Мониторинг роста рака молочной железы и метастатического колониеобразования у мышей с использованием биолюминесценции
Summary
Здесь мы описываем неинвазивный метод мониторинга, включающий экспрессию люциферазы и зеленого флуоресцентного белка в различных клеточных линиях рака молочной железы. Этот протокол обеспечивает технику мониторинга образования опухоли и метастатической колонизации в режиме реального времени у мышей.
Abstract
Рак молочной железы является частым гетерогенным злокачественным новообразованием и второй по значимости причиной смертности у женщин, в основном из-за отдаленных метастазов в органы. Было создано несколько моделей на животных, в том числе широко используемые ортотопические мышиные модели, где раковые клетки вводятся в жировую прокладку молочной железы. Однако эти модели не могут помочь контролировать кинетику роста опухоли и метастатическую колонизацию. Передовые инструменты для мониторинга раковых клеток в режиме реального времени у мышей значительно улучшат понимание биологии опухоли.
Здесь были установлены клеточные линии рака молочной железы, стабильно экспрессирующие люциферазу и зеленый флуоресцентный белок (GFP). В частности, этот метод содержит два последовательных шага, инициированных измерением активности люциферазы in vitro и сопровождаемых имплантацией раковых клеток в подушечки молочного жира мышей с комбинированным иммунодефицитом (NOD-SCID). После инъекции как рост опухоли, так и метастатическая колонизация контролируются в режиме реального времени неинвазивной системой визуализации биолюминесценции. Затем количественная оценка GFP-экспрессирующих метастазов в легких будет исследована флуоресцентной микроскопией для подтверждения наблюдаемых результатов биолюминесценции. Эта сложная система, сочетающая в себе люциферазу и инструменты обнаружения на основе флуоресценции, оценивает метастазирование рака in vivo, что имеет большой потенциал для использования в терапии рака молочной железы и лечении заболеваний.
Introduction
Рак молочной железы является частым типом рака во всем мире, причем в Соединенных Штатах ежегодно диагностируется около 250 000 новых случаев1. Несмотря на высокую заболеваемость, новый набор противоопухолевых препаратов значительно улучшил исходы лечения рака молочной железы2. Тем не менее, эти методы лечения по-прежнему неадекватны, так как многие пациенты испытывают рецидив заболевания и метастатическое распространение на жизненно важные органы2, что является основной причиной заболеваемости и смертности пациентов. Поэтому одной из основных задач в исследованиях рака молочной железы является выявление молекулярных механизмов, регулирующих образование дистальных метастазов, для разработки новых средств для ингибирования их развития.
Метастазирование рака – это динамический процесс, при котором клетки отделяются от первичной опухоли и вторгаются в соседние ткани через кровообращение. Таким образом, животные модели, в которых клетки подвергаются подобному метастатическому каскаду, могут облегчить идентификацию механизмов, управляющих этим процессом 3,4. Кроме того, эти модели in vivo необходимы для разработки терапевтических агентов рака молочной железы 5,6. Однако эти ортотопические модели не могут указывать фактическую кинетику роста опухоли, поскольку эффект определяется только после прекращения. Поэтому мы создали инструмент на основе люциферазы для обнаружения развития опухоли и метастатической колонизации в режиме реального времени. Кроме того, эти клетки экспрессируют GFP для обнаружения метастатических колоний. Этот подход относительно прост и не предполагает каких-либо инвазивных процедур3. Таким образом, сочетание люциферазы и обнаружения флуоресценции является полезной стратегией для продвижения доклинических исследований терапии рака молочной железы и лечения заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эксперименты на животных являются обязательными для исследования рака 7,8,9, и действительно было разработано много протоколов 3,6,10,11,12,13,14<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим сотрудников лаборатории Y.D.S. Мы хотели бы поблагодарить Институт трансляционной медицины Воля в Медицинском центре Хадасса, Иерусалим, за предоставление центра визуализации мелких животных. Это исследование было поддержано премией Research Career Development Award от Израильского фонда исследований рака.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
