Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência
Summary
Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.
Abstract
O câncer de mama é uma malignidade heterogênea frequente e a segunda principal causa de mortalidade em mulheres, principalmente devido à metástase de órgãos distantes. Vários modelos animais foram gerados, incluindo os modelos de camundongos ortotópicos amplamente utilizados, onde células cancerígenas são injetadas na almofada de gordura mamária. No entanto, esses modelos não podem ajudar a monitorar cinética de crescimento tumoral e colonização metastática. Ferramentas de ponta para monitorar células cancerígenas em tempo real em camundongos avançarão significativamente na compreensão da biologia tumoral.
Aqui, foram estabelecidas linhas de células cancerígenas de mama expressando a luciferase e a proteína fluorescente verde (GFP). Especificamente, esta técnica contém duas etapas sequenciais iniciadas pela medição da atividade luciferase in vitro e seguida pela implantação das células cancerosas em almofadas de gordura mamária de camundongos de imunodeficiência combinada (NOD-SCID) de nonobese. Após a injeção, tanto o crescimento do tumor quanto a colonização metastática são monitorados em tempo real pelo sistema de imagem de bioluminescência não invasiva. Em seguida, a quantificação das metástases expressas por GFP nos pulmões será examinada por microscopia de fluorescência para validar os resultados de bioluminescência observados. Este sofisticado sistema que combina ferramentas de detecção baseadas em luciferase e fluorescência avalia a metástase do câncer in vivo, que tem grande potencial para uso em terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.
Introduction
Os cânceres de mama são tipos frequentes de câncer em todo o mundo, com aproximadamente 250.000 novos casos diagnosticados a cada ano nos Estados Unidos1. Apesar de sua alta incidência, um novo conjunto de medicamentos anticancerígenos melhorou significativamente os resultados de pacientes com câncerde mama 2. No entanto, esses tratamentos ainda são inadequados, pois muitos pacientes experimentam recaída da doença e propagação metastática para órgãos vitais2, que é a principal causa de morbidade e mortalidade do paciente. Portanto, um dos principais desafios na pesquisa sobre câncer de mama é identificar os mecanismos moleculares que regulam a formação de metástases distais para desenvolver novos meios para inibir seu desenvolvimento.
A metástase do câncer é um processo dinâmico no qual as células se desprendem do tumor primário e invadem tecidos vizinhos através da circulação sanguínea. Assim, modelos animais em que as células sofrem uma cascata metastática semelhante podem facilitar a identificação dos mecanismos que regem esse processo 3,4. Além disso, esses modelos in vivo são essenciais para o desenvolvimento de agentes terapêuticos de câncer de mama 5,6. No entanto, esses modelos ortotópicos não podem indicar a cinética real do crescimento do tumor, pois o efeito só é determinado após o término. Por isso, estabelecemos uma ferramenta baseada em luciferase para detectar o desenvolvimento de tumores e a colonização metastática em tempo real. Além disso, essas células expressam GFP para detectar as colônias metastáticas. Esta abordagem é relativamente simples e não envolve nenhum procedimento invasivo3. Assim, combinar a detecção de luciferase e fluorescência é uma estratégia útil para avançar nos estudos pré-clínicos de terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentos em animais são obrigatórios para a pesquisa sobre câncer 7,8,9, e de fato muitos protocolos foram desenvolvidos 3,6,10,11,12,13,14. No entanto, a maioria desses estudos determinou o …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório Y.D.S. Gostaríamos de agradecer ao Instituto Wohl de Medicina Translacional no Centro Médico Hadassah, em Jerusalém, por fornecer a pequena instalação de imagens de animais. Este estudo foi apoiado pelo Research Career Development Award do Israel Cancer Research Fund.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
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