Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hel äggstocksimmunfluorescens, rensning och multifotonmikroskopi för kvantitativ 3D-analys av den utvecklande äggstocksreserven i mus

Published: September 3, 2021 doi: 10.3791/62972
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

Här presenterar vi ett optimerat protokoll för avbildning av hela äggstockar för kvantitativa och kvalitativa analyser med hjälp av helmonterad immunfärgning, multifotonmikroskopi och 3D-visualisering och analys. Detta protokoll rymmer hög genomströmning, tillförlitlig och repeterbar bearbetning som är tillämplig för toxikologi, klinisk diagnostik och genomiska analyser av äggstocksfunktionen.

Abstract

Kvinnlig fertilitet och reproduktiv livslängd beror på kvaliteten och kvantiteten av äggstocksocytreserven. Uppskattningsvis 80% av kvinnliga könsceller som kommer in i meiotisk profas I elimineras under fetal oocyte attrition (FOA) och den första veckan av postnatal liv. Tre huvudmekanismer reglerar antalet oocyter som överlever under utvecklingen och etablerar äggstocksreserven hos kvinnor som går in i puberteten. I den första vågen av oocyteförlust elimineras 30-50% av oocyterna under tidig FOA, ett fenomen som tillskrivs högt långt isär kärnelement-1 (LINE-1) uttryck. Den andra vågen av oocyteförlust är eliminering av oocyter med meiotiska defekter genom en meiotisk kvalitetskontrollpunkt. Den tredje vågen av oocyteförlust uppträder perinatalt under primordial follikelbildning när vissa oocyter misslyckas med att bilda folliklar. Det är fortfarande oklart vad som reglerar var och en av dessa tre vågor av oocyteförlust och hur de formar äggstocksreserven hos antingen möss eller människor.

Immunofluorescens och 3D-visualisering har öppnat en ny väg för att avbilda och analysera oocyteutveckling i samband med hela äggstocken snarare än i mindre informativa 2D-sektioner. Denna artikel ger ett omfattande protokoll för hela äggstocksimmunfärgning och optisk rensning, vilket ger förberedelser för avbildning med hjälp av multifotonmikroskopi och 3D-modellering med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara. Den visar hur denna metod kan användas för att visa dynamiken i oocytens utmattning under äggstocksutveckling hos C57BL / 6J-möss och kvantifiera oocyteförlust under de tre vågorna av oocyteliminering. Detta protokoll kan tillämpas på prenatala och tidiga postnatala äggstockar för äggcellsvisualisering och kvantifiering, liksom andra kvantitativa metoder. Viktigt är att protokollet utvecklades strategiskt för att tillgodose hög genomströmning, pålitlig och repeterbar bearbetning som kan tillgodose behoven inom toxikologi, klinisk diagnostik och genomiska analyser av äggstocksfunktionen.

Introduction

De flesta däggdjurshonor föds med ett begränsat antal meiotiskt arresterade oocyter lagrade i primordiala folliklar, som utgör äggstocksreserven (OR)1,2. OR bestämmer den totala kvinnliga reproduktiva livslängden och hälsan3. Operationssalen minskar normalt i storlek med åldrandet och kan utarmas i förtid vid exponering för vissa genotoxiska medel (strålning/kemoterapi) och miljöpåfrestningar (undernäring), vilket leder till infertilitet 4,5,6. Idiopatisk kvinnlig infertilitet kan ofta hänföras till den genetiska och fysiologiska kvaliteten hos ägg som utvecklas från OR och förblir dåligt förstådd 7,8. Eftersom kvinnlig follikelbegåvning till stor del är förutbestämd av födseln är det viktigt att förstå de regleringsmekanismer som är involverade i OR-etableringen och underhållet.

Hos möss börjar OR-bildning med specifikationen av primordiala könsceller (PGC) runt embryonal dag (E) 7,52. PGC: erna migrerar till könsorganen, där de kommer att bo med ungefär E10.59. Följande omfattande proliferation sker med ofullständig cytokinesis vilket resulterar i bildandet av cystor som kommer att brytas ner senare i utvecklingen10,11. Vid ungefär E12.5 bestäms gonadalt kön och PGC-proliferationen stannar i äggstockarna. Hos kvinnor kommer PGC, nu oocyter, in i meiotisk profas I (MPI) vid ungefär E13,512,13. Oocyter utvecklas genom utökad MPI och arrestering vid diktyatstadiet runt födelsetiden. Under den första veckan efter födseln omges varje arresterad äggcell av granulosaceller och bildar därigenom en primordial follikel.

Antalet primordiala folliklar i OR hos en kvinna beror på hur många oocyter som överlevde vågorna av oocyteliminering som inträffar före och under MPI-arrestering genom apoptos, autofagi eller nekros14,15. Den första vågen sker under fosterutvecklingen och kallas FOA. FOA är en evolutionärt bevarad process hos honor (däggdjur och icke-däggdjur), varigenom uppskattningsvis 50-80% av oocyterna elimineras beroende på honarten 16,17,18,19. Hos möss förekommer FOA under E15,5 till E18,5 och har tillskrivits reaktivering och uttryck av retrotransposon LINE-1-sekvenser som orsakar oocytedöd20,21. Den andra vågen av oocyteliminering sker genom en meiotisk kontrollpunkt som eliminerar oocyter med meiotiska defekter såsom oreparerade DNA-dubbelsträngsbrott (DSB)22,23. Nästa våg av oocyteliminering sker under cystnedbrytning, som kulminerar under bildandet av primordiala folliklar, som var och en innehåller en enda oocyte 10,11,24,25.

Hos möss är den primordiala follikelreserven till stor del etablerad genom puberteten, varefter den minskar när primordiala folliklar aktiveras för tillväxt under regelbundna reproduktionscykler. OR-storleken varierar mellan enskilda kvinnor och mellan olika genetiska stammar av möss; ändå är den genetiska regleringen av OR-storlek inte väl förstådd 26,27,28,29. Genetiska studier av OR-reglering hindras av bristen på standardiserade protokoll för att studera vågorna av oocyteliminering under prenatal och postnatal utveckling. Flera oocytekvantifieringsmetoder har utvecklats hos möss, med den vanligaste och mest använda histomorfometriska utvärderingen av histologiska sektioner30,31. I denna teknik identifieras oocyter på seriella sektioner med histologiska fläckar, såsom hematoxylin och eosin (H & E) och periodisk syra-Schiff (PAS) eller fluorescerande markörer. Denna teknik är tillförlitlig om alla förhållanden förblir konstanta, inklusive sektionstjocklek, effektiv återvinning av alla sektioner i hela äggstocken och räkningsscheman för enskilda laboratorier. Antalet som rapporteras av olika laboratorier skiljer sig dock ofta avsevärt och är därför inte lätt jämförbara.

Dessutom, med tanke på genetiska skillnader, kan användningen av olika musstammar också påverka oocytentalet. Ytterligare beräkningsmetoder har utvecklats för histomorfometrisk utvärdering och inkluderar automatiserad detektion av oocyter med hjälp av fraktioneringsmetoden, automatisk räkning med hjälp av beräkningsalgoritmer och 3D-rekonstruktion av histologiska bilder för att förhindra flera räkningar av samma oocyte 31,32,33,34,35,36 . Även med dessa förbättringar som läggs till histomorfometrisk utvärdering är tekniken relativt arbetsintensiv, särskilt för storskaliga studier med hög genomströmning. De insamlade uppgifterna kanske inte är reproducerbara och jämförbara mellan studier på grund av skillnader i räknescheman, datoralgoritmer och programvara som används.

Nyligen, accelererad av utvecklingen av nya medelupplösta multifoton- och ljusarkmikroskopi och optiska vävnadsrensningsmetoder, blir 3D-modellerings- och analystekniker för intakta äggstockar den valda metoden för att effektivt kvantifiera oocytetal och studera proteinlokalisering och dynamik37,38. Dessa 3D-metoder är vanligtvis fördelaktiga jämfört med histologiska metoder eftersom vävnader och organ bättre bevaras och hålls intakta. Dessutom ger 3D-analys och modellering ytterligare insikter i funktion och interaktioner inom och mellan cellnischer eller understrukturer inom organet som kan missas i 2D-analys.

3D-analys av hela organ kräver optimering av fixering, immunfärgning och optiska clearingprotokoll för enskilda organ, såsom äggstockar, utan vävnadsförvrängning eller skada. Ytterligare optimering av provmontering för avbildning krävs för högupplöst mikroskopi och kan bero på vilken bildplattform som finns tillgänglig. Slutligen genererar avbildning av hela den intakta äggstocken en stor mängd data för efterföljande beräkningsanalyser. Därför finns det ett behov av att utveckla standardiserade 3D-metoder för att räkna oocyter för jämförande studier och över utvecklingsstadier.

Detta protokoll använder standard immunfärgning och tidigare rapporterade clearingprotokoll, med fokus på en enkel, användarvänlig och hög genomströmningsmetod 38,39,40,41. Protokollet är optimerat för att analysera ett stort antal prenatala och postnatala äggstockar fram till postnatal dag 28 (P28) och varierande storlekar av äggstockar från olika musgenetiska bakgrunder. Immunfärgningsstegen är likartade för alla steg; Clearingprotokollen skiljer sig emellertid åt för pubertala äggstockar på grund av deras större storlek, ScaleS4(0) och CUBIC för små respektive stora äggstockar,respektive 40,41. Vidare utförs helkroppsperfusion i P28-möss före fixering för att förhindra autofluorescens från blodkroppar. Ett multifotonmikroskop byggdes på Leica DIVE/4Tune-plattformen som ett alternativ till ljusarkmikroskopi för att hämta bilder, och IMARIS 3D-visualiserings- och analysprogramvara med olika analysverktyg valdes för detta protokoll. Detta protokoll är enkelt att följa och mindre praktiskt, därmed tidsbesparande. Dessutom är oocytkvantifiering relativt snabb, beroende på storleken på äggstocken och arrangemanget av oocyter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla möss som användes var av den genetiska stammen C57BL/6J (se materialförteckningen). Denna stam har sekvenserats fullständigt och är standard för många studier om äggstocksstruktur och funktion. Möss inrymde enligt NIH-riktlinjerna, och procedurer som utfördes godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of The Jackson Laboratory. Reagenser och kompositioner som används i detta protokoll listas i materialförteckningen respektive tabell 1.

1. Beredning av reagenser

  1. Fixativ: Förbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS. Till exempel, för 24 prover (0,5 ml / prov = 12 ml total volym), tillsätt 3 ml av 16% PFA-elektronmikroskopikvalitet till 9 ml 1x PBS.
  2. Buffert för permeabilisering
    1. Mät polyvinylalkohol (PVA) i en 250 ml plastbägare innehållande 1x PBS dagen innan permeabiliseringsbufferten behövs. Rör om lösningen över natten så att PVA kan lösas upp helt.
    2. Tillsätt natriumborhydrid till den upplösta PVA och låt blandningen homogeniseras i cirka 3-5 minuter. Förvänta dig att lösningen skummar.
    3. Tillsätt Triton X-100 till lösningen och använd bufferten när Triton X-100 är upplöst.
      OBS: PVA tar lång tid att lösa upp (minst 3 timmar), och penetreringen av antikroppen beror på hur väl den löser sig. För större äggstockar är det viktigt att lösa upp PVA helt.
  3. Blockering av buffert
    1. Mät bovint serumalbumin (BSA) i en bägare med 1x PBS. Rör om lösningen tills BSA är upplöst.
    2. Tillsätt glycin, Triton X-100, Penicillin-streptomycin och natriumazid. Rör om tills lösningen homogeniseras. Överför bufferten till en flaska och förvara den vid 4 °C. Tillsätt normalt getserum före användning.
  4. Tvättbuffert: Mät PVA i en bägare som innehåller 1x PBS. Rör om lösningen över natten så att PVA kan lösas upp. Tillsätt Triton X-100 och natriumazid. När bufferten är blandad, förvara den vid 4 °C.
  5. SkalaS4(0)-lösning (pH 8.1): Lös upp D-sorbitol i PBS i en bägare under omrörning vid ≤100 °C. Tillsätt urea till lösningen, och när urea löser sig, stäng av värmen och låt lösningen röra om tills den är helt upplöst. Tillsätt glycerol och dimetylsulfoxid och rör om tills lösningen homogeniseras. Förvara lösningen vid rumstemperatur i mörkret.
    OBS: ScaleS4 (0) -lösningen måste göras färsk den första dagen för rensning av äggstockar.
  6. ScaleCUBIC-1-lösning
    1. Lös upp urea i en bägare innehållande PBS under omrörning vid temperatur ≤100 °C. Mät N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroxipropyl)etylenderamin i en separat bägare, tillsätt sedan den upplösta urean och rör om vid en temperatur av ≤100 °C tills reagenserna är helt upplösta. När alla reagenser är i lösning, stäng av värmen och svalna vid rumstemperatur. Förvara i mörkret.
    2. Avgas lösningen genom att överföra den till en filtreringskolv. Fäst kolven i ett vakuum med slangar, täck kolven och sätt på vakuumet tills bubblor i lösningen försvinner. Använd lösningen efter denna avgasning.
      OBS: Lösningen kan förvaras i mörkret för att användas i upp till en månad.
  7. Sackaroslösning: Lös sackaros i 1x PBS; avgas sedan lösningen före användning.
    OBS: Förbered lösningen nyligen före användning.
  8. ScaleCUBIC-2-lösning
    1. Lös upp sackaros i en bägare innehållande PBS under omrörning vid en temperatur ≤100 °C. Tillsätt urea och rör om vid en temperatur av ≤100 °C tills urea löser sig. Stäng av värmen.
    2. Tillsätt trietanolamin och Triton X-100. Rör om tills lösningen homogeniseras. Låt lösningen svalna till rumstemperatur och förvara i mörkret. Degas lösningen före användning.
      OBS: Lösningen kan förvaras i mörkret för att användas i upp till en månad.

2. Dissektion och fixering av prenatala äggstockar (Figur 1A)

  1. Para vuxna kvinnor (≥8 veckor) och män enligt det godkända institutionella protokollet. Kontrollera om det finns vaginala pluggar varje morgon.
    OBS: Morgonen för en vaginal plugg betecknas som 0,5 dagar efter coitum (d.p.c) eller E0,5.
  2. På dissektionsdagen, förbered 4% paraformaldehyd (PFA) och alikvot ~ 0,5 ml i mikrocentrifugrör, placerade på bänksidan (~ 4 per gravid kvinna).
    OBS: PFA är ett farligt ämne och måste hanteras under en kemisk huva.
  3. Förbered tre 100 mm plattor innehållande ~ 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för varje gravid kvinna (för att skörda livmodern, för dissekering av mesonephros-äggstockskomplex och isolering av äggstockar).
  4. Avliva gravida kvinnor som bär embryon från det föredragna utvecklingsstadiet och fortsätt till dissektion. Avliva inte mer än 1-2 honor åt gången. Använd ett godkänt protokoll för eutanasi hos gravida möss (t.ex. CO2-exponering följt av cervikal dislokation).
  5. När en kvinna har avlivats, spraya buken med 70% etanol. Använd pincett, lyft bukhuden och använd sax för att göra ett V-format snitt genom buken och kroppsväggen. Skär längs snittets två sidor och skala huden tillbaka för att exponera de inre organen och fostren i livmodern.
  6. Skär och separera livmodern med fostren med bukfettet och äggstocksartärerna och venerna med bukfett och äggstockar. Ta bort livmodern och placera den i en 100 mm platta som innehåller 1x PBS. Släpp fostren i PBS genom att skära livmoderväggen och punktera äggula sac. Klipp navelsträngen.
    OBS: För foster yngre än 15 dagar i graviditeten säkerställer moderns eutanasi och avlägsnande från livmodern snabb död hos fostret. Foster äldre än 15 dagar i graviditet till födseln måste avlivas genom halshuggning.
  7. Överför ett foster till en ny tallrik med färsk 1x PBS. För att halshugga ett E15.5-foster, fäst försiktigt de två bakbenen isär på plattan med pincett för att immobilisera fostret. Använd ett andra par pincett som hålls i den dominerande handen, håll nacken mellan tångspetsarna och pressa för att skära av fostrets huvud eller använd sax för att skära nacken.
  8. Skär under frambenen med de dominerande handtångarna och dra försiktigt bort överkroppen. Sätt sedan in en slutpunkt för de dominerande handtångarna i bukhålan vertikalt i öppningen av bukregionen medan den andra slutpunkten för tången förblir utanför. Stäng pincetten, nyp kroppsväggen för att skära den och exponera de inre organen.
  9. Med samma pincett, ta försiktigt bort organen, inklusive tarmarna och leveren, tills njurarna och reproduktionsorganen blir synliga. Bestäm fostrets kön: vid E15.5 har äggstockarna en långsträckt korvliknande form medan testiklarna är ovala.
    OBS: I tidigare skeden kan genotypning behövas för att bestämma könet.
  10. Använd ett par pincett, håll ner det kvinnliga fostret och använd de andra pincettarna för att ta tag i varje mesonephros-äggstockskomplex och försiktigt separera det från njurarna och de Müllerska kanalerna. Placera äggstockarna i en ny platta med 1x PBS, lämna mesonephros fästa, men ta bort de omgivande vävnaderna för att säkerställa att äggstockarna exponeras. Placera båda äggstockarna i ~ 0,5 ml 4% PFA i mikrocentrifugrör och fixera vid 4 ° C över natten. Nästa dag, ersätt PFA med 70% etanol.
  11. För dissektion och fixering av E18.5 äggstockar, separera fostren från livmodern enligt beskrivningen ovan och följ sedan protokollet för prepubertala valpar som beskrivs i avsnitt 3 (Figur 1B).

3. Dissektion och fixering av prepubertala äggstockar (figur 1B)

  1. Förbered 4% PFA och alikvot ~ 0,5 ml i 1,5 ml rör och placera dem på bänksidan (~ ett rör per valp). Förbered 35 mm plattor med 1x PBS (~ en per valp). Avliva valparna med hjälp av det godkända institutionella protokollet.
    OBS: Halshuggning är den föredragna metoden för eutanasi för möss 8 dagar eller yngre. Neonatala möss kan halshuggas med antingen 3-4 "dissekerande sax eller 5-7" Mayo sax.
  2. Bestäm valparnas kön genom att mäta det anogenitala avståndet, vilket är större hos män än hos kvinnor. Använd skarp halshuggningssax för att halshugga kvinnliga valpar. Placera kroppen, med öppen sida nedåt, på en pappershandduk för att tömma blodet (~ 5-10 s).
  3. Säkra valpen på ryggen genom att placera en stift i tassen på varje fot. Spraya buken med 70% etanol. Använd pincett för att hålla valpens hud borta från kroppen och använd sax för att göra ett litet V-format snitt i huden på underlivet.
  4. Sätt in saxen i snittet under huden och skär längs båda sidor av buken. Använd tången för att försiktigt skala tillbaka huden och avslöja underlivet. Flytta försiktigt tarmen uppåt och lokalisera livmoderhornen bredvid urinblåsan. Följ varje livmoderhorn mot njuren och lokalisera äggstocken med omgivande fettvävnad under varje njure.
  5. För att dissekera äggstockarna, håll livmoderhornet under äggstocken och äggledaren med ett par pincett (pincett A, figur 1B) och lyft det försiktigt bort från kroppen. Använd ett annat par pincett (pincett B), ta försiktigt tag under det första paret av pincett så att äggstocken och äggledaren i fettkudden är synliga ovanför det andra paret av pincett. Skär sedan under det andra paret pincett med sax eller dra försiktigt för att lossa äggstockarna och bifogade vävnader.
  6. Placera de isolerade organen i en tallrik med 1x PBS. Trimma bort den extra fettvävnaden, äggledaren och livmoderhornet för att rengöra och isolera äggstocken. Öppna försiktigt bursa som omger äggstocken och exponera hela äggstocken.
  7. Trimma bursamembranet utan att skada äggstocken och lämna vävnad runt hilum (ligamentliknande struktur mellan äggstocken och reproduktionsorganet) för att hantera äggstocken, som visas i figur 1B, P5. När äggstockarna är trimmade, placera dem i 4% PFA och fixa äggstockarna vid 4 ° C över natten. Nästa dag, ersätt 4% PFA med 70% etanol och förvara äggstockarna vid 4 ° C tills immunfärgningsprotokollsteget.

4. Perfusion, dissektion och fixering av pubertala äggstockar (Figur 1C)

  1. Perfusera möss enligt institutionellt godkända protokoll med musen under djupbedövning i en kemisk rökhuva. Förbered perfusionsutrustningen och reagenserna. Se det detaljerade protokollet vid 42.
    OBS: Perfusion är ett terminalt eutanasiförfarande som ersätter blodet i hela kärlsystemet med ett vävnadsfixeringsmedel.
  2. Väg en pubertal honmus (P28) och registrera musens vikt (vanligtvis mellan 13 g och 15 g). Beräkna mängden av det godkända anestesimedlet som ska användas.
    OBS: Här användes 0,35 ml tribromoetanol per 10 g kroppsvikt i detta protokoll.
  3. Använd en engångsspruta på 10 ml med en 20 G nål för att fylla sprutan med det godkända bedövningsmedlet. Byt ut 20 G-nålen mot en 26 G x 3/8 nål.
  4. Håll försiktigt musen genom att scruffing dorsal neck hud med en hand. Vänd musen för att exponera buken. Injicera den tidigare beräknade mängden bedövningsmedel i bukhålan. Placera musen i en behållare med ett lock tills anestesin träder i kraft (dvs musen rör sig inte längre).
  5. När musen slutar röra sig, kläm försiktigt fötterna för att kontrollera att det inte finns något svar och se till att musen är helt sövd innan perfusionen påbörjas. Placera och säkra musen på ryggen genom att försiktigt fästa alla fyra benen genom tasspuddarna på ett bräde. Se till att benen är fastsatta i ett avslappnat läge, inte översträckt.
  6. Spraya musen med 70% etanol från buken till bröstregionen. Använd pincett för att försiktigt nypa och lyfta bukhuden och använd sedan sax för att göra ett litet V-format snitt genom huden och kroppsväggen.
  7. Lyft bort hudfliken från kroppshålan och sätt in saxen under huden och kroppsväggen. Skär huden och kroppsväggen rakt upp mot huvudet till kanten av brösthålan vid bröstbenet.
  8. Öppna brösthålan genom att försiktigt skära revbenen på båda sidor av bröstbenet till strax under skulderbladet. Var försiktig så att du inte punkterar lungorna under bröstkorgen. Ta tag i huden / revbensflikarna med pincett och fäst dem för att exponera de inre organen.
  9. Trimma försiktigt all vävnad, såsom tymus, som kan hindra tydlig åtkomst till hjärtat. Exponera alla organ, inklusive mag-tarmkanalen, för att möjliggöra visuell bekräftelse på att hela kroppen är perfuserad, inklusive underlivet.
  10. Använd dissektionssax för att klippa hjärtans högra atrium och släppa blod från systemet. Håll försiktigt hjärtat med pincett och sätt in en perfusionsnål (ansluten till en peristaltisk pumpregulator) i vänster kammare.
  11. Pumpa ~ 10 ml PBS, med skonsamt men konstant tryck, tills vävnader som lever, njurar och reproduktionsorgan (figur 1E, F) förvandlas från rosa till vitt. Byt sedan ut PBS med nytillverkade 1% PFA och fortsätt perfusionen med cirka 10 ml PFA eller tills ryckningar uppstår i musens underkropp (t.ex. svans).
    OBS: Dessa fixeringstremor indikerar framgångsrik perfusion.
  12. När perfusionen är klar, lokalisera fettkudden med äggstockarna under njurarna och dissekera försiktigt hela reproduktionsorganet, inklusive fettkudden, äggstockarna och livmoderhornen och placera kanalen i en injektionsflaska med 4% PFA. Fixa äggstockarna vid rumstemperatur över natten (~ 16-24 timmar). Ersätt sedan 4% PFA med 70% etanol i minst en dag och trimma äggstockarna (figur 1E,F), som beskrivits ovan, innan du startar immunfärgningsprotokollet.

5. Helmonterad äggstocksimmunfärgning (Figur 2A)

OBS: Öva sterila tekniker under immunfärgningsprotokollet, särskilt vid byte av buffertar, för att förhindra kontaminering under längre inkubationsperioder.

  1. Utför alla immunfärgningssteg i en 24-brunnsplatta, som visas i figur 2A. Justera reagensvolymerna för andra format. Byt buffertar noggrant för att undvika att förlora små prenatala och prepubertala äggstockar.
    OBS: Andra format, såsom 48- och 96-brunnsplattor, kan användas, men de djupare brunnarna och smalare öppningarna gör det svårt att aspirera buffertar utan att förlora eller skada äggstockarna.
  2. Dag 1
    1. Pipettera 1 ml PBS/brunn in i det antal brunnar som behövs i en ren 24-brunnsplatta. Klipp av spetsen på en 200 μL pipettspets för att göra en bred öppning och använd den för att försiktigt överföra prepubertala äggstockar från 1,5 ml rör med 70% etanol till brunnarna. För pubertala äggstockar, använd en 1000 μL pipettspets med spetsen avskuren för överföringen.
      OBS: Den bredare öppningen av spetsen förhindrar vävnadsskador under överföringen.
    2. När alla prover har överförts till brunnarna, använd en ny spets för att aspirera PBS och ersätt den med färsk 0,8 ml PBS / brunn. Inkubera proverna vid rumstemperatur på en shaker vid ~ 100-150 rpm över natten. Börja förbereda permeabiliseringsbufferten (se tabell 1 och avsnitt 1).
      OBS: Det nya tipset förhindrar att äggstockarna fastnar på spetsen, och PBS-inkubationssteget gör att äggstockarna kan balansera i PBS och rehydrera före färgning.
  3. Dag 2
    1. Avsluta beredningen av permeabiliseringsbufferten. Aspirera PBS från brunnarna och ersätt den med 0,8 ml permeabiliseringsbuffert per brunn. Placera plattorna tillbaka på skakaren och inkubera proverna vid rumstemperatur i 4 timmar.
    2. Efter 4 timmars inkubation, aspirera permeabiliseringsbufferten fullständigt och ersätt den med 0,5 ml blockerande buffert (se tabell 1 och avsnitt 1). Försegla plattan med parafilm för att förhindra avdunstning, placera i en säkert täckt behållare på en shaker och inkubera proverna med mild omrörning i blockerande buffert över natten (16-24 timmar) vid rumstemperatur.
  4. Dag 3
    1. Förbered de primära antikropparna genom utspädning i blockerande buffert. För visualisering av oocyter, använd äggcellsmarkörer, t.ex. råtta anti-germ cell nukleär sur peptidas (GCNA) / TRA98 för både prenatala och prepubertala äggstockar och kanin anti-DEAD-box helicase 4 (DDX4) / mus vasa homolog (MVH) för både prepubertala och pubertala äggstockar. För kvantifiering av LINE-1 ORF1p-uttryck i prenatala äggstockar, använd kaninanti-LINE-1 ORF1p eller annan tillgänglig antikropp.
      OBS: GCNA / TRA98-signalen är inte detekterbar i pubertala äggstockar.
    2. Aspirera den blockerande bufferten från proverna och ersätt den med 0,5 ml utspädda primära antikroppar. Försegla plattan med parafilm för att förhindra avdunstning. Placera plattorna i en behållare med ett lock för att förhindra torkning av prover under inkubation. Placera behållaren på skakan och inkubera proverna i 3-4 dagar vid rumstemperatur.
  5. Dag 7
    1. Ta försiktigt bort parafilmen från plattorna och aspirera den primära antikroppsblandningen från proverna. Förvara de primära antikroppsblandningarna vid 4 °C (i upp till en månad eller tre användningar) och återanvänd dem senare genom att komplettera med färska antikroppar (t.ex. 2 μL färsk antikroppsalikvot per 5 ml av den tidigare använda blandningen).
    2. Tillsätt 1 ml tvättbuffert (se tabell 1 och avsnitt 1) per brunn till proverna och vagga försiktigt plattorna i några sekunder för att skölja bort de kvarvarande antikropparna. Aspirera försiktigt och ersätt tvättbufferten med 0,8 ml färsk tvättbuffert och skaka plattorna i rumstemperatur över natten.
  6. Dag 8
    1. Aspirera tvättbufferten över natten, ersätt den med 0,8 ml färsk tvättbuffert och skaka i rumstemperatur i 2 timmar. Upprepa tvättsteget med färsk tvättbuffert i ytterligare 2 timmar.
    2. Efter den sista tvätten, ersätt tvättbufferten med 0,5 ml sekundära antikroppsblandningar utspädda i en blockerande buffert, t.ex. get anti-råtta Alexa Fluor 555 och get anti-kanin Alexa Fluor 647 vid 1: 1000 utspädning. Förbered den sekundära antikroppsblandningen färsk för varje immunfärgningsexperiment.
    3. Försegla plattan med parafilm för att förhindra avdunstning under inkubation. Inkubera proverna vid rumstemperatur i mörkret eller i plattor täckta med aluminiumfolie med mild omrörning i 3 dagar.
      OBS: Detta steg och alla efterföljande steg sker i mörkret eller med aluminiumfoliefolie.
  7. Dag 11
    1. Aspirera den sekundära antikroppsblandningen och utför en initial tvätt med 1 ml tvättbuffert. Gunga försiktigt plattorna i några sekunder för att skölja bort de återstående sekundära antikropparna.
    2. Aspirera tvättbufferten, ersätt den med 0,8 ml färsk tvättbuffert och inkubera proverna vid rumstemperatur i 2 timmar med skakning, skyddad mot ljus. Upprepa tvättsteget 2 gånger för totalt 3 tvättar. Efter den tredje tvätten, fortsätt till rensningssteget (avsnitt 6).

6. Rensning av immunfärgade helmonterade äggstockar (Figur 2A).

OBS: Utför alla rensningssteg i mörkret genom att förpacka plattorna i aluminiumfolie eller placera i ogenomskinliga behållare. Rensningsstegen skiljer sig åt för prepubertala och pubertala äggstockar.

  1. Dag 11 [Prenatala och prepubertala äggstockar rensas i ett enstegsprotokoll]
    1. Efter den sista tvätten, aspirera tvättbufferten och ersätt den med 0,8 ml nygjord ScaleS4(0)-lösning (se tabell 1 och avsnitt 1). Försegla plattan med parafilm och inkubera proverna i mörkret med skakning vid rumstemperatur i tre till fyra dagar före avbildning.
    2. Byt ut ScaleS4(0)-lösningen mot en ny lösning dagligen om det behövs. Var försiktig när du byter ut lösningarna, eftersom rensade äggstockar blir transparenta och är svåra att se. Efter rensning, fortsätt till provuppsättning och avbildning (avsnitt 7).
      OBS: Att ändra lösningar förbättrade inte bildkvaliteten avsevärt. Dagliga förändringar ökar sannolikheten för att förlora små och mestadels transparenta prover.
  2. Dag 11-15 [Pubertala äggstockar rensas i ett tvåstegsprotokoll]
    1. Efter den sista immunfärgningstvätten aspirerar du på tvättbufferten och ersätter den med 0,8 ml ScaleCUBIC-1 (se tabell 1 och avsnitt 1). Förslut plattan med parafilm och skaka försiktigt prover vid 37 ° C i 3 dagar i mörkret. Byt ut ScaleCUBIC-1-lösningen mot den färska lösningen dagligen.
    2. På dag 15, tvätta proverna 3 gånger i 10 min varje gång i 0,8 ml PBS vid rumstemperatur med mild skakning. Byt ut PBS mot 0,8 ml avgasad 20% sackaros beredd nyss med PBS. Skaka försiktigt vid rumstemperatur i 1 timme.
    3. Byt ut 20 % sackaroslösning med 0,8 ml ScaleCUBIC-2-lösning (se tabell 1 och avsnitt 1), försegla plattan med parafilm och skaka försiktigt vid rumstemperatur med dagliga förändringar av ScaleCUBIC-2-lösningen. Rensa i 4-5 dagar och fortsätt till bilden. Var försiktig när du utbyter lösningar för att undvika provförlust eftersom rensade äggstockar är transparenta och svåra att se. Fortsätt till provuppsättning och avbildning (avsnitt 7).

7. Provinställning och avbildning med ett multifotonmikroskop

OBS: Alla steg som beskrivs nedan utfördes med en Leica DIVE/4TUNE/FALCON med två avstämbara lägeslåsta Ti:Sapphire multifotonlasrar med en pulslängd på 120 fs med ett multi-immersion 16x/NA0.6-mål (nedsänkningsvätska = glycerol) med ett maximalt arbetsavstånd på 2,2 mm. Se materialförteckningen för mer information om programvaran för bildförvärv. Kompletterande tabell S1 och tilläggsfigur S1 visar de inställningar som används för detta protokoll. För andra bildplattformar, kontakta mikroskopikärnans eller följ tillverkarens specifikationer/rekommendationer.

  1. Exempel på konfiguration
    1. Förbered installationen för montering av proverna. Använd till exempel en klibbig och flexibel silikonpackning för att skapa en självhäftande brunn. Placera limet väl på en 25 mm x 25 mm nr 1,5 mikro täckglas för att skapa en brunn där äggstockarna kommer att placeras (Figur 2B).
      OBS: En packning med 1 mm tjocklek rymmer alla storlekar av äggstockar. Denna inställning rekommenderas eftersom den eliminerar äggstocksrörelsen under avbildning, vilket kan uppstå när äggstockarna placeras i monteringsmedel i en glasbottenskål.
    2. Använd en pipettspets med spetsen avskuren (20 μL för prenatal och prepubertal), överför äggstockarna med ~ 5-10 μL ScaleS4 (0) lösning till mitten av limet som visas i figur 2B. För pubertala äggstockar, använd en 200 μL pipettspets med spetsen avskuren tillräckligt långt för att överföra äggstockarna. Tillsätt ~ 15-20 μL av ScaleCUBIC-2-lösningen i mitten av limbrunnen.
      OBS: För mycket lösning kan orsaka läckage på mikroskopstadiet, och för lite lösning kommer att resultera i dålig bildkvalitet. Använd ett dissektionsmikroskop för att överföra prover eftersom rensade äggstockar blir transparenta och är svåra att se.
    3. När äggstockarna har överförts till enskilda brunnar med en droppe rensningslösning, placera försiktigt ett annat täckglas på limbrunnen, tryck för att skapa en tätning och håll proverna på plats i en liten pool av rensningslösning inklämd mellan de två täckglasen (Figur 2B). För avbildning, placera täckglaset "sandwich" i en 3D-printad mikroskopadapterbild (t.ex. 43 ).
      OBS: Limbrunnar kan återanvändas efter dekonstruktion av "smörgåsen" och tvättning med vatten.
  2. Avbildning (kompletterande tabell S1 och tilläggsfigur S1)
    1. Slå på mikroskopet och programvaran enligt riktlinjerna för mikroskopikärnen eller tillverkaren. Placera de monterade proverna på mikroskopsteget och titta genom okularet för att lokalisera provet som tänds med en LED-fluorescenslampa med låg effekt.
    2. När proverna har hittats, slå på lasern (erna) och tilldela varje detektor till ett specifikt Alexa Fluor-färgämne / markör. För flera lasrar, möjliggöra sekventiell bildförvärv. Skaffa hela stacken innan du byter lasrar.
      OBS: För detta protokoll användes en laser för bildförvärv av både 555 nm och 647 nm fluoroforer.
    3. Ställ in parametrarna för bildförvärv enligt mikroskopikärnans eller tillverkarens specifikationer. Använd dubbelriktad bildinsamling, om tillgängligt, för att minska skanningstiden och förbättra effektiviteten. Justera andra inställningar, inklusive linjemedelvärdet (1), rammedelvärdet (1) och ramackumuleringen (1).
      OBS: Dubbelriktad bildförvärv gör det möjligt för lasrar att skanna i båda riktningarna när de rör sig på X-axeln.
    4. Ställ in Z-Stack genom att identifiera början (botten av provet/botten av glasluckan) och ändpositionen (överst på provet/det övre glaslocket). Välj en Z-stegstorlek på 2 μm för prepubertala äggstockar och 5 μm för pubertala äggstockar.
    5. Aktivera Z-kompensationsfunktionen och aktivera excitationsförstärkningen inom den här funktionen. Ställ in Z-kompensationen för botten och toppen av provet genom att välja en laserintensitet för både botten (låg intensitet) och toppstack (hög intensitet). Se tilläggsfigur S1, Linjär Z-kompensation, där excitationsförstärkningsrutan väljs, och laserintensiteten för botten (0) och toppen (347,75) är inställd som 10 respektive 12.
    6. Använd kakelläget för större exempel som inte kan avbildas i ett enda synfält. Aktivera bildnavigatorn och ange antalet paneler som behövs för att fånga hela provet med hjälp av det rektangulära markeringsverktyget.
    7. Starta bildförvärvet. För bilder med flera paneler startar du bildförvärvet med navigatorn för att fånga alla paneler. När bildförvärvet är klart sparar du först alla bilder, och om flera paneler har förvärvats kör du mosaikkopplingsverktyget för att sammanfoga panelerna till en enda bild.
    8. Spara de sammanslagna filerna i en separat projektmapp för att göra det enklare att arbeta med bilderna i Gigabyte-storlek. Överför filerna för bildbehandling med 3D-bildvisualisering och analysprogramvara. Figur 3 visar representativa bilder tagna i olika stadier med två markörer (GCNA och DDX4).

8. Bildbehandling

OBS: Alla steg som beskrivs nedan utvecklades och utfördes med hjälp av IMARIS 3D-bildvisualiserings- och analysprogramvara.

  1. Importera bilderna till programvaran för 3D-bildvisualisering och analys och konvertera vid behov filerna från originalformatet (t.ex. .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) till .ims-formatet.
  2. Bearbeta vid behov bilderna med det gaussiska filtret för att minska pixeleringen (figur 4A). Använd 3D-visningsfunktionen och placera bilden och avmarkera ramalternativet (för att ta bort ramen).
    OBS: Det finns andra valfria filter som också kan användas för att minska pixelering och minska bakgrundsintensiteten.
  3. Förstora bilden till en viss skala och använd funktionen Ögonblicksbild. Ställ in inställningarna enligt följande: välj 300 DPI, spara som TIFF-bild och Transparent bakgrund. Ta en ögonblicksbild av bilden och spara den. Figur 3 visar kompletta monterade bilder.

9. Oocytekvantifiering

OBS: Hel äggstocksimmunfluorescens och 3D-bildvisualisering och analys kan användas för uppskattning av oocytetal i hela äggstockar (figur 3 och figur 4) med hjälp av spotfunktionen. GCNA-signalen kan användas för att kvantifiera oocyter i prenatala och prepubertala äggstockar, som visas i figur 4 (P5). I pubertala äggstockar, använd DDX4-signalen för att kvantifiera två oocytepopulationer i icke-växande folliklar ("ringliknande" struktur, sluten pil) och växande folliklar (stora strukturer, öppen pil, figur 4, P28).

  1. Bestäm storleken på oocyter som ska användas som en parameter för att kvantifiera oocyter med funktionen Fläckar i steg 9.2.
    1. Öppna bilden och välj alternativet Slice för att öppna Z-stack-bilden.
    2. Välj alternativet Linje i panelen Mät och mät avståndet genom att rita en linje från en kant av en äggcell/markör till den andra kanten vid den bredaste punkten för att bestämma XY-diametern för den oocytetyp/storlek som ska räknas. Rör dig genom stapeln och erhålla diameterområdet för flera oocyter av samma typ. Använd den kortaste längden som storleksvalskriterium för oocyteantal.
  2. Spots-funktion : Välj alternativet 3D-vy och aktivera funktionen Lägg till nya fläckar i scenpanelen för att öppna panelen Algoritm . Avmarkera alla algoritminställningar eftersom filtret för storleksval med den oocytestorlek som erhölls i steg 9.1 kommer att användas.
    1. Klicka på den enda framåtpilen för att gå till källkanalen. Välj kanal med önskad markör och skriv in den uppskattade XY-diametern som erhölls i steg 9.1. Använd till exempel en uppskattad XY-diameter på 7 μm för prenatala oocyter och 11 μm för P5-oocyter (GCNA = grön signal; Figur 3 och figur 4A).
    2. Använd 30 μm för DDX4-signalen för att uppskatta antalet oocyter i växande folliklar i P5-äggstockar (DDX4 = magentasignal; Figur 3 och figur 4A). För pubertala äggstockar, använd DDX4-signalen för oocytekvantifieringar. Använd till exempel XY-diametrar på 15 μm och 80 μm för att identifiera oocyter i icke-växande folliklar respektive växande folliklar, som visas i figur 4A.
      OBS: Storleken som valts kan variera beroende på bildförvärvskriterier och vilken typ av mikroskop som används. Urvalet kan också variera mellan genetiska stammar eftersom äggstockar med fler oocyter kommer att kräva mindre storleksval för bättre automatiserad oocytedetektering.
    3. Efter storleksval aktiverar du modell PSF-förlängning och bakgrundssubtraktion, som bestäms automatiskt. Välj den enda framåtpilen för att gå till panelen Filterfläckar . Lägg till kvalitetsfiltret och bestäm ett tröskelvärde. För att säkerställa en korrekt uppskattning av oocytetal, förstora bilden när tröskeln justeras för att välja ett tröskelvärde som väljer de flesta oocyterna. Klicka på dubbelpilen för att avsluta automatiserade räkningar.
    4. Kontrollera manuellt de valda oocyterna med fliken Redigera för att välja missade oocyter eller avmarkera icke-oocytepartiklar som valts av det automatiska tröskelvärdet. Registrera data på fliken Statistik under fliken Övergripande för vidare analys.
      OBS: Parametrarna som används för att räkna fläckarna kan sparas och användas för en annan provuppsättning, men det rekommenderas att göra en manuell kontroll innan du kör batchanalys.
    5. För att lagra parametrarna, klicka på fliken Skapa och klicka på Lagra parametrar för batch.
      OBS: Kärnmarkörer (GCNA + oocyter, figur 4A) identifieras lätt av spotfunktionen och kanske inte kräver mycket manuell justering. Den cytoplasmatiska markören (DDX4+ äggcell, figur 3 (P28, sluten pil) och figur 4A) kommer dock att kräva mer manuell justering för att säkerställa identifiering av rätt storlek/typ av oocyter.

10. Kvantifiering av proteinuttryck i äggstockar

OBS: Det finns flera sätt att kvantifiera oocyteuttryck av specifika markörer med både funktionen Fläckar (avsnitt 9 och steg 10.1) och Yttredning (steg 10.2). Spots-funktionen kan användas för proteiner med distinkta lokaliseringsmönster såsom kärnmarkörer (GCNA), och funktionen Ytor kan användas för proteiner med ojämna lokaliseringsmönster som visas i figur 5A där LINE-1 ORF1p-intensiteter i E15.5 och E18.5 äggstockar mättes. För att beräkna och jämföra intensiteten hos proteinet av intresse mellan två prover (t.ex. tidpunkter, behandlingar eller genotyper), samla in bilder med samma egenskaper. Använd prover med en mer intensiv signal för att bestämma parametrarna som kan lagras och användas för de andra proverna.

  1. För att erhålla proteinuttrycket med funktionen Fläckar , identifiera först oocyter som markerade (avsnitt 9).
    1. Välj sedan fliken Statistik under funktionen Fläckar, följt av fliken Detaljerad. Klicka på nedåtpilen och välj Specifika värden, som öppnar en annan flik under den som innehåller olika mätningar. Välj intensitetsmedelvärdet för den kanal som används för ytgenereringen (eller välj andra intensitetsmätningar som intensitetsmedianen).
    2. Om du vill hämta den kombinerade/genomsnittliga statistiska informationen väljer du kriteriet Medelvärden . När du är klar exporterar du och sparar data för vidare analys.
  2. Om du vill hämta proteinuttrycket med funktionen Ytor öppnar du bilden, väljer alternativet 3D-vy och aktiverar funktionen Lägg till nya ytor i panelen Scen för att öppna panelen Algoritm . Avmarkera alla algoritminställningar om det inte behövs och klicka på den enda framåtpilen för att flytta till källkanalen.
    1. Välj kanalen med antikroppssignalen som ska mätas. Andra egenskaper att välja är användarspecifika alternativ. Här användes LINE-1-signalen som markör. Värdena Surfaces Detail och Background Subtraction (Local Contrast) behölls vid standardvärdena 1,42 respektive 5,33.
    2. Klicka på framåtpilen för att gå till panelen Tröskel . Välj ett tröskelvärde som är jämförbart i båda exemplen (t.ex. här användes LINE-1-uttryck i E18.5 för att välja ett tröskelvärde). Välj Aktivera med standarddiametern för startpunkter på 7,10 (det här värdet visade sig vara optimalt för bilderna men kan bero på den förväntade pixelstorleken på funktionerna).
    3. Klicka på framåtpilen för att gå till panelen Filterytor . Använd ett kvalitetsfilter användes och basera värdet, som med tröskelvärdet , på uttrycket av proteinerna i båda äggstocksproverna. När filteregenskapen har valts klickar du på den dubbla framåtpilen för att slutföra genereringen av ytan.
    4. Om du vill hämta intensitetsvärdena väljer du fliken Statistik följt av fliken Detaljerad . Klicka på nedåtpilen och välj Specifika värden, som öppnar en annan flik under den som innehåller olika mätningar.
    5. Välj intensitetsmedelvärdet för den kanal som används för ytgenereringen (eller välj andra intensitetsmätningar som intensitetsmedianen).
    6. Om du vill hämta den kombinerade/genomsnittliga statistiska informationen väljer du kriteriet Medelvärden . När du är klar exporterar du och sparar data för vidare analys (figur 5C).

11. Uppskattning av det totala oocytetalet i skadad äggstock med beräkningskorrigering

OBS: Om en mindre äggstocksskada uppstår under dissektion kan det vara möjligt att beräkningsmässigt uppskatta det totala oocytetalet. Det rekommenderas att använda intakta äggstockar från samma stam och utvecklingsstadium för uppskattning av oocytetal som visas i figur 6. Simuleringar utförda med äggstockar vid E15.5 indikerar att korrigering för en ≥30% förlust resulterar i en signifikant avvikelse från faktiska siffror (figur 6C).

  1. Öppna bilder av intakta äggstockar med IMARIS och välj funktionen Frame . Under Raminställningar markerar du etiketterna Ruta, Rutnät, Bockmarkeringar och Axel . Under fliken Position X/Y/Z väljer du 200 μm för att generera bockmarkeringar med 200 μm blanksteg i alla X/Y/Z-positioner.
    OBS: Kryssmarkeringarna skapar ett rutnät / linjal i X-, Y- och Z-plan för att identifiera oocyter inom en viss region.
  2. Aktivera funktionen Fläckar för att identifiera oocyterna som markeras i avsnitt 9 (Figur 4). Skapa en 3D-modell med hjälp av de oocyter som identifierats i alla intakta äggstockar som används för simuleringen genom att välja Sphere under fliken Points Style/Quality i funktionen Spots .
    OBS: Pixelbredden kan också ändras under fliken Poängstil/kvalitet.
  3. Med lådan genererad i steg 11.1 justerar du 3D-modellerna av de intakta äggstockarna i samma riktning som visas i figur 6A.
  4. Använd kryssmärkena 200 μm (steg 11.1), välj oocyter som faller inom 50% av volymen för varje äggstock. Klicka på funktionen Fläckar och välj Redigera etiketter för att klassificera de oocyter som faller inom 50% -regionen efter färg, som visas i figur 6A.
    OBS: När oocyter har klassificerats i en region kommer antalet oocyter som faller inom varje klass att tillhandahållas.
  5. Zooma in i 50% -regionen och ändra kryssmärkena från 200 μm till 50 μm för att skapa en mindre linjal för oocyteidentifiering. Behåll zoom % i alla bilder. Med 50 μm tickmarks som en guide, dela 50% regionen i fem lika delar.
    OBS: Oocyter inom varje del kommer att representera 10% av volymen som markeras i figur 6A, där en intakt äggstock visar oocyter i den övre halvan av äggstocken klassificerad av fem olika färger med varje färg som representerar oocyter inom en 10% volymetrisk region.
  6. Registrera oocytenumren i varje 10% region som visas i figur 6A,B. Beräkna det genomsnittliga antalet oocyter för steg om 10, 20, 30, 40 och 50%.
  7. Använd det markerade i steg 11.1 till 11.6 för att erhålla oocytetal i den skadade partiella äggstocken. Placera den skadade äggstocken i samma riktning som de intakta äggstockarna och uppskatta saknad volym / procentsats enligt beskrivningen ovan.
  8. För att uppskatta det totala oocytetalet i hela äggstocken, lägg till det genomsnittliga antalet oocyter beräknade för en liknande volym som det antal som erhållits från den partiella äggstocken (figur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunfärgning och avbildning av hela äggstocken möjliggör visualisering och kvantifiering av oocyter eller proteinuttryck i äggstockar i olika utvecklingsstadier med samma teknik och markörer (Figur 3). Detta protokoll utvecklades för ett storskaligt projekt där analys av äggstockar i flera steg och från flera musstammar krävdes. Här presenterar vi data som samlats in för C57BL6 / J-stammen, en standardstam för genetisk analys. Tekniken som presenteras här är enkel, resultaten kan erhållas inom 14-19 dagar (figur 2D) och kan användas för äggstockar från prenatala, prepubertala och pubertala kvinnor (figur 1 och figur 2A, B).

Detta tillvägagångssätt användes för att studera dynamiken i oocyteförlusten som uppträder naturligt under bildandet av äggstocksocytreserven. I många organismer, inklusive musen, tros oocytetalen toppa under fosterlivet runt den tid då oocyter går in i meios ~ E13.5. Oocytetalen minskar på grund av den fortfarande inte helt förstådda processen med fostrets oocytering (FOA) (från ~ E15.5 till E18.5), som har varit mekaniskt kopplad till uttrycket av retrotransposonen LINE-120,21. Fler oocyter elimineras efter E18,5 till P0 på grund av eliminering av onormala oocyter genom en meiotiskkvalitetskontrollpunkt 22,23. För att undersöka dessa processer med hjälp av detta protokoll immunfärgade och avbildade vi äggstockar i olika utvecklingsstadier med DDX4 och GCNA som äggcellsmarkörer som visas i figur 3.

Små oocyter som uttrycker GCNA och DDX4 ses från E15,5 och framåt och de representerar oocyter under MPI eller arresteras vid diktyat i primordiala folliklar. Större växande oocyter med starkt DDX4-uttryck detekteras redan i P2-äggstockar där de sannolikt representerar den första vågen av folliklar44. Allt fler större oocyter ses i P5- och P28-äggstockarna. Bilder erhållna genom multifotonmikroskopi (figur 4A) bearbetades med hjälp av IMARIS-programvara och 3D-rendering utfördes för att identifiera små och större växande oocyter baserat på den nukleära GCNA-signalen och den storlek som avgränsades av DDX4-signalen (figur 4A och video 1). Oocyter räknades enligt beskrivningen i protokollet och resultaten sammanfattas i figur 4B. I överensstämmelse med tidigare studier observerade vi en signifikant oocyteförlust från E15.5 till E18.5 (~ 32%) och E18.5 till P2 (~ 24%). När kvinnor når puberteten (P28) har endast ~ 30% av oocyterna som finns vid E15.5 överlevt.

Denna metod kan också användas för att observera konsekvenserna av genotoxiska behandlingar såsom bestrålning, som har visat sig helt eliminera den ursprungliga follikelreserven inom en vecka 23,38,45. En signifikant visuell skillnad är uppenbar mellan hela äggstocken som behandlas med strålning och den obehandlade kontrollen i figur 3 (jämförelse av P28-äggstockar från behandlade och obehandlade honor). I P28-äggstocken utan strålningsexponering observerade vi två oocytepopulationer märkta med DDX4; rikliga små oocyter i primordiala folliklar (sluten pil); och större oocyter av olika storlekar som vanligtvis finns i växande folliklar (t.ex. primära, sekundära och preantrala) (figur 3). Däremot saknar äggstocken från en hona som exponerats för 0,5Gy γ-strålning vid P7 helt små oocyter i primordiala folliklar som tidigare observerats i 2D-sektioner. Intressant nog överlevde endast större oocyter av liknande storlek strålning; dessa kan vara de första vågfolliklarna som redan växer i P7-äggstocken, eftersom de är kända för att vara resistenta mot strålning46 (Figur 3, P28).

Förutom kvantifiering av oocytetal kan detta protokoll användas för immunfärgning och kvantitativa analyser av andra proteiner som är involverade i oocytens utveckling. Till exempel använde vi antikroppar mot LINE-1ORF1p-protein, ett RNA-bindande chaperonprotein, producerat av LINE-1 retrotransposoner (Figur 5). Ökning av förekomsten av LINE-1-element från E15.5 till E18.5 har föreslagits orsaka oocyteliminering20,21. Med hjälp av multifotonfångade bilder och signalintensitetsanalys i IMARIS observerades LINE-1 ORF1p-nivåer öka signifikant i oocyter under denna tid, vilket korrelerar med en signifikant minskning av oocytetal som visas i figur 4B.

Under omständigheter där en del av en äggstock skadas eller förloras kan äggstockar från samma stam och utvecklingsstadium användas för att beräkningsmässigt uppskatta antalet oocyter inom den saknade regionen som visas i figur 6. Data från E15.5 äggstockar användes för simuleringar för att testa noggrannheten i beräkningskorrigeringar. Oocyter i äggstockar med upp till 30% vävnadsskada kan beräknas ha ≤10% avvikelse jämfört med oocyter i en intakt äggstock, vilket tyder på att 3D-äggstocksfärgning och modellering effektivt kan användas för att rädda data från värdefulla vävnader. Simuleringar utförda med äggstockar vid E15.5 indikerar att korrigering för en ≥30% förlust resulterar i en signifikant avvikelse från faktiska siffror (figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Äggstocksdissektion och perfusion från kvinnor från prenatala och postnatala stadier. (A-C) Äggstocksdissektion från olika stadier kräver olika tekniker, som avbildas schematiskt för att komplettera beskrivningarna i videon. (D) Äggstockarna vid postnatal dag 5 (P5) är mycket mindre än vid P28, vilket kräver ett annat clearingprotokoll som beskrivs i protokollet. (E,F) Korrekt perfusion av äggstockarna är viktigt för att eliminera bakgrundsfärgning från röda blodkroppar. Icke-perfuserade reproduktionsorgan och äggstockar har rosa nyans medan perfuserade organ blir vita. Förkortning: RI = icke-perfuserade reproduktionsorgan. Bilder A-C skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Immunfärgning, rensning och avbildning av hela musäggstockar. (A) Flödesschemat visar delade och specifika steg för immunfärgning och rensningsprotokoll för prenatala / prepubertala och pubertala äggstockar. (B) Rensade äggstockar monteras i en droppe rensningslösning i mitten av ett lim som är väl inklämt mellan två täckglidningar. För avbildning placeras de monterade proverna i en 3D-printad adapterbild. (C) Gråskala multifotonbilder av icke-perfuserade kontra perfuserade äggstockar, immunfärgade med oocytemarkören DDX4, som visar förbättrad bildkvalitet och lägre ospecifik färgning efter perfusion. Den slutna pilen indikerar en äggcell med ett tunt lager av cytoplasmatisk DDX4-färgning som är typisk för primordiala folliklar, och de öppna pilarna visar större oocyter i växande folliklar. Asterisk indikerar autofluorescens från blodkärl. (D) 3D återges från konfokala kontra multifotonbilder av P5-äggstockar, immunfärgade med oocytemarkörer GCNA (grön) och DDX4 (magenta), som visar en signifikant sfärisk avvikelse från konfokalmikroskopi och praktiskt taget ingen från multifoton. Skalstänger = 100 μm (C, D) och 50 μm (insatser i D). Förkortningar: GCNA = kärnsyrapeptidas i könsceller; DDX4 = DEAD-box helicase 4. Bild A skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa 3D-renderade bilder av äggstockar i olika utvecklingsstadier. 3D-renderingar från multifotonbilder av hela äggstockar immunfärgade med GCNA (grön) och LINE-1 ORF1p (blå) eller DDX4 (magenta), i prenatala respektive postnatala äggstockar. Enskilda kanaler presenteras i gråskala för att visa kärn- och cytoplasmatiska signaler. De vita rutorna skisserar regioner förstorade i de vänstra nedre insatserna. Två olika äggstockar visas för P28. Äggstocken från den icke-bestrålade honan (överst) innehåller en stor population av små oocyter i primordiala folliklar (se infälld). Däremot är äggstocken från honan bestrålad vid P7 med 0,5 Gy γ-strålning (IR) helt utan små oocyter i primordiala folliklar (se infälld). Den slutna pilen indikerar en äggcell med ett tunt lager av cytoplasmatisk DDX4-färgning som är typisk för primordiala folliklar, och öppna pilar visar större oocyter i växande folliklar. Skalstänger = 100 μm; 30 μm för P28-insatser; 10 μm för alla andra insatser. Inuppsättningar innehåller förstorade vyer av 3D-renderade bilder som genereras i IMARIS och kan skilja sig något från bilder med låg förstoring på grund av perspektiv. Förkortningar: Icke-IR = kontroll icke-bestrålad; IR = bestrålad vid P7 med 0,5 Gy γ-strålning; GCNA = kärnsyrapeptidas i könsceller; DDX4 = DEAD-box helicase 4; LINE-1 = långt isär kärnelement-1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Bildbehandling, 3D-visning av oocyter och kvantifieringsresultat. (A) 3D-renderingar från multifotonbilder (vänster) bearbetades i IMARIS med hjälp av Gaussiskt filter (mitten) och oocyter av små och stora storlekar identifierades med hjälp av spotfunktionen (höger). P5 och P28 äggstockar visas som exempel. Skalstänger = 100 μm (P5); 10 μm (P5-insatser); 300 μm (P28); 50 μm (P28-insatser). (B) Små oocyter som är positiva för GCNA kvantifierades i äggstockar från olika stadier med hjälp av fläckegenskaper (överst). För att illustrera det minskande antalet oocyter under utvecklingen beräknades den genomsnittliga % av oocyterna vid varje steg jämfört med det genomsnittliga antalet närvarande i det tidigaste skedet räknat vid E15,5 (botten). Observera den stora nedgången i oocytetal från E15,5 till E18,5. Data presenteras som medel ± SD. Statistiska analyser utfördes med hjälp av GraphPad Prism-programvaran och analyserades av envägs ANOVA, och betydelsen bestämdes av Bonferronis post-hoc multipla jämförelsetest. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0.05. Förkortning: GCNA = kärnsyrapeptidas i könsceller; ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Detektion och kvantifiering avLINE-1 ORF1p-uttrycket i fostrets oocyter. (A) 3D-renderingar från multifotonbilder visar LINE-1 ORF1p (blått) uttryck i E15.5 och E18.5 fosteroocyter (markerade med grön GCNA). (B) 3D-ytor som genereras i IMARIS med hjälp av bilder på översta raden i panel A. (C) LINE-1 ORF1p-intensitetsanalys visar högre uttryck av LINE-1 ORF1p per oocyte vid E18,5 än E15,5. Skalstänger = 100 μm; 10 μm (panel A-insatser ); 30 μm (panel B-insatser ). Data presenteras som medel ± SD. Statistiska analyser utfördes med hjälp av GraphPad Prism-programvaran och analyserades av Studentens t-test, och betydelsen bestämdes av Mann-Whitney U-testet . P ≤ 0,0001; ns >0.05. Förkortningar: GCNA = kärnsyrapeptidas i könsceller; LINE-1 = långt isär kärnelement-1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Metod för att uppskatta det totala oocytetalet i skadade äggstocksprover med beräkningskorrigering. (A) Modell av GCNA-positiva (gröna) E15.5-oocyter med fem 10% regioner markerade i rött, blått, grått, magenta och brunt i en intakt äggstock. Varje efterföljande bild, efter den intakta äggstocken, representerar en simulerad äggstock med 10% inkrementella regioner som saknas upp till 50%. (B) Schematisk beräkningsmetod för att uppskatta oocytentalet i det skadade provet. (C) Det totala antalet oocyter i simulerade äggstockar jämfördes med antalet i de ursprungliga intakta äggstockarna (betraktas som 100 %) och skillnaden presenteras som en avvikelse i %. Simulering från sex enskilda äggstockar med 10-50% volym saknas. Skalstänger = 80 μm. Förkortning: GCNA = kärnsyrapeptidas i könsceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 1: 3D-rendering och 3D-modellering av oocyter i P5 äggstockar. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Lösningar och buffertar Reagens(er) Sammansättning
Fixativ Paraformaldehyd 4 % (v/v)
Buffert för permeabilisering Polyvinylalkohol (PVA) 0,2 % (vikt/v)
Natriumborhydrid 0,1 % (vikt/v)
Triton X-100 1,5 % (v/v)
Blockering av buffert Albumin från bovint serum (BSA) 3 % (vikt/v)
1 M glycin (pH 7,4) 2 % (vikt/v)
Triton X-100 0,1 % (v/v)
200x Penicillin-Streptomycin 1 % (v/v)
10% Natriumazid 0,2 % (v/v)
get serum 10 % (v/v)
Tvättbuffert PVA 0,2 % (vikt/v)
Triton X-100 0,15 % (v/v)
10% Natriumazid 0,1 % (v/v)
SkalaS4(0)-lösning (pH 8.1) D-Sorbitol 40 % (vikt/v)
Urea 24 % (vikt/v)
Glycerol 10 % (v/v)
DMSO 20 % (v/v)
ScaleCUBIC-1-lösning Urea 25 % (vikt/v)
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hydroxipropyl)etylenderamin 25 % (v/v)
Triton X-100 15 % (v/v)
Sackaroslösning Sackaros 20 %(w/v)
ScaleCUBIC-2-lösning Sackaros 50 % (med v)
Urea 25 % (vikt/v)
Trietanolamin 10 % (vikt/v)
Triton X-100 0,1 % (v/v)

Tabell 1: Lösningar och buffertar.

Kompletterande figur S1: Inställningar för bildförvärv. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S1: Inställningar för bildförvärv. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna artikel presenterar ett detaljerat 3D-immunfärgnings- och avbildningsprotokoll för prenatala och postnatala äggstockar för hög genomströmning och jämförande studier för bakteriecellskvantifiering och proteinlokalisering. Vi utvecklade detta protokoll för att analysera oocytetal i äggstockar (N = 6-12) vid sex utvecklingstidpunkter i 10-16 olika stammar, där 2-4 24-brunnsplattor vanligtvis bearbetas samtidigt. Denna metod kan anpassas för andra organ eller cellulära markörer. Till exempel kan detta protokoll användas för att märka och visualisera somatiska celler, såsom granulosaceller i äggstocken, med hjälp av lämpliga antikroppar, vilket underlättar studier av somatisk-bakteriecellinteraktion eller utveckling av andra äggstockscelltyper.

En begränsning av detta protokoll och antikroppskombination är den definitiva identifieringen av olika follikulära stadier. DNA-fläckar som används vid immunofluorescens och 2D-avbildning för att identifiera follikulära stadier av lager av granulosacellkärnor är otillräckliga för 3D-metoder. 4′,6-diamidino-2-fenylindolen (DAPI) eller Hoechst används sällan för helorganfärgning på grund av begränsad ljuspenetration och sönderfallande signal i mitten av stor vävnad. Propidiumjodid (PI) är en liten molekyl som kan tränga djupt in i vävnaden men är svår att fånga på multifotonavbildningssystemet på grund av spektral överlappning. Bättre upplösning av follikulära stadier kan uppnås genom ytterligare markörer som är specifika för granulosaceller, såsom anti-Mullerian hormon (AMH) eller FOXL247,48. Men även om dessa markörer är till hjälp för att differentiera större växande folliklar, kommer de inte att skilja primordial från primära folliklar. Tills specifika markörer för dessa tidiga stadier blir tillgängliga erbjuder oocytemarkörer som DDX4 eller GCNA den bästa indikatorn på follikelutveckling. Vidare fungerar detta protokoll för prenatala manliga gonader men har ännu inte testats i postnatala testisor där dess storlek kan vara den begränsande faktorn. Kritiska frågor listas nedan för bättre visualisering och kvantifiering av könsceller i äggstockar av varierande storlek och de tekniker och åtgärder som vidtagits för att säkerställa immunfärgning av god kvalitet för nedströmsanalys belyses.

Det första kritiska steget är att förhindra skador på äggstockarna före och efter fixering. Skadade äggstockar kan sakna delar av organstrukturen, vilket påverkar oocytenumren och snedvrider de experimentella resultaten. För att förhindra skador lämnas extra somatisk vävnad fäst vid den större äggstocken efter dissektion för att ta tag i pincett för överföring av äggstockarna. Vidare, för mindre äggstockar, överför dem med en pipettspets skuren tillräckligt bred för att äggstockarna lätt ska passa in i spetsen undviker skador. Om mindre vävnadsskador resulterar i att en del av äggstocken saknas kan den mildras med en beräkningsmetod där det totala oocytetalet i det skadade provet kan extrapoleras med intakta prover av samma typ (Figur 6).

Beräkningssimuleringar avslöjade emellertid att förutsägelsenoggrannheten minskar med ökande storlek på det skadade området (100,8% ± 0,2, 97,2% ± 1,5 och 90,3% ± 1 för 10, 20 respektive 30% skada Figur 6C). Baserat på simuleringar rekommenderar vi att prover med >30 % förlust undantas från analysen. Flera intakta äggstockar från samma provtyp användes för att beräkna det genomsnittliga antalet oocyter i området som liknar det som saknas i skadat prov. Detta nummer användes sedan för att förutsäga det totala antalet oocyter i äggstocken med skador. Användning av liknande storleksområde i samma äggstocksanliggande den saknade regionen kan användas som ett alternativ men testades inte.

En annan fråga är att undvika att förorena celler som kan orsaka autofluorescens. För pubertala äggstockar måste perfusion, som beskrivits ovan, med både 1x PBS och 1% PFA utföras för att eliminera blodkroppar som kommer att orsaka autofluorescens (Figur 2C). Perfusion med PBS bör fortsätta tills organ, särskilt äggstockarna och njurarna, rensas från blod och blir vita innan de byter till 1% PFA (Figur 1E,F). Ineffektiv perfusion med PBS kommer att resultera i en hög bakgrund som kan maskera och göra visualiseringen av små oocyter svår. Perfusion med lägre (1%) eller högre (4%) procentandelar av PFA resulterar i bättre bildkvalitet än perfusion med PBS ensam; Därför användes den lägre andelen PFA.

Optimering av antikroppsfärgning kräver uppmärksamhet på flera variabler. För permeabiliseringssteget befanns 4 timmar vara idealiskt för denna analys, med perioder längre än 4 timmar (6-8 timmar testade) vilket resulterade i ingen färgning alls. Eftersom mängden och kostnaden för antikroppar som används för storskaliga immunfärgningsexperiment kan vara hög, testades och optimerades detta protokoll för att återanvända antikroppsblandningar utan förlust av immunfärgningskvalitet. För återanvändning måste antikroppsblandningen kompletteras med färsk antikropp enligt beskrivningen i protokollet. Tvättsteg är också avgörande för kvaliteten på immunfärgning och bör utföras längre för att uppnå ett bättre signal-brusförhållande under avbildning och bör bestämmas för varje valfri antikropp. För bästa resultat rekommenderar vi att du förbereder ScaleS4(0)-rensningslösningen nyligen för varje användning, medan ScaleCUBIC-1 och ScaleCUBIC-2 kan förvaras i rumstemperatur i mörker i ~1-2 månader.

ScaleCUBIC-1-röjningen utförs vid 37 °C. Viktigt är att högre temperaturer bör undvikas eftersom de kommer att resultera i reagensutfällning, vilket kan påverka kvaliteten på immunfärgningen. Att montera flera prover för avbildning kan vara tidskrävande. Agar eller andra inbäddningsmetoder som används i andra protokoll är arbetsintensiva och kan behöva ytterligare omrensning av prover 47,49,50. Återanvändbara kiselpackningar kan användas som självhäftande brunnar som är lätta att använda med täckglas och erbjuds i olika storlekar och djup för att rymma andra provstorlekar. För att uppnå högkvalitativa bilder måste en tillräcklig volym clearinglösning användas. för lite kommer att resultera i dålig bildkvalitet, och för mycket lösning kan läcka ut på mikroskopet. Detta steg bör optimeras för specifika prover beroende på deras storlek. Glasbottenskålar kan användas men prover måste immobiliseras för avbildning eftersom även de minsta rörelserna kommer att snedvrida bilden. Kiselpackningar kan användas i kombination med en glasbottenskål och toppdäck för att immobilisera proverna för avbildning. Detta kommer emellertid att begränsa förmågan att vända provet om avbildning från båda sidor behövs på grund av storleken på äggstocken.

Ett annat kritiskt val för denna storskaliga metod med hög genomströmning var avbildning på Leica DIVE/4TUNE/FALCON-plattformen med två avstämbara MP-lasrar (Spectra-Physics). Fördelarna med att använda DIVE-plattformen inkluderar enkel provmontering (beskrivs ovan), minimering av optisk distorsion (jämfört med konfokala plattformar) och viktigast av allt, bildhastighet och hantering av förvärvade bilddata. Avbildningsprover med multifotonlasrarna vid högre förstoring (16x) är mycket snabbare och orsakar mindre fotoskador än konfokala lasrar på Leica DIVE eller SP8 med liknande inställningar för bildförvärv med LAS X-programvara. MP-strålen är låg, dess fluorofor excitation är mycket lokaliserad till brännpunkten och uppnår mer djup vid låg förstoring utan att orsaka fotoskador trots ett högre antal rumsliga / axiella bildsteg (konfokal: ~ 300-400 sektioner maximalt, MP: >800 sektioner).

Målet 16x/NA0,6 möjliggör korrigering för små brytningsindexmatchningar på grund av prov- och monteringsfördelning längs den optiska axeln via en mekanisk korrigeringskrage, som ställs in optimalt för maximal signal, halvvägs in i provet. Dessutom kan sfäriska strukturer, såsom oocyter, förvrängas genom konfokal bildförvärv eftersom djupberoende lokalisering av konfokalplanet (signal) på grund av monterings- och provbrytningsindexmatchningar vid en given pinhålsinställning kan uppstå (Figur 2D). Eftersom fluorescenssignalen fångas in via instrumentets inre pinhål för att avlägsna signal utanför fokus, kan den inneboende optiska distorsionen (sfärisk aberration) bli värre djupare in i provet, vilket är problematiskt för större äggstockar (dvs ~ 400-600 mikrometer tjocklek).

Med samma matchande linskorrigeringsinställningar kan praktiskt taget ingen sfärisk aberration detekteras på DIVE MP-systemet med varierande emissionsvåglängder, vilket förenklar kvantifierings- och samlokaliseringsstudier (figur 2D). Slutligen möjliggör den högeffektspulserade lasern spännande lägre fluoroforkoncentration djupt inne i provet, i synnerhet när den används med Z-djupexcitationskorrigeringen. Dessutom förbättras fångsten av svagare signaler också av MP-hybriddetektorn (HyD-RLD), som är en kombination av vanliga fotomultiplikerarrör och lavinfotonräkningsdetektorer, vilket möjliggör mer än 30 gånger högre signaldetektering över ett brett spektrum av emissionsvåglängder.

Light sheet (LS) multifotonmikroskopi är en annan framväxande plattform för 3D-vävnadsavbildning47. LS kräver dock mer installationstid för makroskopiska prover, inklusive agarinbäddning och installation för avbildning. Dessutom kan bilder som förvärvas vid högre förstoring med provrotation generera stora >100 GB-filer, vilket kan vara nödvändigt för att ta bort ljusarkskuggningsartefakter (på grund av brytningsindexmatchningar av det yttre mediet och det inre av provet eller provytförvrängningar). Den presenterade metoden för montering av prover i lösning i limbrunnar är enkel och snabb.

Dessutom möjliggör detta tillvägagångssätt avbildning av flera äggstockar i en brunn med en inställning och utan vändning eller rotation. Att vända täckglaset "sandwich" kan dock behövas för större äggstockar. DIVE-systemavbildningen är snabbare än konfokal och LS; vid 16x förstoring avbildas den prepubertala äggstocken på 3-5 min (Z-steg 2 μm) och pubertetsäggstocken i 1 timme (Z-steg 5 μm). Dessutom är filer som genereras i LAS X av hanterbar storlek (2–20 GB), vilket också är avgörande för ett stort antal prover för nedströmsanalys. Även om detta immunfärgningsprotokoll optimerades för användning i kombination med DIVE-plattformen, kan immunfärgade prover avbildas med hjälp av andra MP / LS-plattformar med vissa modifieringar.

Fördelen med hela äggstocksfärgningen med 3D-modelleringsprotokoll är den effektiva och relativt enkla dataanalysen jämfört med manuell datainsamling i 2D-analys. IMARIS 3D-visualiserings- och analysprogramvara valdes eftersom den är kommersiellt tillgänglig och erbjuds av många mikroskopikärnor, inte kräver programmeringskunskaper och är kompatibel med många programvaruplattformar för bildförvärv som LAS X från Leica eller ZEN från ZEISS. Med IMARIS ställs standardparametrarna in som markerade i protokollavsnittet, och dessa parametrar kan användas för andra bilder och prover med mindre förändringar, vilket förbättrar reproducerbarheten och effektiviteten.

Bildanalys och kvantifiering är optimerade för IMARIS programvara; Liknande analyser kan dock göras på annan kommersiell eller öppen källkod datavisualiseringsprogramvara enligt liknande principer. Sammanfattningsvis har ett optimerat protokoll presenterats här för avbildning av hela äggstockar för kvantitativa och kvalitativa analyser. Detta anpassades målmedvetet för kraven på den bearbetning med hög genomströmning som i allt högre grad kommer att krävas för toxikologisk testning, kliniska och diagnostiska ändamål och genomomfattande analyser av regulatorer av äggstockarnas tillräcklighet och funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag (R01 HD093778 till E.B-F och T32 HD007065 till R.B). Vi tackar Zachary Boucher för hans hjälp med strålningsexperiment. Vi tackar Mary Ann Händel för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Sonia Erattupuzhas och Microscopy Core Service vid The Jackson Laboratory för experthjälp med mikroskopiarbetet som beskrivs i denna publikation och Jarek Trapszo från Scientific Instrument Services vid The Jackson Laboratory för att designa den 3D-tryckta adapterbilden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchtop Incubator Benchmark Scientific H2200-H 37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D1435 Hazardous material
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S6021
Dumont #5 Forceps FST 91150-20
FastWells Reagent Barriers GraceBio 664113 Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors FST 91460-11
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Glycine ThermoFisher Scientific BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21246 Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434 Dilution 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
IMARIS Software Oxford Instruments Version 9.7.0 Image visualization and analysis software
Insight X3 Spectra-Physics InSight X3 Tunable Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
LASX software Leica Version 3.5.6 Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON Leica Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406 Multiphoton Microscope
MaiTai HP Spectra-Physics Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller SPW Industrial Model: 7553-50 Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors FST 14010-17 5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm VWR 48366-249
Mini BioMixer Benchmark Scientific B3D1020 shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270 Leica  SMZ1270 stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline ThermoFisher Scientific BP2944100 Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution ThermoFisher Scientific ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine) Sigma-Aldrich 122262
Rabbit anti-DDX4/MVH Abcam ab27591 Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p Abcam ab216324 Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA Abcam ab82527 Dilution 1:500
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Hazardous material
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 Hazardous material
Sucrose ThermoFisher Scientific S0389
Tekmar Orbital Shaker Bimedis VXR-S10 shaker for room temperature
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
UNOLOK Infusion Set MYCO Medical 7001-23 needles for perfusion
Urea Amresco 97061-920
X-Cite 120LED Excelitas S/N XT640-W-0147 low-power LED fluorescence lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308 (2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343 (2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330 (2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772 (2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782 (2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007 (2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121 (2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242 (2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113 (2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117 (2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35 (2019).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 175
Hel äggstocksimmunfluorescens, rensning och multifotonmikroskopi för kvantitativ 3D-analys av den utvecklande äggstocksreserven i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boateng, R., Boechat, N., Henrich,… More

Boateng, R., Boechat, N., Henrich, P. P., Bolcun-Filas, E. Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse. J. Vis. Exp. (175), e62972, doi:10.3791/62972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter