalla gestazione alla nascita devono essere sottoposti a eutanasia per decapitazione.
  7. Trasferire un feto in una nuova piastra con 1x PBS fresco. Per decapitare un feto E15.5, appuntare delicatamente i due arti posteriori sulla piastra con una pinza per immobilizzare il feto. Usando un secondo paio di pinze tenute nella mano dominante, tenere il collo tra i rebbi della pinza e stringere per tagliare la testa del feto, o usare le forbici per tagliare il collo.
  8. Con la pinza a mano dominante, tagliare sotto gli arti anteriori e tirare via delicatamente la parte superiore del corpo. Quindi, inserire un punto finale della pinza della mano dominante nella cavità peritoneale verticalmente nell'apertura della regione addominale mentre l'altro punto finale della pinza rimane all'esterno. Chiudi la pinza, pizzica la parete del corpo per tagliarla ed esponi gli organi interni.
  9. Con la stessa pinza, rimuovere delicatamente gli organi, compresi l'intestino e il fegato, fino a quando il rene e gli organi riproduttivi diventano visibili. Determinare il sesso del feto: a E15.5, le ovaie hanno una forma allungata simile a una salsiccia mentre i testicoli sono ovali.
    NOTA: Nelle fasi precedenti, la genotipizzazione può essere necessaria per determinare il sesso.
  10. Usando un paio di pinze, tenere il feto femminile verso il basso e usare l'altra pinza per afferrare ogni complesso mesonefro-ovaio e separarlo delicatamente dai reni e dai dotti mülleriani. Posizionare le ovaie in una nuova piastra con 1x PBS, lasciare il mesonefro attaccato, ma rimuovere i tessuti circostanti per garantire che le ovaie siano esposte. Posizionare entrambe le ovaie in ~ 0,5 ml di PFA al 4% in tubi di microcentrifuga e fissare a 4 °C durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il PFA con il 70% di etanolo.
  11. Per la dissezione e la fissazione delle ovaie E18.5, separare i feti dall'utero come descritto sopra e quindi seguire il protocollo per i cuccioli prepuberali descritto nel paragrafo 3 (Figura 1B).

3. Dissezione e fissazione delle ovaie prepuberali (Figura 1B)

  1. Preparare il 4% di PFA e l'aliquota ~ 0,5 mL in tubi da 1,5 ml e posizionarli sul lato del banco (~ un tubo per cucciolo). Preparare piastre da 35 mm con 1x PBS (~uno per cucciolo). Eutanasia dei cuccioli utilizzando il protocollo istituzionale approvato.
    NOTA: La decapitazione è il metodo preferito di eutanasia per i topi di età pari o inferiore a 8 giorni. I topi neonatali possono essere decapitati usando forbici da 3-4 "di dissezione o forbici Mayo da 5-7".
  2. Determina il sesso dei cuccioli misurando la distanza anogenitale, che è maggiore nei maschi che nelle femmine. Usa forbici da decapitazione affilate per decapitare i cuccioli femmina. Posizionare il corpo, con il lato aperto verso il basso, su un tovagliolo di carta per drenare il sangue (~ 5-10 s).
  3. Fissare il cucciolo sulla schiena posizionando un perno nella zampa di ciascun piede. Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Usa la pinza per tenere la pelle del cucciolo lontano dal corpo e usa le forbici per fare una piccola incisione a forma di V nella pelle del basso addome.
  4. Inserire le forbici nell'incisione sotto la pelle e tagliare lungo entrambi i lati dell'addome. Utilizzare la pinza per staccare delicatamente la pelle e rivelare l'addome inferiore. Spostare delicatamente l'intestino verso l'alto e individuare le corna uterine vicino alla vescica. Seguire ogni corno uterino verso il rene e localizzare l'ovaio con il tessuto adiposo circostante sotto ogni rene.
  5. Per sezionare le ovaie, tenere il corno uterino sotto l'ovaio e l'ovidotto con un paio di pinze (pinza A, Figura 1B) e sollevarlo delicatamente lontano dal corpo. Usando un altro paio di pinze (pinza B), afferrare delicatamente sotto il primo paio di pinze in modo che l'ovaio e l'ovidotto nella piattaforma adiposa siano visibili sopra la seconda coppia di pinze. Quindi, tagliare sotto il secondo paio di pinze con le forbici o tirare con cura per staccare le ovaie e i tessuti attaccati.
  6. Posizionare gli organi isolati in una piastra con 1x PBS. Tagliare via il tessuto adiposo extra, l'ovidotto e il corno uterino per pulire e isolare l'ovaio. Aprire delicatamente la borsa che circonda l'ovaio ed esporre l'intera ovaia.
  7. Tagliare la membrana della borsa senza danneggiare l'ovaio e lasciare il tessuto intorno all'ilo (struttura simile a un legamento tra l'ovaio e il tratto riproduttivo) per gestire l'ovaio, come mostrato nella Figura 1B, P5. Una volta che le ovaie sono state tagliate, metterle in PFA al 4% e fissare le ovaie a 4 °C durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il 4% di PFA con il 70% di etanolo e conservare le ovaie a 4 °C fino alla fase del protocollo immunocolorante.

4. Perfusione, dissezione e fissazione delle ovaie puberali (Figura 1C)

  1. Perfondere i topi secondo protocolli approvati istituzionalmente con il topo in anestesia profonda in una cappa chimica. Preparare l'attrezzatura e i reagenti di perfusione. Vedi il protocollo dettagliato a 42.
    NOTA: La perfusione è una procedura terminale di eutanasia che sostituisce il sangue in tutto il sistema vascolare con un fissativo tissutale.
  2. Pesare un topo femmina puberale (P28) e registrare il peso del topo (in genere tra 13 g e 15 g). Calcolare la quantità dell'agente di anestesia approvato da utilizzare.
    NOTA: Qui, 0,35 ml di tribromoetanolo per 10 g di peso corporeo sono stati utilizzati in questo protocollo.
  3. Utilizzare una siringa monouso da 10 ml con un ago da 20 G per riempire la siringa con l'agente anestetico approvato. Sostituire l'ago da 20 G con un ago da 26 G x 3/8.
  4. Trattenere con attenzione il mouse scruffando la pelle del collo dorsale con una mano. Gira il mouse per esporre l'addome. Iniettare la quantità precedentemente calcolata di anestetico nella cavità peritoneale. Posizionare il mouse in un contenitore con un coperchio fino a quando l'anestesia non ha effetto (cioè, il mouse non si muove più).
  5. Una volta che il mouse smette di muoversi, pizzicare delicatamente i piedi per verificare che non vi sia alcuna risposta e assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato prima di iniziare la perfusione. Posiziona e fissa il mouse sulla schiena bloccando delicatamente tutte e quattro le gambe attraverso le zampe su una tavola. Assicurati che le gambe siano bloccate in una posizione rilassata, non troppo tesa.
  6. Spruzzare il topo con il 70% di etanolo dall'addome alla regione del torace. Utilizzare una pinza per pizzicare delicatamente e sollevare la pelle addominale e quindi utilizzare le forbici per effettuare un piccolo taglio a forma di V attraverso la pelle e la parete del corpo.
  7. Sollevare il lembo della pelle dalla cavità del corpo e inserire le forbici sotto la pelle e la parete del corpo. Tagliare la pelle e la parete del corpo dritto verso la testa fino al bordo della cavità toracica allo sterno.
  8. Aprire la cavità toracica tagliando con cura le costole su entrambi i lati dello sterno appena sotto la scapola. Fare attenzione a non perforare i polmoni sotto la gabbia toracica. Afferrare i lembi di pelle / costole con una pinza e fissarli per esporre gli organi interni.
  9. Tagliare delicatamente qualsiasi tessuto, come il timo, che può ostacolare un chiaro accesso al cuore. Esporre tutti gli organi, compreso il tratto gastrointestinale, per consentire la conferma visiva che tutto il corpo è perfuso, compreso l'addome inferiore.
  10. Utilizzare le forbici per dissezione per tagliare l'atrio destro del cuore e rilasciare il sangue dal sistema. Tenere delicatamente il cuore con una pinza e inserire un ago di perfusione (collegato a un controller della pompa peristaltica) nel ventricolo sinistro.
  11. Pompa ~ 10 ml di PBS, con una pressione delicata ma costante, fino a quando tessuti come fegato, reni e tratto riproduttivo (Figura 1E, F) diventano da rosa a bianchi. Quindi, sostituire il PBS con PFA all'1% appena prodotto e continuare la perfusione con circa 10 ml di PFA o fino a quando non si verificano contrazioni nella parte inferiore del corpo del topo (ad esempio, coda).
    NOTA: Questi tremori di fissazione indicano una perfusione riuscita.
  12. Una volta completata la perfusione, individuare il cuscinetto di grasso con le ovaie sotto il rene e sezionare delicatamente l'intero tratto riproduttivo, compresi il cuscinetto di grasso, le ovaie e le corna uterine, e posizionare il tratto in una fiala con il 4% di PFA. Fissare le ovaie a temperatura ambiente durante la notte (~ 16-24 ore). Quindi, sostituire il PFA al 4% con etanolo al 70% per almeno un giorno e tagliare le ovaie (Figura 1E, F), come descritto sopra, prima di iniziare il protocollo di immunocolorazione.

5. Immunocolorazione dell'ovaio a montaggio intero (Figura 2A)

NOTA: Praticare tecniche sterili durante il protocollo di immunocolorazione, specialmente quando si cambiano i tamponi, per prevenire la contaminazione durante lunghi periodi di incubazione.

  1. Eseguire tutte le fasi di immunocolorazione in una piastra a 24 pozzetti, come mostrato nella Figura 2A. Regolare i volumi dei reagenti per altri formati. Cambiare attentamente i tamponi per evitare di perdere piccole ovaie prenatali e prepuberali.
    NOTA: è possibile utilizzare altri formati, come piastre a 48 e 96 pozzetti, ma i pozzetti più profondi e le aperture più strette rendono difficile aspirare i tamponi senza perdere o danneggiare le ovaie.
  2. Giorno 1
    1. Pipetta 1 mL di PBS/pozzo nel numero di pozzetti necessari in una piastra pulita a 24 pozzetti. Tagliare la punta di una punta della pipetta da 200 μL per creare un'ampia apertura e utilizzarla per trasferire delicatamente le ovaie prepuberali da tubi da 1,5 ml con etanolo al 70% nei pozzetti. Per le ovaie puberali, utilizzare una punta della pipetta da 1000 μL con la punta tagliata per il trasferimento.
      NOTA: l'apertura più ampia della punta previene danni ai tessuti durante il trasferimento.
    2. Una volta che tutti i campioni sono stati trasferiti nei pozzetti, utilizzare una nuova punta per aspirare il PBS e sostituirlo con 0,8 ml di PBS/pozzetto fresco. Incubare i campioni a temperatura ambiente su uno shaker a ~ 100-150 giri / min durante la notte. Iniziare la preparazione del tampone di permeabilizzazione (vedere Tabella 1 e paragrafo 1).
      NOTA: La nuova punta impedisce alle ovaie di attaccarsi alla punta e la fase di incubazione PBS consente alle ovaie di equilibrarsi in PBS e reidratarsi prima della colorazione.
  3. Giorno 2
    1. Completare la preparazione del tampone di permeabilizzazione. Aspirare PBS dai pozzetti e sostituirlo con 0,8 ml del tampone di permeabilizzazione per pozzetto. Riposizionare le piastre sullo shaker e incubare i campioni a temperatura ambiente per 4 ore.
    2. Dopo 4 ore di incubazione, aspirare completamente il tampone di permeabilizzazione e sostituirlo con 0,5 mL di tampone di blocco (vedere Tabella 1 e paragrafo 1). Sigillare la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione, metterla in un contenitore ben coperto su uno shaker e incubare i campioni con una delicata agitazione in tampone di blocco durante la notte (16-24 h) a temperatura ambiente.
  4. Giorno 3
    1. Preparare gli anticorpi primari mediante diluizione nel tampone di blocco. Per visualizzare gli ovociti, utilizzare marcatori ovocitari, ad esempio peptidasi acida nucleare anti-cellule germinali di ratto (GCNA)/TRA98 per le ovaie prenatali e prepuberali e coniglio anti-DEAD-box elicasi 4 (DDX4)/omologo vasa di topo (MVH) per le ovaie prepuberali e puberali. Per quantificare l'espressione di LINE-1 ORF1p nelle ovaie prenatali, utilizzare l'anti-LINE-1 ORF1p di coniglio o un altro anticorpo disponibile.
      NOTA: il segnale GCNA/TRA98 non è rilevabile nelle ovaie puberali.
    2. Aspirare il tampone bloccante dai campioni e sostituirlo con 0,5 ml di anticorpi primari diluiti. Sigillare la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione. Posizionare le piastre in un contenitore con un coperchio per evitare l'essiccazione dei campioni durante l'incubazione. Posizionare il contenitore sullo shaker e incubare i campioni per 3-4 giorni a temperatura ambiente.
  5. Giorno 7
    1. Rimuovere delicatamente il parafilm dalle piastre e aspirare la miscela di anticorpi primari dai campioni. Conservare le miscele di anticorpi primari a 4 °C (per un massimo di un mese o tre usi) e riutilizzarle successivamente integrandole con anticorpi freschi (ad esempio, 2 μL di aliquota di anticorpi freschi per 5 ml della miscela precedentemente utilizzata).
    2. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio (vedere Tabella 1 e paragrafo 1) per pozzetto ai campioni e scuotere delicatamente le piastre per alcuni secondi per risciacquare via gli anticorpi residui. Aspirare e sostituire con cura il tampone di lavaggio con 0,8 ml di tampone di lavaggio fresco e agitare le piastre a temperatura ambiente durante la notte.
  6. Giorno 8
    1. Aspirare il tampone di lavaggio notturno, sostituirlo con 0,8 ml di tampone di lavaggio fresco e agitare a temperatura ambiente per 2 ore. Ripetere la fase di lavaggio con tampone di lavaggio fresco per altre 2 ore.
    2. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il tampone di lavaggio con 0,5 mL di miscele di anticorpi secondari diluiti in un tampone bloccante, ad esempio Alexa Fluor 555 anti-ratto di capra e Alexa Fluor 647 anti-coniglio di capra a 1:1.000 diluizione. Preparare la miscela di anticorpi secondari fresca per ogni esperimento di immunocolorazione.
    3. Sigillare la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione durante l'incubazione. Incubare i campioni a temperatura ambiente al buio o in piastre ricoperte di foglio di alluminio con agitazione delicata per 3 giorni.
      NOTA: Questo passaggio e tutti i passaggi successivi si svolgono al buio o con un involucro di alluminio.
  7. Giorno 11
    1. Aspirare la miscela di anticorpi secondari ed eseguire un lavaggio iniziale con 1 mL di tampone di lavaggio. Scuotere delicatamente le piastre per alcuni secondi per risciacquare via gli anticorpi secondari residui.
    2. Aspirare il tampone di lavaggio, sostituirlo con 0,8 ml di tampone di lavaggio fresco e incubare i campioni a temperatura ambiente per 2 ore con agitazione, al riparo dalla luce. Ripetere la fase di lavaggio 2 volte per un totale di 3 lavaggi. Dopo il terzo lavaggio, procedere alla fase di sgombero (sezione 6).

6. Eliminazione delle ovaie immunocolorate a monte intero (Figura 2A).

NOTA: eseguire tutte le fasi di pulizia al buio avvolgendo le piastre in un foglio di alluminio o posizionandole in contenitori opachi. Le fasi di compensazione differiscono per le ovaie prepuberali e puberali.

  1. Giorno 11 [Le ovaie prenatali e prepuberali vengono eliminate in un protocollo in un unico passaggio]
    1. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare il tampone di lavaggio e sostituirlo con 0,8 mL di soluzione ScaleS4(0) appena prodotta (vedere Tabella 1 e paragrafo 1). Sigillare la piastra con parafilm e incubare i campioni al buio scuotendo a temperatura ambiente per tre o quattro giorni prima dell'imaging.
    2. Sostituire la soluzione ScaleS4(0) con una soluzione nuova ogni giorno, se necessario; Fare attenzione durante la sostituzione delle soluzioni, poiché le ovaie ripulite diventano trasparenti e sono difficili da vedere. Dopo la cancellazione, procedere alla configurazione del campione e all'imaging (paragrafo 7).
      NOTA: la modifica delle soluzioni non ha migliorato significativamente la qualità dell'immagine. Le modifiche giornaliere aumentano la probabilità di perdere campioni piccoli e per lo più trasparenti.
  2. Giorni 11-15 [Le ovaie puberali vengono eliminate in un protocollo in due fasi]
    1. Dopo l'ultimo lavaggio immunocolorante, aspirare il tampone di lavaggio e sostituirlo con 0,8 mL di ScaleCUBIC-1 (vedere Tabella 1 e paragrafo 1). Sigillare la piastra con parafilm e agitare delicatamente i campioni a 37 °C per 3 giorni al buio. Sostituire la soluzione ScaleCUBIC-1 con la soluzione fresca ogni giorno.
    2. Il giorno 15, lavare i campioni 3 volte per 10 minuti ogni volta in 0,8 ml di PBS a temperatura ambiente con un leggero scuotimento. Sostituire il PBS con 0,8 ml di saccarosio degassato al 20% preparato appena con PBS. Agitare delicatamente a temperatura ambiente per 1 ora.
    3. Sostituire la soluzione di saccarosio al 20% con 0,8 mL di soluzione ScaleCUBIC-2 (vedere Tabella 1 e paragrafo 1), sigillare la piastra con parafilm e agitare delicatamente a temperatura ambiente con variazioni giornaliere della soluzione ScaleCUBIC-2. Cancella per 4-5 giorni e procedi all'immagine. Prestare attenzione quando si scambiano soluzioni per evitare la perdita del campione poiché le ovaie eliminate sono trasparenti e difficili da vedere. Procedere alla configurazione del campione e all'imaging (sezione 7).

7. Configurazione del campione e imaging con un microscopio multifotone

NOTA: Tutti i passaggi descritti di seguito sono stati eseguiti con un Leica DIVE/4TUNE/FALCON con due laser multifotoni Ti:Sapphire bloccati in modalità sintonizzabile con una durata dell'impulso di 120 fs con un obiettivo multi-immersione 16x/NA0.6 (liquido di immersione = glicerolo) con una distanza massima di lavoro di 2,2 mm. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul software di acquisizione delle immagini. La tabella supplementare S1 e la figura supplementare S1 mostrano le impostazioni utilizzate per questo protocollo. Per altre piattaforme di imaging, consultare il nucleo di microscopia o seguire le specifiche / raccomandazioni dei produttori.

  1. Configurazione di esempio
    1. Preparare la configurazione per il montaggio dei campioni. Ad esempio, utilizzare una guarnizione in silicone appiccicosa e flessibile per creare un pozzetto adesivo. Posizionare il pozzetto adesivo su un micro coverslip n. 1,5 da 25 mm x 25 mm per creare un pozzo in cui verranno posizionate le ovaie (Figura 2B).
      NOTA: Una guarnizione di 1 mm di spessore può ospitare ovaie di tutte le dimensioni. Questa configurazione è consigliata in quanto elimina il movimento ovarico durante l'imaging, che può verificarsi quando le ovaie sono poste in montante in un piatto con fondo di vetro.
    2. Utilizzando una punta della pipetta con la punta tagliata (20 μL per prenatale e prepuberale), trasferire le ovaie con ~5-10 μL di soluzione ScaleS4(0) nel mezzo del pozzo adesivo come mostrato nella Figura 2B. Per le ovaie puberali, utilizzare una punta della pipetta da 200 μL con la punta tagliata abbastanza lontano da trasferire le ovaie. Aggiungere ~15-20 μL della soluzione ScaleCUBIC-2 al centro del pozzetto adesivo.
      NOTA: troppa soluzione può causare perdite sul palco del microscopio e una soluzione troppo scarsa si tradurrà in una scarsa qualità dell'immagine. Utilizzare un microscopio a dissezione per trasferire campioni man mano che le ovaie cancellate diventano trasparenti e sono difficili da vedere.
    3. Una volta che le ovaie vengono trasferite nei singoli pozzetti con una goccia di soluzione di compensazione, posizionare delicatamente un altro vetro di copertura sul pozzetto adesivo, premere per creare un sigillo e mantenere i campioni in posizione in una piccola piscina di soluzione di compensazione inserita tra i due coperchi (Figura 2B). Per l'imaging, posizionare il "sandwich" coverslip in un vetrino adattatore per microscopio stampato in 3D (ad esempio, 43 ).
      NOTA: I pozzetti adesivi sono riutilizzabili dopo aver decostruito il "sandwich" e lavato con acqua.
  2. Imaging (Tabella supplementare S1 e Figura supplementare S1)
    1. Accendere il microscopio e il software secondo le linee guida del nucleo di microscopia o del produttore. Posizionare i campioni montati sul palco del microscopio e guardare attraverso l'oculare per individuare il campione illuminato con una lampada a fluorescenza a LED a bassa potenza.
    2. Una volta individuati i campioni, accendi i laser e assegna ogni rilevatore a uno specifico colorante/marcatore Alexa Fluor. Per più laser, consentire l'acquisizione sequenziale delle immagini. Acquisire l'intero stack prima di cambiare laser.
      NOTA: per questo protocollo, è stato utilizzato un laser per l'acquisizione di immagini di fluorofori da 555 nm e 647 nm.
    3. Impostare i parametri per l'acquisizione delle immagini in base alle specifiche del nucleo di microscopia o del produttore. Utilizzare l'acquisizione bidirezionale delle immagini, se disponibile, per ridurre i tempi di scansione e migliorare l'efficienza. Regolate altre impostazioni, tra cui la media delle linee (1), la media dei fotogrammi (1) e l'accumulo dei fotogrammi (1).
      NOTA: l'acquisizione bidirezionale delle immagini consente ai laser di eseguire la scansione in entrambe le direzioni mentre si muovono sull'asse X.
    4. Impostare lo Z-Stack identificando l'inizio (parte inferiore del coperchio di vetro campione/inferiore) e la posizione finale (parte superiore del coperchio di vetro campione/superiore). Selezionare una dimensione Z-step di 2 μm per le ovaie prepuberali e 5 μm per le ovaie puberali.
    5. Attivate la funzione di compensazione Z e, all'interno di questa funzione, attivate il guadagno di eccitazione. Impostare la compensazione Z per la parte inferiore e superiore del campione selezionando un'intensità laser sia per la pila inferiore (bassa intensità) che per quella superiore (alta intensità). Vedere figura supplementare S1, Compensazione lineare Z, dove è selezionata la casella di guadagno di eccitazione e l'intensità laser per la parte inferiore (0) e superiore (347,75) è impostata rispettivamente su 10 e 12.
    6. Utilizzare la modalità di piastrellatura per campioni più grandi che non possono essere acquisiti in un singolo campo visivo. Attivare il navigatore immagini e indicare il numero di tessere necessarie per acquisire l'intero campione utilizzando lo strumento di marcatura rettangolare.
    7. Avviare l'acquisizione dell'immagine. Per le immagini con più riquadri, avviare l'acquisizione delle immagini con il navigatore per acquisire tutti i riquadri. Una volta completata l'acquisizione delle immagini, salva prima tutte le immagini e, se sono state acquisite più tessere, esegui lo strumento di unione dei mosaici per unire le tessere in un'unica immagine.
    8. Salvare i file uniti in una cartella di progetto separata per semplificare l'utilizzo delle immagini di dimensioni Gigabyte. Trasferisci i file per l'elaborazione delle immagini con il software di visualizzazione e analisi delle immagini 3D. La Figura 3 mostra immagini rappresentative scattate in fasi diverse con due marcatori (GCNA e DDX4).

8. Elaborazione delle immagini

NOTA: Tutti i passaggi descritti di seguito sono stati sviluppati ed eseguiti utilizzando il software di visualizzazione e analisi delle immagini 3D IMARIS.

  1. Importare le immagini nel software di visualizzazione e analisi delle immagini 3D e, se necessario, convertire i file dal formato originale (ad esempio, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) al formato .ims.
  2. Se necessario, elaborare le immagini con il filtro gaussiano per ridurre la pixelizzazione (Figura 4A). Utilizzando la funzione di visualizzazione 3D , posizionate l'immagine e deselezionate l'opzione della cornice (per rimuovere la cornice).
    NOTA: Ci sono altri filtri opzionali, che possono anche essere utilizzati per ridurre la pixelizzazione e ridurre l'intensità dello sfondo.
  3. Ingrandire l'immagine a una scala specifica e utilizzare la funzione Snapshot. Impostare le preferenze come segue: selezionare 300 DPI, salvare come immagine TIFF e Sfondo trasparente. Scatta un'istantanea dell'immagine e salvala. La Figura 3 mostra immagini assemblate complete.

9. Quantificazione degli ovociti

NOTA: l'immunofluorescenza dell'ovaio intero e la visualizzazione e l'analisi delle immagini 3D possono essere utilizzate per la stima del numero di ovociti in ovaie intere (Figura 3 e Figura 4) utilizzando la funzione Spot. Il segnale GCNA può essere utilizzato per quantificare gli ovociti nelle ovaie prenatali e prepuberali, come mostrato nella Figura 4 (P5). Nelle ovaie puberali, utilizzare il segnale DDX4 per quantificare due popolazioni di ovociti in follicoli non in crescita (struttura "ad anello", freccia chiusa) e follicoli in crescita (grandi strutture, freccia aperta, Figura 4, P28).

  1. Determinare la dimensione degli ovociti che verranno utilizzati come parametro per quantificare gli ovociti con la funzione Macchie nel passaggio 9.2.
    1. Aprire l'immagine e selezionare l'opzione Slice per aprire l'immagine Z-stack.
    2. Selezionate l'opzione Linea nel pannello Misura e misurate la distanza disegnando una linea da uno spigolo di un ovocita/marcatore all'altro bordo nel punto più largo per determinare il diametro XY del tipo/dimensione dell'ovocita da contare. Spostarsi attraverso la pila e ottenere la gamma di diametri per più ovociti dello stesso tipo. Utilizzare la lunghezza più breve come criterio di selezione delle dimensioni per la conta degli ovociti.
  2. Funzione Spot : selezionate l'opzione Vista 3D e attivate la funzione Aggiungi nuovi spot nel pannello Scena per aprire il pannello Algoritmo . Deseleziona tutte le impostazioni dell'algoritmo poiché verrà utilizzato il filtro di selezione delle dimensioni con la dimensione dell'ovocita ottenuto nel passaggio 9.1.
    1. Fare clic sulla singola freccia in avanti per passare al canale sorgente. Selezionate il canale con il marcatore preferito e digitate il diametro XY stimato ottenuto al passaggio 9.1. Ad esempio, utilizzare un diametro XY stimato di 7 μm per gli ovociti prenatali e 11 μm per gli ovociti P5 (GCNA = segnale verde; Figura 3 e Figura 4A).
    2. Utilizzare 30 μm per il segnale DDX4 per stimare il numero di ovociti nei follicoli in crescita nelle ovaie P5 (DDX4 = segnale magenta; Figura 3 e Figura 4A). Per le ovaie puberali, utilizzare il segnale DDX4 per le quantificazioni degli ovociti. Ad esempio, utilizzare diametri XY di 15 μm e 80 μm per identificare gli ovociti all'interno di follicoli non in crescita e follicoli in crescita, rispettivamente, come mostrato nella Figura 4A.
      NOTA: la dimensione selezionata può variare a seconda dei criteri di acquisizione delle immagini e del tipo di microscopio utilizzato. La selezione può anche variare tra i ceppi genetici poiché le ovaie con più ovociti richiederanno selezioni di dimensioni più piccole per una migliore rilevazione automatizzata degli ovociti.
    3. Dopo la selezione delle dimensioni, attivate l'allungamento del modello PSF e la sottrazione dello sfondo, che vengono determinati automaticamente. Selezionate la singola freccia in avanti per passare al pannello Filtra punti . Aggiungere il filtro Qualità e determinare una soglia. Per garantire una stima accurata del numero di ovociti, ingrandire l'immagine mentre la soglia viene regolata per scegliere un valore di soglia che seleziona la maggior parte degli ovociti. Fare clic sulla doppia freccia per completare i conteggi automatici.
    4. Controllare manualmente gli ovociti selezionati utilizzando la scheda Modifica per selezionare gli ovociti persi o deselezionare le particelle non ovocitarie selezionate dalla soglia automatica. Registrare i dati nella scheda Statistiche nella scheda Generale per ulteriori analisi.
      NOTA: i parametri utilizzati per il conteggio degli spot possono essere salvati e utilizzati per un altro set di campioni, ma si consiglia di eseguire un controllo manuale prima di eseguire l'analisi batch.
    5. Per memorizzare i parametri, fare clic sulla scheda Creazione e fare clic su Memorizza parametri per batch.
      NOTA: I marcatori nucleari (ovociti GCNA+, Figura 4A) sono facilmente identificabili dalla funzione spot e potrebbero non richiedere molte regolazioni manuali. Tuttavia, il marcatore citoplasmatico (ovocita DDX4+, Figura 3 (P28, freccia chiusa) e Figura 4A) richiederà una maggiore regolazione manuale per garantire l'identificazione della dimensione / tipo corretto di ovociti.

10. Quantificare l'espressione proteica nelle ovaie

NOTA: Esistono diversi modi per quantificare l'espressione degli ovociti di marcatori specifici utilizzando sia la funzione Macchie (sezione 9 e passo 10.1) che la funzione Superfici (fase 10.2). La funzione Macchie può essere utilizzata per proteine con modelli di localizzazione distinti come i marcatori nucleari (GCNA) e la funzione Superfici può essere utilizzata per proteine con modelli di localizzazione non uniformi come mostrato nella Figura 5A in cui sono state misurate le intensità LINE-1 ORF1p nelle ovaie E15.5 ed E18.5. Per calcolare e confrontare l'intensità della proteina di interesse tra due campioni (ad esempio, timepoint, trattamenti o genotipi), raccogliere immagini con le stesse proprietà. Utilizzare campioni con un segnale più intenso per determinare i parametri che possono essere memorizzati e utilizzati per gli altri campioni.

  1. Per ottenere l'espressione proteica con la funzione Macchie , identificare prima gli ovociti come evidenziato (paragrafo 9).
    1. Quindi, sotto la funzione Spot , seleziona la scheda Statistiche , seguita dalla scheda Dettagliata . Fare clic sulla freccia in giù e selezionare Valori specifici, che aprirà un'altra scheda sotto di essa contenente misure diverse. Selezionare la media di intensità del canale utilizzato per la generazione della superficie (oppure selezionare altre misurazioni di intensità, ad esempio la mediana di intensità).
    2. Per ottenere le informazioni statistiche combinate/medie, selezionare il criterio Valori medi . Una volta fatto, esporta e salva i dati per ulteriori analisi.
  2. Per ottenere l'espressione proteica con la funzione Superfici, aprite l'immagine, selezionate l'opzione Vista 3D e attivate la funzione Aggiungi nuove superfici nel pannello Scena per aprire il pannello Algoritmo . Deseleziona tutte le impostazioni dell'algoritmo se non necessario e fai clic sulla singola freccia in avanti per passare al canale sorgente.
    1. Selezionare il canale con il segnale anticorpale da misurare. Altre proprietà da selezionare sono opzioni specifiche dell'utente. Qui, il segnale LINE-1 è stato utilizzato come marcatore. I valori Dettagli superfici e Sottrazione sfondo (contrasto locale) sono stati mantenuti ai valori predefiniti rispettivamente di 1,42 e 5,33.
    2. Fate clic sulla freccia in avanti per passare al pannello Soglia . Scegli un valore di soglia comparabile in entrambi i campioni (ad esempio, qui, l'espressione LINE-1 in E18.5 è stata utilizzata per scegliere una soglia). Selezionare Abilita con un diametro dei punti di inizializzazione predefinito pari a 7,10 (questo valore è stato trovato ottimale per le immagini, ma può dipendere dalla dimensione in pixel prevista delle feature).
    3. Fate clic sulla freccia in avanti per passare al pannello Superfici filtro(Filter Surfaces ). È stato utilizzato un filtro di qualità e basare il valore, come per il valore di soglia , sull'espressione delle proteine in entrambi i campioni di ovaio. Una volta selezionata la proprietà del filtro, fate clic sulla doppia freccia in avanti per completare la generazione della superficie.
    4. Per ottenere i valori di intensità, selezionare la scheda Statistiche , seguita dalla scheda Dettagliata . Fare clic sulla freccia in giù e selezionare Valori specifici, che aprirà un'altra scheda sotto di essa contenente misure diverse.
    5. Selezionare la media di intensità del canale utilizzato per la generazione della superficie (oppure selezionare altre misurazioni di intensità, ad esempio la mediana di intensità).
    6. Per ottenere le informazioni statistiche combinate/medie, selezionare il criterio Valori medi . Una volta fatto, esporta e salva i dati per ulteriori analisi (Figura 5C).

11. Stima del numero totale di ovociti nell'ovaio danneggiato con correzione computazionale

NOTA: Se si verifica un danno ovarico minore durante la dissezione, potrebbe essere possibile stimare computazionalmente la conta totale degli ovociti. Si raccomanda di utilizzare ovaie intatte dello stesso ceppo e stadio di sviluppo per la stima del numero di ovociti come mostrato nella Figura 6. Le simulazioni eseguite con le ovaie a E15.5 indicano che la correzione per una perdita ≥30% si traduce in una deviazione significativa dai numeri effettivi (Figura 6C).

  1. Aprire le immagini delle ovaie intatte con IMARIS e selezionare la funzione Frame . In Impostazioni fotogramma, selezionate le etichette Casella, Griglia, Segni di spunta e Asse . Nella scheda Posizione X/Y/Z selezionare 200 μm per generare segni di graduazione con spazi di 200 μm in tutte le posizioni X/Y/Z.
    NOTA: i segni di graduazione creano una griglia/righello nei piani X, Y e Z per identificare gli ovociti all'interno di una regione specifica.
  2. Attivare la funzione Macchie per identificare gli ovociti come evidenziato nella sezione 9 (Figura 4). Create un modello 3D utilizzando gli ovociti identificati in tutte le ovaie intatte utilizzate per la simulazione selezionando Sfera nella scheda Stile punti/Qualità (Points Style/Quality ) della feature Spot (Spots ).
    NOTA: la larghezza dei pixel può essere modificata anche nella scheda Stile/Qualità punti .
  3. Con la scatola generata nel passaggio 11.1, allineare i modelli 3D delle ovaie intatte con lo stesso orientamento mostrato nella Figura 6A.
  4. Utilizzando i segni di spunta da 200 μm (passo 11.1), selezionare gli ovociti che rientrano nel 50% del volume di ciascuna ovaia. Fare clic sulla funzione Macchie e selezionare Modifica etichette per classificare gli ovociti che rientrano nella regione del 50% per colore, come mostrato nella Figura 6A.
    NOTA: Una volta che gli ovociti sono classificati in una regione, verrà fornito il numero di ovociti che rientrano in ciascuna classe.
  5. Ingrandisci la regione del 50% e cambia i segni di graduazione da 200 μm a 50 μm per creare un righello più piccolo per l'identificazione degli ovociti. Mantenere la % di zoom in tutte le immagini. Con i segni di spunta da 50 μm come guida, dividere la regione del 50% in cinque parti uguali.
    NOTA: gli ovociti all'interno di ciascuna parte rappresenteranno il 10% del volume come evidenziato nella Figura 6A, dove un'ovaia intatta mostra ovociti nella metà superiore dell'ovaio classificati da cinque diversi colori con ogni colore che rappresenta gli ovociti all'interno di una regione volumetrica del 10%.
  6. Registrare il numero di ovociti in ogni regione del 10% come mostrato nella Figura 6A,B. Calcola il numero medio di ovociti per incrementi del 10, 20, 30, 40 e 50%.
  7. Utilizzare l'evidenziato nei passaggi da 11.1 a 11.6 per ottenere il numero di ovociti nell'ovaio parziale danneggiato. Posizionare l'ovaio danneggiato nello stesso orientamento delle ovaie intatte e stimare il volume/percentuale mancante come descritto sopra.
  8. Per stimare il numero totale di ovociti nell'intera ovaia, aggiungere il numero medio di ovociti calcolato per un volume simile al numero ottenuto dall'ovaio parziale (Figura 6B).

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Representative Results

L'immunocolorazione e l'imaging dell'intera ovaia consentono la visualizzazione e la quantificazione dell'espressione di ovociti o proteine nelle ovaie in diversi stadi di sviluppo utilizzando la stessa tecnica e marcatori (Figura 3). Questo protocollo è stato sviluppato per un progetto su larga scala in cui era richiesta l'analisi delle ovaie in più fasi e da più ceppi di topo. Qui presentiamo i dati raccolti per il ceppo C57BL6/J, un ceppo standard per l'analisi genetica. La tecnica qui presentata è semplice, i risultati possono essere ottenuti entro 14-19 giorni (Figura 2D) e possono essere utilizzati per le ovaie di femmine prenatali, prepuberali e puberali (Figura 1 e Figura 2A, B).

Questo approccio è stato utilizzato per studiare la dinamica della perdita di ovociti che si verifica naturalmente durante la formazione della riserva ovocitaria ovarica. In molti organismi, incluso il topo, si pensa che il numero di ovociti raggiunga il picco durante la vita fetale nel periodo in cui gli ovociti entrano nella meiosi ~ E13.5. Il numero di ovociti diminuisce a causa del processo ancora non completamente compreso di attrito degli ovociti fetali (FOA) (da ~E15,5 a E18,5), che è stato meccanicamente collegato all'espressione del retrotrasposone LINE-120,21. Più ovociti vengono eliminati dopo E18,5 a P0 a causa dell'eliminazione di ovociti anormali da un checkpoint di qualità meiotica22,23. Per studiare questi processi utilizzando questo protocollo, abbiamo immunocolorato e ripreso le ovaie in diversi stadi di sviluppo utilizzando DDX4 e GCNA come marcatori ovocitari come mostrato nella Figura 3.

Piccoli ovociti che esprimono GCNA e DDX4 sono visti da E15.5 in poi e rappresentano ovociti durante MPI o arrestati al dictyate all'interno dei follicoli primordiali. Ovociti in crescita più grandi con forte espressione di DDX4 sono già rilevati nelle ovaie P2 dove molto probabilmente rappresentano la prima ondata di follicoli44. Un numero crescente di ovociti più grandi si osserva nelle ovaie P5 e P28. Le immagini ottenute al microscopio multifotone (Figura 4A) sono state elaborate utilizzando il software IMARIS ed è stato eseguito il rendering 3D per identificare ovociti in crescita piccoli e più grandi in base al segnale GCNA nucleare e alla dimensione delineata dal segnale DDX4 (Figura 4A e Video 1). Gli ovociti sono stati contati come descritto nel protocollo e i risultati sono riassunti nella Figura 4B. In accordo con studi precedenti, abbiamo osservato una significativa perdita di ovociti da E15,5 a E18,5 (~ 32%) e da E18,5 a P2 (~ 24%). Quando le femmine raggiungono la pubertà (P28), solo circa il 30% degli ovociti presenti a E15,5 sono sopravvissuti.

Questo metodo può essere utilizzato anche per osservare le conseguenze di trattamenti genotossici come l'irradiazione, che ha dimostrato di eliminare completamente la riserva follicolare primordiale entro una settimana 23,38,45. Una differenza visiva significativa è evidente tra l'intera ovaia trattata con radiazioni e il controllo non trattato nella Figura 3 (confrontando le ovaie P28 di femmine trattate e non trattate). Nell'ovaio P28 senza esposizione alle radiazioni, abbiamo osservato due popolazioni di ovociti etichettate con DDX4; abbondanti piccoli ovociti nei follicoli primordiali (freccia chiusa); e ovociti più grandi di varie dimensioni che si trovano tipicamente nei follicoli in crescita (ad esempio, primario, secondario e preantrale) (Figura 3). Al contrario, l'ovaio di una femmina esposta a 0,5Gy di radiazione γ a P7 è completamente priva di piccoli ovociti nei follicoli primordiali come precedentemente osservato nelle sezioni 2D. È interessante notare che solo ovociti più grandi di dimensioni simili sono sopravvissuti alle radiazioni; questi potrebbero essere i primi follicoli d'onda già in crescita nell'ovaio P7, in quanto sono noti per essere resistenti alla radiazione46 (Figura 3, P28).

Oltre alla quantificazione del numero di ovociti, questo protocollo può essere utilizzato per l'immunocolorazione e le analisi quantitative di altre proteine coinvolte nello sviluppo degli ovociti. Ad esempio, abbiamo usato anticorpi contro la proteina LINE-1ORF1p, una proteina chaperone legante l'RNA, prodotta da retrotrasposoni LINE-1 (Figura 5). L'aumento dell'abbondanza di elementi LINE-1 da E15.5 a E18.5 è stato proposto per causare l'eliminazione degli ovociti20,21. Infatti, utilizzando immagini catturate da multifotoni e analisi dell'intensità del segnale in IMARIS, i livelli di LINE-1 ORF1p sono stati osservati aumentare significativamente negli ovociti durante questo periodo, il che è correlato a un calo significativo del numero di ovociti come mostrato nella Figura 4B.

In circostanze in cui una parte di un'ovaia è danneggiata o persa, le ovaie dello stesso ceppo e dello stesso stadio di sviluppo possono essere utilizzate per stimare computazionalmente il numero di ovociti all'interno della regione mancante come mostrato nella Figura 6. I dati delle ovaie E15.5 sono stati utilizzati per simulazioni per testare l'accuratezza delle correzioni computazionali. Gli ovociti nelle ovaie con un danno tissutale fino al 30% possono essere stimati computazionalmente per avere una deviazione del ≤10% rispetto agli ovociti in un'ovaia intatta, suggerendo che la colorazione e la modellazione delle ovaie 3D possono essere efficacemente utilizzate per salvare i dati da tessuti preziosi. Le simulazioni eseguite con le ovaie a E15.5 indicano che la correzione per una perdita ≥30% si traduce in una deviazione significativa dai numeri effettivi (Figura 6C).

Figure 1
Figura 1: Dissezione ovarica e perfusione da femmine da fasi prenatali e postnatali. (A-C) La dissezione ovarica da diversi stadi richiede tecniche diverse, che sono rappresentate schematicamente per integrare le descrizioni nel video. (D) Le ovaie al giorno 5 postnatale (P5) sono molto più piccole rispetto a P28, il che richiede un protocollo di compensazione diverso come descritto nel protocollo. (E,F) La corretta perfusione delle ovaie è importante per eliminare la colorazione di fondo dai globuli rossi. I tratti riproduttivi non perfusi e le ovaie hanno una tonalità rosa mentre gli organi perfusi diventeranno bianchi. Abbreviazione: RI = tratti riproduttivi non perfusi. Le immagini A-C sono state create con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immunocolorazione, clearing e imaging di intere ovaie di topo. (A) Il diagramma di flusso illustra i passaggi condivisi e specifici per l'immunocolorazione e il protocollo di compensazione per le ovaie prenatali / prepuberali e puberali. (B) Le ovaie ripulite sono montate in una goccia di soluzione di compensazione nel mezzo di un adesivo ben inserito tra due scivolate di copertura. Per l'imaging, i campioni montati vengono inseriti in una diapositiva dell'adattatore stampata in 3D. (C) Immagini multifotoniche in scala di grigi di ovaie non perfuse vs. perfuse, immunocolorate con il marcatore ovocitario DDX4, che mostrano una migliore qualità dell'immagine e una minore colorazione non specifica dopo la perfusione. La freccia chiusa indica un ovocita con un sottile strato di colorazione citoplasmatica DDX4 tipica dei follicoli primordiali, e le frecce aperte mostrano ovociti più grandi all'interno dei follicoli in crescita. L'asterisco indica l'autofluorescenza dai vasi sanguigni. (D) Rendering 3D da immagini confocali vs multifotoniche di ovaie P5, immunocolorate con marcatori ovocitari GCNA (verde) e DDX4 (magenta), che mostrano una significativa aberrazione sferica da microscopia confocale e praticamente nessuna da multifotone. Barre di scala = 100 μm (C, D) e 50 μm (inserti in D). Abbreviazioni: GCNA = peptidasi acida nucleare delle cellule germinali; DDX4 = DEAD-box elicasi 4. L'immagine A è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini rappresentative renderizzate in 3D di ovaie di diversi stadi di sviluppo. Rendering 3D da immagini multifotoniche di ovaie a montaggio intero immunocolorate con GCNA (verde) e LINE-1 ORF1p (blu) o DDX4 (magenta), rispettivamente nelle ovaie prenatali e postnatali. I singoli canali sono presentati in scala di grigi per mostrare segnali nucleari e citoplasmatici. Le caselle bianche delineano le regioni ingrandite negli inserti inferiori a sinistra. Due diverse ovaie sono mostrate per P28. L'ovaio della femmina non irradiata di controllo (in alto) contiene una grande popolazione di piccoli ovociti nei follicoli primordiali (vedi inserto). Al contrario, l'ovaio della femmina irradiato a P7 con 0,5 Gy di radiazione γ (IR) è completamente privo di piccoli ovociti nei follicoli primordiali (vedi inserto). La freccia chiusa indica un ovocita con un sottile strato di colorazione citoplasmatica DDX4 tipica dei follicoli primordiali e le frecce aperte mostrano ovociti più grandi all'interno dei follicoli in crescita. Barre di scala = 100 μm; 30 μm per gli inserti P28; 10 μm per tutti gli altri inserti. Gli inserti contengono viste ingrandite di immagini renderizzate in 3D generate in IMARIS e possono differire leggermente dalle immagini a basso ingrandimento a causa della prospettiva. Abbreviazioni: Non-IR = controllo non irradiato; IR = irradiato a P7 con 0,5 Gy di radiazione γ; GCNA = peptidasi acida nucleare delle cellule germinali; DDX4 = DEAD-box elicasi 4; LINE-1 = elemento nucleare a lungo intervallato-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Elaborazione delle immagini, visualizzazione 3D degli ovociti e risultati della quantificazione. (A) I rendering 3D da immagini multifotone (a sinistra) sono stati elaborati in IMARIS utilizzando il filtro gaussiano (al centro) e gli ovociti di piccole e grandi dimensioni sono stati identificati utilizzando la funzione spot (a destra). Ovaie P5 e P28 mostrate come esempio. Barre di scala = 100 μm (P5); 10 μm (inserti P5); 300 μm (P28); 50 μm (inserti P28). (B) I piccoli ovociti positivi per GCNA sono stati quantificati nelle ovaie di diversi stadi utilizzando caratteristiche spot (in alto). Per illustrare il numero decrescente di ovociti durante lo sviluppo, la percentuale media di ovociti è stata calcolata in ogni fase rispetto al numero medio presente nel primo stadio contato a E15,5 (in basso). Si noti il grande calo del numero di ovociti da E15,5 a E18,5. I dati sono presentati come mezzi ± SD. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism e analizzate da ANOVA unidirezionale, e la significatività è stata determinata dal test di confronto multiplo post hoc di Bonferroni. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0,05. Abbreviazione: GCNA = peptidasi acida nucleare delle cellule germinali; ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Rilevazione e quantificazione dell'espressione di LINE-1 ORF1p negli ovociti fetali. (A) I rendering 3D di immagini multifotone mostrano l'espressione LINE-1 ORF1p (blu) negli ovociti fetali E15.5 ed E18.5 (contrassegnati da GCNA verde). (B) Superfici 3D generate in IMARIS utilizzando immagini della riga superiore nel pannello A. (C) L'analisi dell'intensità di LINE-1 ORF1p mostra una maggiore espressione di LINE-1 ORF1p per ovocita a E18,5 rispetto a E15,5. Barre di scala = 100 μm; 10 μm (inserti del pannello A ); 30 μm (inserti del pannello B ). I dati sono presentati come mezzi ± SD. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism e analizzate dal t-test di Student, e il significato è stato determinato dal test U di Mann-Whitney. P ≤ 0,0001; ns >0,05. Abbreviazioni: GCNA = peptidasi acida nucleare delle cellule germinali; LINE-1 = elemento nucleare a lungo intervallato-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Metodo per stimare il numero totale di ovociti in campioni ovarici danneggiati con correzione computazionale. (A) Modello di ovociti GCNA-positivi (verdi) E15.5 con cinque regioni del 10% evidenziate in rosso, blu, grigio, magenta e marrone in un'ovaia intatta. Ogni immagine successiva, dopo l'ovaio intatto, rappresenta un'ovaia simulata con il 10% di regioni incrementali mancanti fino al 50%. (B) Schema del metodo computazionale per stimare il numero di ovociti nel campione danneggiato. (C) Il numero totale di ovociti nelle ovaie simulate è stato confrontato con il numero nelle ovaie intatte originali (considerato al 100%) e la differenza è presentata come deviazione percentuale. Simulazione da sei singole ovaie con un volume mancante del 10-50%. Barre di scala = 80 μm. Abbreviazione: GCNA = peptidasi acida nucleare a cellule germinali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Rendering 3D e modellazione 3D di ovociti nelle ovaie P5. Fare clic qui per scaricare questo video.

Soluzioni e buffer Reagente(i) Composizione
Fissativo Paraformaldeide 4% (v/v)
Tampone di permeabilizzazione Alcool polivinilico (PVA) 0,2% (p/v)
Boroidruro di sodio 0,1% (p/v)
Triton X-100 1,5% (v/v)
Buffer di blocco Albumina sierica bovina (BSA) 3% (p/v)
1 M Glicina (pH 7,4) 2% (p/v)
Triton X-100 0,1% (v/v)
200x Penicillina-Streptomicina 1% (v/v)
10% Sodio azide 0,2% (v/v)
siero di capra 10% (v/v)
Tampone di lavaggio PVA 0,2% (p/v)
Triton X-100 0,15% (v/v)
10% Sodio azide 0,1% (v/v)
Soluzione scaleS4(0) (pH 8.1) D-Sorbitolo 40% (p/v)
Urea 24% (p/v)
Glicerolo 10% (v/v)
DMSO 20% (v/v)
Soluzione ScaleCUBIC-1 Urea 25% (p/v)
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-idrossipropil)etilendiammina 25% (v/v)
Triton X-100 15% (v/v)
Soluzione di saccarosio Saccarosio 20% (p/v)
Soluzione ScaleCUBIC-2 Saccarosio 50% (p/v)
Urea 25% (p/v)
Trietanolammina 10% (p/v)
Triton X-100 0,1% (v/v)

Tabella 1: Soluzioni e buffer.

Figura supplementare S1: Preferenze di acquisizione delle immagini. Fare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Impostazioni di acquisizione delle immagini. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di immunocolorazione e imaging 3D per le ovaie prenatali e postnatali per studi comparativi ad alto rendimento per la quantificazione delle cellule germinali e la localizzazione delle proteine. Abbiamo sviluppato questo protocollo per analizzare il numero di ovociti nelle ovaie (N = 6-12) in sei punti temporali di sviluppo in 10-16 ceppi diversi, dove 2-4 piastre a 24 pozzetti vengono tipicamente elaborate contemporaneamente. Questo metodo può essere adattato per altri organi o marcatori cellulari. Ad esempio, questo protocollo può essere utilizzato per etichettare e visualizzare le cellule somatiche, come le cellule granulose nell'ovaio, utilizzando anticorpi appropriati, facilitando così gli studi sulle interazioni somatico-germe o lo sviluppo di altri tipi di cellule ovariche.

Una limitazione di questo protocollo e della combinazione di anticorpi è l'identificazione definitiva di diversi stadi follicolari. Le macchie di DNA utilizzate nell'immunofluorescenza e nell'imaging 2D per identificare gli stadi follicolari da strati di nuclei di cellule granulose sono insufficienti per gli approcci 3D. Il 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o Hoechst sono usati raramente per la colorazione di organi interi a causa della limitata penetrazione della luce e del segnale di decadimento nel mezzo di un tessuto di grandi dimensioni. Lo ioduro di propidio (PI) è una piccola molecola in grado di penetrare in profondità nel tessuto ma è difficile da catturare sul sistema di imaging multifotone a causa della sovrapposizione spettrale. Una migliore risoluzione degli stadi follicolari può essere ottenuta da marcatori aggiuntivi specifici per le cellule della granulosa come l'ormone antimulleriano (AMH) o FOXL247,48. Tuttavia, sebbene questi marcatori siano utili per differenziare i follicoli in crescita più grandi, non distingueranno i follicoli primordiali da quelli primari. Fino a quando non saranno disponibili marcatori specifici per queste prime fasi, i marcatori ovocitari come DDX4 o GCNA offrono il miglior indicatore dello sviluppo del follicolo. Inoltre, questo protocollo funziona per le gonadi maschili prenatali, ma non è ancora stato testato nel testicolo postnatale dove le sue dimensioni possono essere il fattore limitante. Di seguito sono elencate le criticità per una migliore visualizzazione e quantificazione delle cellule germinali nelle ovaie di varie dimensioni e vengono evidenziate le tecniche e le misure adottate per garantire una buona qualità dell'immunocolorazione per l'analisi a valle.

Il primo passo critico è prevenire danni alle ovaie prima e dopo la fissazione. Le ovaie danneggiate possono mancare di parti della struttura dell'organo, influenzando il numero di ovociti e distorcendo i risultati sperimentali. Per prevenire danni, il tessuto somatico extra viene lasciato attaccato all'ovaio più grande dopo la dissezione per afferrare con una pinza per il trasferimento delle ovaie. Inoltre, per le ovaie più piccole, trasferirle con una punta della pipetta tagliata abbastanza larga da consentire alle ovaie di adattarsi facilmente all'interno della punta evita danni. Se un danno tissutale minore provoca la mancanza di una parte dell'ovaio, può essere mitigato da un metodo computazionale in cui il numero totale di ovociti nel campione danneggiato può essere estrapolato utilizzando campioni intatti dello stesso tipo (Figura 6).

Tuttavia, le simulazioni computazionali hanno rivelato che l'accuratezza della previsione diminuisce con l'aumentare delle dimensioni dell'area danneggiata (100,8% ± 0,2, 97,2% ± 1,5 e 90,3% ± 1 per 10, 20 e 30% di danno, rispettivamente Figura 6C). Sulla base di simulazioni, si consiglia di escludere dall'analisi i campioni con perdita di >30%. Sono state utilizzate più ovaie intatte dello stesso tipo di campione per calcolare il numero medio di ovociti nell'area simile a quello mancante nel campione danneggiato. Questo numero è stato poi utilizzato per prevedere il numero totale di ovociti nell'ovaio con danni. L'uso di un'area di dimensioni simili nella stessa ovaia adiacente alla regione mancante può essere utilizzato come alternativa, ma non è stato testato.

Un altro problema è quello di evitare di contaminare le cellule che potrebbero causare autofluorescenza. Per le ovaie puberali, la perfusione, come descritto sopra, con 1x PBS e 1% PFA deve essere eseguita per eliminare le cellule del sangue che causeranno l'autofluorescenza (Figura 2C). La perfusione con PBS dovrebbe continuare fino a quando gli organi, in particolare le ovaie e i reni, non vengono eliminati dal sangue e diventano bianchi prima di passare all'1% di PFA (Figura 1E, F). Una perfusione inefficiente con PBS si tradurrà in uno sfondo elevato che potrebbe mascherare e rendere difficile la visualizzazione di piccoli ovociti. La perfusione con percentuali inferiori (1%) o superiori (4%) di PFA si traduce in una migliore qualità dell'immagine rispetto alla perfusione con PBS da solo; quindi, è stata utilizzata la percentuale inferiore di PFA.

L'ottimizzazione della colorazione anticorpale richiede attenzione a diverse variabili. Per la fase di permeabilizzazione, 4 ore sono risultate ideali per questo test, con periodi superiori a 4 ore (6-8 ore testate) con conseguente assenza di colorazione. Poiché la quantità e il costo degli anticorpi utilizzati per esperimenti di immunocolorazione su larga scala possono essere elevati, questo protocollo è stato testato e ottimizzato per il riutilizzo di miscele di anticorpi senza alcuna perdita di qualità immunocolorante. Per il riutilizzo, la miscela di anticorpi deve essere integrata con anticorpi freschi come descritto nel protocollo. Le fasi di lavaggio sono anche fondamentali per la qualità dell'immunocolorazione e dovrebbero essere eseguite più a lungo per ottenere un migliore rapporto segnale-rumore durante l'imaging e dovrebbero essere determinate per ciascun anticorpo di scelta. Per ottenere i migliori risultati, si consiglia di preparare la soluzione di compensazione ScaleS4(0) al momento giusto per ogni utilizzo, mentre ScaleCUBIC-1 e ScaleCUBIC-2 possono essere conservati a temperatura ambiente al buio per ~1-2 mesi.

La pulizia ScaleCUBIC-1 viene eseguita a 37 °C; è importante sottolineare che le temperature più elevate dovrebbero essere evitate in quanto comporteranno la precipitazione del reagente, che può influire sulla qualità dell'immunocolorazione. Il montaggio di più campioni per l'imaging può richiedere molto tempo. Agar o altri metodi di incorporamento utilizzati in altri protocolli sono laboriosi e potrebbero richiedere un'ulteriore ri-pulizia dei campioni 47,49,50. Le guarnizioni in silicio riutilizzabili possono essere utilizzate come pozzetti adesivi facili da usare con coverslip e sono offerti in diverse dimensioni e profondità per adattarsi ad altre dimensioni del campione. Per ottenere immagini di alta qualità, è necessario utilizzare un volume sufficiente di soluzione di compensazione; troppo poco si tradurrà in una scarsa qualità dell'immagine e troppa soluzione può fuoriuscire sul microscopio. Questo passaggio dovrebbe essere ottimizzato per campioni specifici a seconda delle loro dimensioni. Possono essere utilizzati piatti con fondo di vetro, ma i campioni devono essere immobilizzati per l'imaging poiché anche i minimi movimenti distorceranno l'immagine. Le guarnizioni in silicio possono essere utilizzate in combinazione con una parabola con fondo di vetro e un coperchio superiore per immobilizzare i campioni per l'imaging. Tuttavia, ciò limiterà la capacità di capovolgere il campione se è necessaria l'imaging da entrambi i lati a causa delle dimensioni dell'ovaio.

Un'altra scelta critica per questo approccio su larga scala e ad alto rendimento è stata l'imaging sulla piattaforma Leica DIVE/4TUNE/FALCON con due laser multifotoni (MP) Spectra-Physics sintonizzabili. I vantaggi dell'utilizzo della piattaforma DIVE includono la facilità di montaggio del campione (descritto sopra), la minimizzazione della distorsione ottica (rispetto alle piattaforme confocali) e, soprattutto, la velocità di imaging e la gestione dei dati di immagine acquisiti. L'imaging di campioni con i laser multifotonici a ingrandimento più elevato (16x) è molto più veloce e causa meno fotodanni rispetto ai laser confocali su Leica DIVE o SP8 utilizzando impostazioni simili per l'acquisizione di immagini con il software LAS X. Il fascio MP è basso, la sua eccitazione fluoroforica è altamente localizzata nel punto focale e raggiunge una maggiore profondità a basso ingrandimento senza infliggere fotodanni nonostante un numero maggiore di passaggi di imaging spaziale / assiale (confocale: ~ 300-400 sezioni al massimo, MP: >800 sezioni).

L'obiettivo 16x/NA0.6 consente la correzione di lievi discrepanze dell'indice di rifrazione dovute alla distribuzione del campione e del montante lungo l'asse ottico tramite un collare di correzione meccanica, che viene impostato in modo ottimale per il segnale massimo, a metà del campione. Inoltre, le strutture sferiche, come gli ovociti, possono essere distorte dall'acquisizione di immagini confocali poiché può verificarsi una localizzazione dipendente dalla profondità del piano confocale (segnale) a causa di discrepanze dell'indice di rifrazione del montante e del campione a una determinata impostazione stenopeica (Figura 2D). Poiché il segnale di fluorescenza viene catturato tramite il foro stenopeico interno dello strumento per rimuovere il segnale fuori fuoco, la distorsione ottica intrinseca (aberrazione sferica) può peggiorare più in profondità nel campione, il che è problematico per le ovaie più grandi (cioè ~ 400-600 micrometri di spessore).

Con le stesse impostazioni di correzione dell'obiettivo corrispondenti, praticamente nessuna aberrazione sferica può essere rilevata sul sistema DIVE MP con lunghezze d'onda di emissione variabili, semplificando così gli studi di quantificazione e co-localizzazione (Figura 2D). Infine, il laser pulsato ad alta potenza consente un'eccitante concentrazione di fluoroforo inferiore in profondità all'interno del campione, in particolare quando viene utilizzato con la correzione dell'eccitazione della profondità Z. Inoltre, la cattura dei segnali più deboli è anche migliorata dal rivelatore ibrido MP (HyD-RLD), che è una combinazione di normali tubi fotomoltiplicatori e rilevatori di conteggio dei fotoni a valanga, consentendo un rilevamento del segnale più di 30 volte superiore su una vasta gamma di lunghezze d'onda di emissione.

La microscopia multifotone a foglio luminoso (LS) è un'altra piattaforma emergente per l'imaging tissutale 3D47. Tuttavia, LS richiede più tempo di configurazione per i campioni macroscopici, incluso l'incorporamento dell'agar e la configurazione per l'imaging. Inoltre, le immagini acquisite a un ingrandimento più elevato con rotazione del campione possono generare file di grandi dimensioni > 100 GB, che potrebbero essere necessari per rimuovere gli artefatti di ombreggiatura del foglio chiaro (a causa di discrepanze dell'indice di rifrazione del mezzo esterno e dell'interno del campione o distorsioni della superficie del campione). Il metodo presentato per montare i campioni in soluzione in pozzetti adesivi è semplice e veloce.

Inoltre, questo approccio consente l'imaging di più ovaie in un unico pozzetto con un'unica configurazione e senza capovolgimento o rotazione. Tuttavia, il capovolgimento del "sandwich" di coverslip può essere necessario per le ovaie più grandi. L'imaging del sistema DIVE è più veloce di confocale e LS; con ingrandimento 16x, l'ovaio prepuberale viene ripreso in 3-5 min (Z-step 2 μm) e l'ovaio puberale in 1 h (Z-step 5 μm). Inoltre, i file generati in LAS X sono di dimensioni gestibili (2-20 GB), il che è anche fondamentale per un gran numero di campioni per l'analisi a valle. Sebbene questo protocollo di immunocolorazione sia stato ottimizzato per l'uso in combinazione con la piattaforma DIVE, i campioni immunocolorati possono essere ripresi utilizzando altre piattaforme MP / LS con alcune modifiche.

Il vantaggio della colorazione dell'intera ovaia con il protocollo di modellazione 3D è l'analisi dei dati efficiente e relativamente facile rispetto all'acquisizione manuale dei dati nell'analisi 2D. Il software di visualizzazione e analisi 3D IMARIS è stato scelto perché è disponibile in commercio e offerto da molti core di microscopia, non richiede competenze di programmazione ed è compatibile con molte piattaforme software di acquisizione di immagini come LAS X di Leica o ZEN di ZEISS. Con IMARIS, i parametri standard sono impostati come evidenziato nella sezione protocollo e questi parametri possono essere utilizzati per altre immagini e campioni con piccole modifiche, migliorando così la riproducibilità e l'efficienza.

L'analisi e la quantificazione delle immagini sono ottimizzate per il software IMARIS; tuttavia, analisi simili possono essere eseguite su altri software di visualizzazione dei dati commerciali o open source seguendo principi simili. In conclusione, è stato presentato qui un protocollo ottimizzato per l'imaging di intere ovaie per analisi quantitative e qualitative. Questo è stato intenzionalmente adattato alle esigenze dell'elaborazione ad alto rendimento che sarà sempre più richiesta per i test tossicologici, gli scopi clinici e diagnostici e le analisi a livello di genoma dei regolatori della sufficienza e della funzione ovarica.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 HD093778 a E.B-F e T32 HD007065 a R.B). Ringraziamo Zachary Boucher per la sua assistenza con l'esperimento delle radiazioni. Ringraziamo Mary Ann Handel per la lettura critica del manoscritto. Riconosciamo con gratitudine il contributo di Sonia Erattupuzha e del Microscopy Core Service presso il Jackson Laboratory per l'assistenza di esperti con il lavoro di microscopia descritto in questa pubblicazione e Jarek Trapszo dei servizi di strumenti scientifici presso il Jackson Laboratory per la progettazione della diapositiva dell'adattatore stampato in 3D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

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Biologia dello sviluppo Numero 175
Immunofluorescenza dell'ovaio intero, clearing e microscopia multifotonica per l'analisi quantitativa 3D della riserva ovarica in via di sviluppo nel topo
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Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

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