Summary
여기에서, 우리는 다양한 유방암 세포주에서 루시퍼라제 및 녹색 형광 단백질 발현을 수반하는 비침습적 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 마우스에서 실시간으로 종양 형성 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 기술을 제공한다.
Abstract
유방암은 빈번한 이질적인 악성 종양이며 주로 먼 장기 전이로 인해 여성의 사망률의 두 번째 주요 원인입니다. 암세포가 유선지방 패드에 주입되는 널리 사용되는 동위원소 마우스 모델을 포함하여 여러 동물 모델이 생성되었다. 그러나, 이들 모델은 종양 성장 동역학 및 전이성 콜로니화를 모니터링하는 것을 도울 수 없다. 생쥐에서 실시간으로 암세포를 모니터링하는 최첨단 도구는 종양 생물학에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다.
여기서, 루시퍼라아제와 녹색 형광 단백질(GFP)을 안정적으로 발현하는 유방암 세포주가 확립되었다. 구체적으로, 이 기술은 시험관 내에서 루시퍼라제 활성을 측정하고 이어서 비비만 당뇨병-중증 복합 면역결핍(NOD-SCID) 마우스의 유선지방 패드에 암세포를 이식함으로써 개시되는 두 개의 순차적 단계를 포함한다. 주사 후, 종양 성장 및 전이성 콜로니화 둘 모두는 비침습적 생체발광 이미징 시스템에 의해 실시간으로 모니터링된다. 이어서, 폐에서 GFP 발현 전이의 정량화는 관찰된 생체발광 결과를 검증하기 위해 형광 현미경에 의해 검사될 것이다. 루시퍼라아제와 형광 기반 검출 도구를 결합한 이 정교한 시스템은 유방암 치료제 및 질병 관리에 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있는 생체 내 암 전이를 평가합니다.
Introduction
유방암은 전 세계적으로 빈번한 유형의 암으로, 미국에서 매년 약 250,000 건의 새로운 사례가 진단됩니다1. 높은 발생률에도 불구하고 새로운 항암제 세트는 유방암 환자 결과를 크게 개선했습니다2. 그러나 많은 환자들이 질병 재발과 전이성이 환자의 이환률과 사망률의 주요 원인 인 중요한 장기로 전이되어전이성 확산을 경험하기 때문에 이러한 치료법은 여전히 부적절합니다. 따라서, 유방암 연구의 주요 과제 중 하나는 원위 전이의 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하여 이들의 발달을 억제하는 새로운 수단을 개발하는 것이다.
암 전이는 세포가 원발성 종양에서 분리되어 혈액 순환을 통해 이웃 조직을 침범하는 역동적 인 과정입니다. 따라서, 세포가 유사한 전이성 캐스케이드를 겪는 동물 모델은 이러한 과정(3,4)을 지배하는 메카니즘의 식별을 용이하게 할 수 있다. 추가적으로, 이러한 생체내 모델은 유방암 치료제(5,6)를 개발하는데 필수적이다. 그러나, 이들 동위원소 모델은 효과가 종결시에 결정되기 때문에 실제 종양 성장 동역학을 나타낼 수 없다. 따라서 우리는 종양 발생과 전이성 식민지화를 실시간으로 탐지하는 루시페라아제 기반 도구를 확립했습니다. 추가적으로, 이들 세포는 GFP를 발현하여 전이성 콜로니를 검출한다. 이 접근법은 비교적 간단하며 어떠한 침습적 절차도 수반하지 않는다3. 따라서, 루시퍼라아제와 형광 검출을 결합하는 것은 유방암 치료제 및 질병 관리의 전임상 연구를 진전시키는 데 유용한 전략이다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 히브리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회-승인 프로토콜 MD-21-16429-5 하에 수행되었다. 또한, 히브리 대학은 실험실 동물 관리의 평가 및 인증을위한 협회 (AAALAC)의 인증을 받았습니다.
1. 세포주 정비
참고: 인간 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-468 및 MDA-MB-231)가 이 프로토콜에 사용되었다.
- 모든 유방암 세포주를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하고, 가습된 이산화탄소(5%CO2) 배양기에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다.
참고 : 정기적으로 세포 밀도를 확인하십시오. 70 % 합류율에 도달 할 때 향후 사용을 위해 분할하고 확장하십시오.
2. 바이러스 준비
- HEK293T 세포가 분리될 때까지 1mL의 트립신으로 치료하십시오.
- 트립신 활성을 중화시키기 위해 DMEM (10% FBS) 10 mL를 첨가하고, 세포 현탁액을 새로운 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
- 150 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 원심분리 후 상층액을 버리고 신선한 DMEM 배지 1 mL를 첨가한다.
- 세포 농도를 결정하고 6 웰 플레이트에서 106 세포 / 웰× 1.2 종자.
- 다음 날, 형질감염 시약, 무혈청 DMEM, 엔벨로프 플라스미드 (VSV-G), 렌티바이러스 패키징 플라스미드 (ΔVPR), 및 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드를 포함하는 필요한 모든 시약을 예열한다.
- 1.5 mL 오토클레이브 원심분리 튜브에서, 50 μL의 무혈청 DMEM을 0.3 μg의 VSV-G 플라스미드, 1 μg의 ΔVPR, 및 1.2 μg의 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 플라스미드 또는 FUW GFP 플라스미드와 혼합한다.
- 이들 플라스미드를 배지와 완전히 혼합한 후, 형질감염 시약 5 μL를 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 인큐베이션 후, 상기 혼합물을 HEK293T 세포에 적가한다.
- 24시간 후, 성장 배지를 2 mL의 (30% FBS) DMEM으로 교체한다. 다음날(형질감염 후 48시간)에, 바이러스("pLX304 루시페라제-V5 또는 FUW GFP 바이러스")를 함유하는 배지를 수확한다.
참고: 30% FBS를 사용하면 바이러스 생산 효율성이 향상됩니다. - 임의의 HEK293T 세포 잔기를 피하기 위해, 바이러스 함유 배지를 0.45 μm 시린지 필터 또는 원심분리기를 통해 5분 동안 150 × g 에서 통과시키고, 상청액을 수집한다.
참고: 장기간 보관하려면 바이러스의 작동 분취량을 -80°C에서 유지하십시오.
3. GFP와 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 세포 확립 ("GFP + Luc+ 세포")
- 세포를 감염시키기 전날, 6 웰 플레이트에 웰 당 8 개의 × 10 개의5 개의 세포를 시드하십시오.
- 하룻밤 동안 배양한 후, 성장 배지를 8 μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지로 교체한다. 200 μL의 FUW GFP 바이러스를 세포에 적가한다.
- 선택사항: 바이러스 효율을 향상시키기 위해, 플레이트를 560 × g 에서 30분 동안 원심분리(37°C)한다(스핀 감염).
- 세포를 48시간 동안 인큐베이션하고, GFP 발현을 형광 현미경으로 검증한다.
- GFP 발현 세포를 형광 활성화 세포 분류 (FACS) (GFP+)에 의해 정렬한다 (도 1A).
- GFP 분류된 세포를 단계 3.2에 기재된 바와 같이 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 바이러스로 감염시킨다.
- 세포를 감염 후 30시간 후에 블라스티시딘(10μg/mL)으로 처리하여 pLX304 루시페라제-V5 블라스트 발현 세포(GFP+, Luc+ 세포)를 풍부하게 합니다. 그런 다음 이틀마다 블라스티시딘을 함유 한 신선한 배지로 교체하십시오. 추가적으로, 대조군으로서, 나이브 세포를 동일한 블라스티시딘 함유 배지로 치료한다.
참고 : 감염된 세포와 대조 세포 간의 명확한 차이는 블라스티시딘 치료 며칠 후에 관찰되어야합니다. 이 효과는 세포주에 의존적이며 보통 ~ 8-10 일이 걸립니다. 열악한 생존율은 낮은 바이러스 생산 수율을 나타낼 것이다. 그렇다면 낮은 효율로 새로운 바이러스 배치를 생산하면 향후 실험에 영향을 줄 수 있습니다.
4. 체외 루시퍼라아제 활성 검증
- MCF-7, MDA-MB-468, 및 MDA-MB-231 GFP+ Luc+ 세포를 15 cm 플레이트에서 80% 컨플루언시로 성장시킨다. 단계 2.1-2.2에 기재된 바와 같이 트립신화에 의해 세포를 수확한다.
- 각 웰 (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104)에서 증가하는 세포 수를 검정색 96-웰 플레이트에 시드한다.
참고: 검은색 96웰 플레이트는 흰색 또는 투명 플레이트가 자동 발광 신호를 생성하므로 루시퍼라제 수준을 측정하는 데 더 적합합니다. 대조군으로서, PBS로부터의 자가발광이 없는지 확인하기 위해 하나의 웰에 인산완충식염수(PBS)를 단독으로 사용한다. - 모든 웰을 100 μL의 DMEM으로 채우고 16-24 h 동안 인큐베이션한다.
- PBS 중의 루시페린 용액을 30 mg/mL의 스톡으로부터 1.5 mg/mL 농도로 준비한다. 루시페린 용액의 스톡을 분취액하고 -20°C에서 보관한다.
- 세포를 PBS로 1회 부드럽게 세척하고, 각 웰에 루시페린 용액 100 μL를 첨가하고, 2분 동안 기다린다. 마지막으로, 생체발광을 이용하여 모든 유방암 세포에서 루시퍼라제 활성을 측정한다.
참고: 동물 실험 전에 시험관내 GFP 및 루시퍼라제 발현을 검사하는 것이 중요합니다. 또한 빈 웰은 배경을 뺀 데 사용됩니다.
5. GFP+ Luc+ 세포에 쥐 주입하기
- 5 × 106 (MCF-7 및 MDA-MB-468) 또는 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ 세포를 각각 200 μL 또는 100 μL PBS 내로 옮긴다.
- 주사하기 전에 멸균 된 생물학적 후드를 5 % 소독제 용액으로 청소 하십시오 (자료 표 참조). 이어서, 마우스를 2-3분 동안 1 L/min의 기류 속도로 4% 이소플루란을 함유하는 여과된(0.2 μm) 공기로 마취시킨다.
주: 적절한 마취를 확인하는 것이 필수적입니다. 마우스의 발가락을 꼬집고 어떤 반응을 찾으십시오. - 마취 된 마우스 머리 위에 원뿔을 수핀 위치에 놓습니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
- 면봉을 사용하여 에탄올로 유선의 위 마우스의 복부 부위를 닦고 포셉으로 4번째 유선을 들어 올립니다.
- 바늘 27 G x 3/4 (0.4 x 19 mm)를 지방 패드 아래에 넣고 세포 현탁액 100 μL를 천천히 주입하십시오.
참고: 피부 아래에 둥근 팽창이 나타납니다. 또한, 부적절한 주사는 동일한 실험군에서 종양 성장 속도 또는 종양의 부재에 편차를 초래할 수 있다. - 주사 절차가 끝나면 마우스를 후드에서 꺼내 새 케이지로 옮깁니다. 그들이 의식으로 돌아갈 때까지 생쥐를 모니터링하십시오.
주: 사용된 바늘과 주사기가 모두 날카로운 상자에 버려졌는지 확인하십시오.
6. GFP+ Luc+ 마우스의 루시퍼라제 수준 측정
- 생체 발광 검출 전에 왼손으로 목을 잡고 의식이있는 마우스를 억제하십시오. 그런 다음 손을 왼쪽으로 기울이면 마우스가 위쪽으로 향하게되고 하체가 수핀 위치에 있습니다.
- 바늘 크기가 27G x 3/4(0.4 x 19mm)인 1.0 mL 주사기를 사용하여 왼쪽 아래 복부 사분면의 마우스 복부 표면에 복강내(i.p.) 루시페린(30mg/mL) 100μL를 주입합니다.
참고 : 바늘 끝은 내장 장기에 침투 할 수 있으므로 복벽에서 3-5mm 이상 삽입해서는 안됩니다. 또한, 마취 된 마우스의 체내에서 루시페린 분포가 의식이있는 마우스보다 느리기 때문에 마취없이 i.p. 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 따라서, 의식이있는 마우스에서 루시퍼라제 수준을 모니터링하는 것이 더 빠른 절차입니다. - 마우스를 마취 없이 7분 동안 유지한 다음, 종양 동역학을 측정하기 전에 마취 챔버 내에서 3분 동안 유지하였다.
참고 : 배양 시간은 실험, 세포주 및 종마다 다릅니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 배양 시간을 교정하는 것이 좋습니다. - 단계 5.2-5.3에 기재된 바와 같이 마우스를 마취시킨다.
- 인큐베이션 중에 소프트웨어(재료 테이블)를 열고 이미징 시스템을 초기화한 다음 초기화 버튼을 클릭합니다.
참고 : 카메라가 식히고 -90 °C에 도달하는 데 ~ 10 분이 걸립니다. 추가적으로, 배경 대조군으로서, 순진한 마우스(즉, 루시퍼라제 유전자를 발현하지 않는 세포를 주입한 GFP+ 마우스)에서 루시퍼라제 수준을 측정한다. - 다음 설정을 사용하여 자동 노출 설정을 유지하십시오 : 노출 시간 자동, 60 초; 비닝 매체, F / 정지 1; 차단된 여기 필터; 방출 필터가 열려 있습니다. 초기화 가 끝나면 이미징 마법사를 선택| 생체 발광을 클릭하고 다음 |를 클릭하십시오. 필터 | 열기 이미지 제목에서 마우스 를 선택합니다.
- 필드 뷰에서 스테이지 C(10cm)와 피사체 높이: 1.50cm를 선택합니다.
- 이미지 설정 스테이지를 C로 클릭하고 획득 버튼을 클릭하기 전에 마우스가 적절한 수핀 위치의 스테이지에 배치되어 있는지 확인합니다.
- 도어를 닫고 획득 단추를 클릭한 다음 이미지가 화면에 나타날 때까지 기다립니다.
참고: 자동 노출 옵션을 사용하면 신호에 따라 강한 신호가 5-20초가 걸립니다. 약한 신호는 약 60 초가 소요됩니다. - 다른 마우스에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 폐 전이를 감지하려면 두꺼운 검은 판지 종이를 사용하여 원발성 종양의 강한 신호를 덮고 폐의 복부 측면 만 카메라 쪽으로 노출시킵니다. 위에서 설명한 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
7. 생체 발광 및 형광을 이용한 생체 외 이미지 획득
- 데시케이터에서 이산화탄소(CO2) 흡입을 사용하여 마우스를 안락사시키고 오토클레이브 가위와 포셉을 사용하여 마우스를 해부한다.
- 0.9% 식염수를 사용하여 마우스를 관류시키고, 장기를 수확하고, 1x PBS로 헹구어 장기로부터 혈액 얼룩을 제거한다.
- 헹굼 된 장기를 페트리 접시에 옮겨 생체 발광 기계의 무대에 놓습니다. 단계 6.2-6.6에 설명된 것과 동일한 생체발광 설정을 적용한다.
참고: 루시퍼라아제 신호의 감소로 인해 이 단계는 시간 제한이 있습니다. 따라서, 마우스를 안락사시킨 후, 즉시 생체 발광에 의해 장기를 시각화한다. - GFP 이미지의 경우, 생체 발광 대신 형광 GFP 필터를 사용하여 단계 6.3에서 설명한 것과 동일한 설정을 적용합니다.
- 스테레오 현미경을 사용하여 폐 이미지를 촬영하여 GFP+ 콜로니의 존재를 검사합니다.
8. 생체 발광 데이터 분석
- 소프트웨어를 두 번 클릭하고 파일 메뉴에서 열기를 선택합니다.
- 모든 파일을 열고 최소화하십시오. 모든 유닛이 래디언스(광자)인지 확인하십시오. 또한 모두에 적용을 클릭하여 모든 이미지에 대해 동일한 매개 변수를 유지합니다.
- 보기 메뉴에서 도구 팔레트를 선택하면 새 창이 열립니다.
- 도구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 평균 Bkg ROI를 선택합니다.
- ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 흉부 영역에 작은 원을 그립니다.
- 원을 두 번 클릭하고 백그라운드 ROI 탭에서 향후 ROI를 위해 BKG로 사용 옵션을 선택한 다음 완료를 클릭합니다.
9. 총 플럭스 측정
- 공구 팔레트 창에서 ROI 도구 탭을 선택하고 유형에서 ROI 측정을 선택합니다.
- ROI 도구에서 원을 선택하고 마우스의 원발성 종양에 큰 원을 그립니다.
- ROI 복사를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 ROI 붙여넣기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 각 마우스의 모든 개별 파일에 넣습니다.
- ROI 도구 탭에서 ROI 측정을 클릭하면 ROI 측정이라는 새 창이 열립니다. 이 탭에서 측정 유형을 광도(광자)로, 이미지 속성을 모든 채워진 값으로 유지합니다.
- 파일을 측정 파일 (*.txt) 또는 Csv(*.csv) 형식으로 내보냅니다.
- 스프레드시트에서 내보낸 데이터를 열고 총 플럭스(p/s) 와 주 값을 가져옵니다.
참고: 이 단계는 다른 그룹을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 , 비히 클로 치료받은 마우스와 약물로 치료받은 마우스. - 시간이 Y축을 따라 X축과 총 플럭스(p/s)를 따라 표시되는 XY 플롯을 생성합니다. 매주 각 표본 그룹에 대한 총 플럭스(p/s) 매개 변수를 취하고 비모수 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의한 차이를 확인합니다.
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Representative Results
우리는 GFP 및 루시퍼라제 벡터를 발현하는 유방암 세포주 (MDA-MB-231, MCF-7 및 MDA-MB-468)를 생성하였다. 구체적으로, 이것은 순차적 감염에 의해 달성되었다. 먼저, 유방암 세포주를 형광 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. GFP 양성 세포(GFP+)를 감염 2일 후(도 1A, B) 분류하고 pLX304 루시페라제-V5 벡터에 감염시켰다. 이어서, 블라스티시딘을 사용하여 루시퍼라아제를 선택하여 지시된 (GFP+, Luc+) 세포를 생성하였다. 시험관내 루시퍼라제 활성을 검증하기 위해, 루시퍼라제 활성 수준의 세포 수 의존적 증가를 입증하였다(도 1C). 또한, 루시퍼라제 활성과 세포 수 사이에 선형 상관관계가 발견되었다(도 1D).
마우스에서 루시퍼라제 검출을 확인하기 위해, 세 개의 GFP+, Luc+ 유방암 세포주 모두를 여성 NOD/SCID 마우스의 유성 지방 패드에 주사하였다. 그 후, 마우스를 종양 성장 동역학을 확인하기 위해 두 주마다 생체발광 판독을 실시하였다. 우리는 종양 성장 동역학이 세포주마다 다르다는 것을 발견했습니다. 보다 공격적인 MDA-MB-231에서는 더 빠르고, 덜 공격적인 세포주 MCF-7 및 MDA-MB-468에서는 더 느립니다(그림 2).
다음으로, MDA-MB-231 세포주에 의해 생성된 단리된 종양의 형광 판독값을 수득하였다. 구체적으로, 주사 후 6주째에, GFP 형광을 확인하기 위해 마우스로부터 종양을 수확하였고; 종양이 그들의 GFP 발현을 유지하는 것으로 밝혀졌다 (도 3A). 다음 목표는 생체 발광 기계를 사용하여 살아있는 마우스의 폐에서 전이성 콜로니 형성을 실시간으로 평가할 수 있는지 여부를 결정하는 것이 었습니다. 양성 생체발광 판독값은 전체 마우스의 폐로부터 수득되었다(도 3B). 이들이 양성 전이성 콜로니임을 확인하기 위해, 폐를 수확하고, GFP 및 생체발광에 대해 전이성 콜로니를 관찰하였다(도 3C).
도 1: 세포에서의 GFP 발현 및 루시퍼라제 활성의 검증 . (A) GFP 세포를 FACS에 의해 분류하였다. MDA-MB-231 비-GFP 및 GFP+ 세포의 대표적인 이미지. (b) MDA-MB-231, MCF-7, 및 MDA-MB-468 세포를 GFP 발현 바이러스에 감염시키고, 이어서 FACS 분류하였다. 각 세포주의 이미지는 브라이트필드(왼쪽) 및 GFP(오른쪽)로 표시된다. 세포를 니콘 이클립스 80i 현미경으로 10x 배율로 포획하였다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 각 세포에서 루시퍼라제 활성에 의한 생체발광을 발광계에 의해 결정하였다. 점점 더 많은 수의 세포( A에서와 같이)를 검정 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 색상 막대는 발광의 강도를 나타냅니다. (d) MDA-MB-231 세포의 루시퍼라제 활성을 입증하는 XY 플롯 ( C로 측정됨). 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; SSC-A = 측면 산란 피크의 영역; GFP+ = GFP 양성; FACS = 형광-활성화 세포 분류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 종양 성장의 동역학은 생체발광 기계에 의해 결정되었다. 생체내 종양 성장 동역학은 NOD-SCID 마우스에서 매주 결정되었고, 대표적인 이미지는 (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MDA-MB-468에 대한 생체발광을 사용하여 캡처되었다. 색상 막대는 발광의 강도를 나타냅니다. (d) 발광 활성의 정량화는 총 플럭스로서 제시된다. (e) MDA-MB-231 마우스; 개별 독서는 줄거리로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 종양 형성 및 폐 전이를 검증하기위한 다양한 접근법. (A) 마우스를 관류시키고, MDA-MB-231 세포로부터 생성된 종양을 수확하였다. 종양에서의 GFP 수준은 생체발광기에 의해 측정되었다. (b) 생체발광에 의해 나타난 바와 같이 전체 마우스에서의 폐 전이. (c) 전이의 존재를 확인하기 위해, 폐를 수확하고 SMZ18 니콘 입체현미경(브라이트필드 및 GFP)하에 관찰하였다. 생체발광-Luc-샘플을 마우스를 안락사시킨 직후에 취하였다. 색상 막대는 발광의 강도를 나타냅니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; Luc = 루시페라제; BLI = 생체 발광 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물 기반 실험은 암 연구 7,8,9에 필수적이며, 실제로 많은 프로토콜이 개발되었습니다 3,6,10,11,12,13,14. 그러나, 이들 연구의 대부분은 실험의 끝에서만 생물학적 효과를 결정하고, 따라서 종양 성장 동역학 또는 전이 콜로니화에 대한 영향은 결정되지 않은 채로 남아있다. 여기서, 우리는 GFP 및 루시퍼라아제를 발현하는 세포를 유방 지방 패드에 접종함으로써 비침습적 이중 생체발광 접근법을 제공한다. 이 강력한 도구를 사용하여, 종양 발달 및 전이는 마우스에서 실시간으로 모니터링될 수 있다(14). 그러나이 기술에는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있으므로 특별한주의가 필요합니다. 예를 들어, 본 실험의 성공을 위한 중요한 단계 중 하나는 마우스 주입 전에 세포에서 루시퍼라제 및 GFP 발현 수준을 모니터링함으로써 감염의 효율을 검증하는 것이다. 따라서, 블라스티시딘 투여량15 및 렌티바이러스 생산16 프로토콜은 실험 효율을 증가시키기 위해 각 세포주에 대해 최적화되어야 한다.
몇 가지 기술적 인 문제는 생체 내 실험에서 생체 발광 신호에 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 문제에는 생체 발광 판독 동안 마우스의 움직임이 포함되며, 이는 이미지 품질을 방해하여 종양 운동 곡선에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 동물은 기질 주사 후 및 전체 절차 중에 완전히 마취되어야합니다. 또한 기계에 여러 동물을 동시에 배치하면 신호가 높은 마우스가 강도가 낮은 동물을 가릴 수 있으므로 발광 판독의 불일치가 발생할 수 있습니다. 따라서 발광 판독값은 각 마우스에 대해 개별적으로 촬영해야 합니다.
시험관 내 생체 발광 판독을 수행 할 때, 배지에 신호를 방해 할 수있는 혈청 및 기타 보충제가 포함되어 있으므로 배양 배지를 PBS로 교체하는 것이 중요합니다. 추가적으로, PBS(세포 없음)만을 포함하는 샘플의 발광 신호를 측정함으로써 배경 판독을 제거할 필요가 있다.
이 프로토콜은 유방암 세포의 성장 및 전이를 측정하기 위한 비침습적 기술을 기술한다. 구체적으로, 본 논문은 GFP와 루시퍼라아제를 모두 발현하는 유방암 세포주를 마우스 유선지방 패드에 주입하는 것을 설명한다. 이러한 조합은 생체내 및 생체외에서 전이성 콜로니화를 측정하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다.
이 방법의 분명한 장점에도 불구하고 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 주요 제약 조건은 생체 발광 기계의 필요성인데, 이는 상대적으로 비싼 기계이므로 항상 사용할 수있는 것은 아니기 때문입니다. 또한 각 읽기는 시간이 많이 걸리므로 기계를 초과 예약하거나 사용할 수 없습니다. 또 다른 제한 사항은 프로토콜 자체를 나타냅니다. 생체 외 샘플에서 생체 발광 신호를 검출하려면 마우스를 안락사시키고 즉시 샘플을 검사하는 것이 좋습니다. 이 단계는 시간 제한 단계이며 대규모 실험 집합에서는 실현 가능하지 않습니다.
결론적으로,이 비 침습적 생체 발광 도구는 마우스에서 종양 발생 및 전이를 감지하는 데 매우 민감합니다. 이 프로토콜은 유방암에만 국한되지 않으며 폐암 및 췌장암과 같은 다른 암종에도 적용될 수 있습니다. 또한, 비침습적이기 때문에, 항암제(12 )의 효능 및 종양 성장 동역학에 대한 이들의 효과를 실시간으로 측정하는데 적용될 수 있다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 공개했습니다.
Acknowledgments
Y.D.S. 연구소 회원들에게 감사드립니다. 예루살렘 하다사 메디컬 센터(Hadassah Medical Center)에 있는 Wohl Institute for Translational Medicine에 작은 동물 영상 시설을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 암 연구 기금 (Israel Cancer Research Fund)의 연구 경력 개발 상 (Research Career Development Award) 의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P.
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M.
- Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
