Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia
Summary
Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.
Abstract
El cáncer de mama es una neoplasia maligna heterogénea frecuente y la segunda causa de mortalidad en las mujeres, principalmente debido a la metástasis de órganos a distancia. Se han generado varios modelos animales, incluidos los modelos de ratón ortotópicos ampliamente utilizados, donde se inyectan células cancerosas en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, estos modelos no pueden ayudar a monitorear la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica. Las herramientas de vanguardia para monitorear las células cancerosas en tiempo real en ratones avanzarán significativamente en la comprensión de la biología del tumor.
Aquí, se establecieron líneas celulares de cáncer de mama que expresan de manera estable luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). Específicamente, esta técnica contiene dos pasos secuenciales iniciados por la medición de la actividad de la luciferasa in vitro y seguidos por la implantación de las células cancerosas en almohadillas de grasa mamaria de ratones de inmunodeficiencia combinada (NOD-SCID) diabéticos-graves no obesos. Después de la inyección, tanto el crecimiento del tumor como la colonización metastásica son monitoreados en tiempo real por el sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasiva. Luego, la cuantificación de las metástasis que expresan GFP en los pulmones se examinará mediante microscopía de fluorescencia para validar los resultados de bioluminiscencia observados. Este sofisticado sistema que combina luciferasa y herramientas de detección basadas en fluorescencia evalúa la metástasis del cáncer in vivo, que tiene un gran potencial para su uso en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de enfermedades.
Introduction
Los cánceres de mama son tipos frecuentes de cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 250,000 nuevos casos diagnosticados cada año en los Estados Unidos1. A pesar de su alta incidencia, un nuevo conjunto de medicamentos contra el cáncer ha mejorado significativamente los resultados de las pacientes con cáncer de mama2. Sin embargo, estos tratamientos siguen siendo inadecuados, ya que muchos pacientes experimentan recaída de la enfermedad y diseminación metastásica a órganos vitales2, que es la causa principal de morbilidad y mortalidad del paciente. Por lo tanto, uno de los principales desafíos en la investigación del cáncer de mama es identificar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis distales para desarrollar nuevos medios para inhibir su desarrollo.
La metástasis del cáncer es un proceso dinámico en el que las células se desprenden del tumor primario e invaden los tejidos vecinos a través de la circulación sanguínea. Así, los modelos animales en los que las células sufren una cascada metastásica similar pueden facilitar la identificación de los mecanismos que rigen este proceso 3,4. Además, estos modelos in vivo son esenciales para el desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer de mama 5,6. Sin embargo, estos modelos ortotópicos no pueden indicar la cinética real del crecimiento tumoral, ya que el efecto solo se determina al finalizar. Por lo tanto, establecimos una herramienta basada en luciferasa para detectar el desarrollo tumoral y la colonización metastásica en tiempo real. Además, estas células expresan GFP para detectar las colonias metastásicas. Este enfoque es relativamente simple y no implica ningún procedimiento invasivo3. Por lo tanto, la combinación de la luciferasa y la detección de fluorescencia es una estrategia útil para avanzar en los estudios preclínicos de la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los experimentos con animales son obligatorios para la investigación del cáncer 7,8,9, y de hecho se han desarrollado muchos protocolos 3,6,10,11,12,13,14. Sin embargo, la mayoría de estos estudi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Y.D.S. Nos gustaría agradecer al Instituto Wohl de Medicina Traslacional en el Centro Médico Hadassah, Jerusalén, por proporcionar la instalación de imágenes de animales pequeños. Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo de Carrera de Investigación del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
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