Bioluminescence का उपयोग कर चूहों में स्तन कैंसर के विकास और मेटास्टेटिक कॉलोनी गठन की निगरानी
Summary
यहां, हम विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों में लूसिफेरस और हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को शामिल करने वाली एक noninvasive निगरानी विधि का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल चूहों में वास्तविक समय में ट्यूमर गठन और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण की निगरानी करने के लिए एक तकनीक प्रदान करता है।
Abstract
स्तन कैंसर एक लगातार विषम दुर्दमता है और महिलाओं में मृत्यु दर का दूसरा प्रमुख कारण है, मुख्य रूप से दूर के अंग मेटास्टेसिस के कारण। कई पशु मॉडल उत्पन्न किए गए हैं, जिनमें व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल शामिल हैं, जहां कैंसर कोशिकाओं को स्तन वसा पैड में इंजेक्ट किया जाता है। हालांकि, ये मॉडल ट्यूमर विकास कैनेटीक्स और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण की निगरानी करने में मदद नहीं कर सकते हैं। चूहों में वास्तविक समय में कैंसर कोशिकाओं की निगरानी करने के लिए अत्याधुनिक उपकरण ट्यूमर जीव विज्ञान की समझ को काफी आगे बढ़ाएंगे।
यहां, स्तन कैंसर सेल लाइनों को दृढ़ता से लुसिफेरस और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हुए स्थापित किया गया था। विशेष रूप से, इस तकनीक में विट्रो में लूसिफेरस गतिविधि को मापने के द्वारा शुरू किए गए दो अनुक्रमिक चरण शामिल हैं और इसके बाद कैंसर कोशिकाओं को गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (एनओडी-एससीआईडी) चूहों के स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है। इंजेक्शन के बाद, ट्यूमर की वृद्धि और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण दोनों को वास्तविक समय में noninvasive bioluminescence इमेजिंग सिस्टम द्वारा मॉनिटर किया जाता है। फिर, फेफड़ों में जीएफपी-व्यक्त मेटास्टेसिस के परिमाणीकरण की जांच प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा की जाएगी ताकि मनाया बायोल्यूमिनेसेंस परिणामों को मान्य किया जा सके। लूसिफेरस और प्रतिदीप्ति-आधारित पहचान उपकरणों के संयोजन वाली यह परिष्कृत प्रणाली विवो में कैंसर मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करती है, जिसमें स्तन कैंसर चिकित्सीय और रोग प्रबंधन में उपयोग की बड़ी क्षमता है।
Introduction
स्तन कैंसर दुनिया भर में कैंसर के अक्सर प्रकार हैं, संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल लगभग 250,000 नए मामलों का निदान किया जाताहै। इसकी उच्च घटनाओं के बावजूद, एंटीकैंसर दवाओं के एक नए सेट ने स्तन कैंसर के रोगी परिणामों में काफी सुधार कियाहै। हालांकि, ये उपचार अभी भी अपर्याप्त हैं, क्योंकि कई रोगियों को रोग के पुनरुत्थान और मेटास्टैटिक प्रसार का अनुभव होता हैमहत्वपूर्ण अंग2, जो रोगी रुग्णता और मृत्यु दर का प्राथमिक कारण है। इसलिए, स्तन कैंसर अनुसंधान में मुख्य चुनौतियों में से एक उनके विकास को रोकने के लिए नए साधन विकसित करने के लिए डिस्टल मेटास्टेसिस के गठन को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की पहचान कर रहा है।
कैंसर मेटास्टेसिस एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाएं प्राथमिक ट्यूमर से अलग हो जाती हैं और रक्त परिसंचरण के माध्यम से पड़ोसी ऊतकों पर आक्रमण करती हैं। इस प्रकार, पशु मॉडल जिसमें कोशिकाएं एक समान मेटास्टैटिक कैस्केड से गुजरती हैं, इस प्रक्रियाको 3,4 नियंत्रित करने वाले तंत्र की पहचान की सुविधा प्रदान कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, विवो मॉडल में ये स्तन कैंसर चिकित्सीयएजेंटों 5,6 के विकास के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, ये ऑर्थोटोपिक मॉडल वास्तविक ट्यूमर विकास कैनेटीक्स को इंगित नहीं कर सकते हैं क्योंकि प्रभाव केवल समाप्ति पर निर्धारित किया जाता है। इसलिए, हमने वास्तविक समय में ट्यूमर के विकास और मेटास्टैटिक उपनिवेशीकरण का पता लगाने के लिए एक लूसिफेरस-आधारित उपकरण स्थापित किया। इसके अतिरिक्त, ये कोशिकाएं मेटास्टैटिक कॉलोनियों का पता लगाने के लिए जीएफपी व्यक्त करती हैं। यह दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सरल है और इसमें कोई आक्रामक प्रक्रियाएं शामिल नहींहैं। इस प्रकार, लुसिफेरस और प्रतिदीप्ति का पता लगाने का संयोजन स्तन कैंसर चिकित्सीय और रोग प्रबंधन के प्रीक्लिनिकल अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए एक सहायक रणनीति है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पशु-आधारित प्रयोग कैंसर अनुसंधान 7,8,9 के लिए अनिवार्य हैं, और वास्तव में कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं 3,6,10,11,12,13,14<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वाईडीएस प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम छोटे पशु इमेजिंग सुविधा प्रदान करने के लिए हदासाह मेडिकल सेंटर, यरूशलेम में ट्रांसलेशनल मेडिसिन के लिए वोहल इंस्टीट्यूट को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड से अनुसंधान कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
