مراقبة نمو سرطان الثدي وتكوين مستعمرة النقيلي في الفئران باستخدام التلألؤ الحيوي
Summary
هنا ، نصف طريقة مراقبة غير جراحية تتضمن تعبير لوسيفيراز وبروتين الفلورسنت الأخضر في خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة. يوفر هذا البروتوكول تقنية لمراقبة تكوين الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي في الفئران.
Abstract
سرطان الثدي هو ورم خبيث غير متجانس متكرر والسبب الرئيسي الثاني للوفيات لدى النساء ، ويرجع ذلك أساسا إلى ورم خبيث في الأعضاء البعيدة. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية ، بما في ذلك نماذج الفئران العظمية المستخدمة على نطاق واسع ، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في وسادة الدهون الثديية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه النماذج المساعدة في مراقبة حركية نمو الورم والاستعمار النقيلي. الأدوات المتطورة لمراقبة الخلايا السرطانية في الوقت الحقيقي في الفئران ستعزز بشكل كبير فهم بيولوجيا الورم.
هنا ، تم إنشاء خطوط خلايا سرطان الثدي التي تعبر بثبات عن luciferase وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). على وجه التحديد ، تحتوي هذه التقنية على خطوتين متتابعتين بدأتا بقياس نشاط luciferase في المختبر وتليها زرع الخلايا السرطانية في منصات الدهون الثديية للفئران غير البدينة. بعد الحقن ، تتم مراقبة كل من نمو الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي بواسطة نظام التصوير غير الباضع. بعد ذلك ، سيتم فحص القياس الكمي للنقائل المعبرة عن GFP في الرئتين بواسطة المجهر الفلوري للتحقق من صحة نتائج التلألؤ الحيوي المرصودة. يقوم هذا النظام المتطور الذي يجمع بين أدوات الكشف القائمة على اللوسيفيراز والتألق بتقييم ورم خبيث للسرطان في الجسم الحي ، والذي يتمتع بإمكانات كبيرة للاستخدام في علاجات سرطان الثدي وإدارة الأمراض.
Introduction
سرطان الثدي هي أنواع متكررة من السرطان في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 250،000 حالة جديدة يتم تشخيصها كل عام في الولايات المتحدة1. على الرغم من ارتفاع معدل الإصابة به ، إلا أن مجموعة جديدة من الأدوية المضادة للسرطان قد حسنت بشكل كبير نتائج مرضى سرطان الثدي2. ومع ذلك ، لا تزال هذه العلاجات غير كافية ، حيث يعاني العديد من المرضى من انتكاس المرض وانتشاره النقيلي إلى الأعضاء الحيوية2 ، وهو السبب الرئيسي لاعتلال المرضى ووفياتهم. لذلك ، فإن أحد التحديات الرئيسية في أبحاث سرطان الثدي هو تحديد الآليات الجزيئية التي تنظم تكوين النقائل البعيدة لتطوير وسائل جديدة لمنع تطورها.
ورم خبيث سرطاني هو عملية ديناميكية تنفصل فيها الخلايا عن الورم الأساسي وتغزو الأنسجة المجاورة من خلال الدورة الدموية. وبالتالي ، فإن النماذج الحيوانية التي تخضع فيها الخلايا لسلسلة نقيلي مماثلة يمكن أن تسهل تحديد الآليات التي تحكم هذه العملية 3,4. بالإضافة إلى ذلك ، هذه النماذج في الجسم الحي ضرورية لتطوير عوامل علاج سرطان الثدي 5,6. ومع ذلك ، لا يمكن أن تشير هذه النماذج التقويمية إلى حركية نمو الورم الفعلية حيث يتم تحديد التأثير فقط عند الإنهاء. لذلك ، أنشأنا أداة قائمة على luciferase للكشف عن تطور الورم والاستعمار النقيلي في الوقت الفعلي. بالإضافة إلى ذلك، تعبر هذه الخلايا عن GFP للكشف عن المستعمرات النقيلية. هذا النهج بسيط نسبيا ولا ينطوي على أي إجراءات غازية3. وبالتالي ، فإن الجمع بين اكتشاف لوسيفيراز والتألق هو استراتيجية مفيدة للمضي قدما في الدراسات قبل السريرية لعلاجات سرطان الثدي وإدارة الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
التجارب القائمة على الحيوانات إلزامية لأبحاث السرطان7،8،9 ، وبالفعل تم تطوير العديد من البروتوكولات3،6،10،11،12،13،14.<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر Y.D.S. نود أن نشكر معهد وول للطب الانتقالي في مركز هداسا الطبي في القدس على توفير مرفق تصوير الحيوانات الصغيرة. تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة التطوير الوظيفي البحثي من صندوق أبحاث السرطان الإسرائيلي.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
