Overvågning af brystkræftvækst og metastatisk kolonidannelse hos mus ved hjælp af bioluminescens
Summary
Her beskriver vi en ikke-invasiv overvågningsmetode, der involverer luciferase og grøn fluorescerende proteinekspression i forskellige brystkræftcellelinjer. Denne protokol giver en teknik til at overvåge tumordannelse og metastatisk kolonisering i realtid hos mus.
Abstract
Brystkræft er en hyppig heterogen malignitet og den næststørste årsag til dødelighed hos kvinder, hovedsageligt på grund af fjern organmetastase. Flere dyremodeller er blevet genereret, herunder de meget anvendte ortotopiske musemodeller, hvor kræftceller injiceres i brystfedtpuden. Disse modeller kan imidlertid ikke hjælpe med at overvåge tumorvækstkinetik og metastatisk kolonisering. Banebrydende værktøjer til overvågning af kræftceller i realtid i mus vil betydeligt fremme forståelsen af tumorbiologi.
Her blev brystkræftcellelinjer stabilt udtrykt luciferase og grønt fluorescerende protein (GFP) etableret. Specifikt indeholder denne teknik to sekventielle trin initieret ved at måle luciferaseaktiviteten in vitro og efterfulgt af implantation af kræftcellerne i brystfedtpuder af ikke-overvægtige diabetiker-svær kombineret immundefekt (NOD-SCID) mus. Efter injektionen overvåges både tumorvækst og metastatisk kolonisering i realtid af det ikke-invasive bioluminescensbilleddannelsessystem. Derefter vil kvantificeringen af GFP-ekspresserende metastaser i lungerne blive undersøgt ved fluorescensmikroskopi for at validere de observerede bioluminescensresultater. Dette sofistikerede system, der kombinerer luciferase og fluorescensbaserede detektionsværktøjer, evaluerer kræftmetastase in vivo, som har stort potentiale til brug i brystkræftterapi og sygdomshåndtering.
Introduction
Brystkræft er hyppige kræftformer på verdensplan, med ca. 250.000 nye tilfælde diagnosticeret hvert år i USA1. På trods af den høje forekomst har et nyt sæt kræftlægemidler signifikant forbedret brystkræftpatienternes resultater2. Disse behandlinger er dog stadig utilstrækkelige, da mange patienter oplever sygdomstilbagefald og metastatisk spredning til vitale organer2, hvilket er den primære årsag til patientens sygelighed og dødelighed. Derfor er en af de største udfordringer inden for brystkræftforskning at identificere de molekylære mekanismer, der regulerer dannelsen af distale metastaser for at udvikle nye midler til at hæmme deres udvikling.
Kræftmetastase er en dynamisk proces, hvor celler løsner sig fra den primære tumor og invaderer nabovæv gennem blodcirkulationen. Således kan dyremodeller, hvor cellerne gennemgår en lignende metastatisk kaskade, lette identifikationen af de mekanismer, der styrer denne proces 3,4. Derudover er disse in vivo-modeller afgørende for at udvikle terapeutiske midler til brystkræft 5,6. Disse ortotopiske modeller kan imidlertid ikke indikere den faktiske tumorvækstkinetik, da effekten kun bestemmes ved afslutning. Derfor etablerede vi et luciferasebaseret værktøj til at detektere tumorudvikling og metastatisk kolonisering i realtid. Derudover udtrykker disse celler GFP for at detektere de metastatiske kolonier. Denne fremgangsmåde er relativt enkel og involverer ingen invasive procedurer3. Således er kombination af luciferase og fluorescensdetektion en nyttig strategi til at fremme de prækliniske undersøgelser af brystkræftterapi og sygdomshåndtering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dyrebaserede forsøg er obligatoriske for kræftforskning 7,8,9, og der er faktisk udviklet mange protokoller 3,6,10,11,12,13,14. Imidlertid bestemte de fleste af disse undersøgelser kun den biolog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af Y.D.S. laboratoriet. Vi vil gerne takke Wohl Institute for Translational Medicine på Hadassah Medical Center, Jerusalem, for at stille billeddannelsesanlægget til rådighed for små dyr. Denne undersøgelse blev støttet af Research Career Development Award fra Israel Cancer Research Fund.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
