Monitoraggio della crescita del cancro al seno e della formazione di colonie metastatiche nei topi utilizzando la bioluminescenza
Summary
Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio non invasivo che coinvolge la luciferasi e l’espressione di proteine fluorescenti verdi in varie linee cellulari di cancro al seno. Questo protocollo fornisce una tecnica per monitorare la formazione del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale nei topi.
Abstract
Il cancro al seno è una frequente neoplasia eterogenea e la seconda causa di mortalità nelle donne, principalmente a causa di metastasi di organi a distanza. Sono stati generati diversi modelli animali, tra cui i modelli murini ortotopici ampiamente utilizzati, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nel cuscinetto di grasso mammario. Tuttavia, questi modelli non possono aiutare a monitorare la cinetica di crescita del tumore e la colonizzazione metastatica. Strumenti all’avanguardia per monitorare le cellule tumorali in tempo reale nei topi faranno progredire significativamente la comprensione della biologia tumorale.
Qui sono state stabilite linee cellulari di cancro al seno che esprimono stabilmente luciferasi e proteina fluorescente verde (GFP). In particolare, questa tecnica contiene due passaggi sequenziali iniziati misurando l’attività della luciferasi in vitro e seguiti dall’impianto delle cellule tumorali in cuscinetti di grasso mammario di topi non obesi diabetici-gravi immunodeficienza combinata (NOD-SCID). Dopo l’iniezione, sia la crescita tumorale che la colonizzazione metastatica vengono monitorate in tempo reale dal sistema di imaging a bioluminescenza non invasivo. Quindi, la quantificazione delle metastasi che esprimono GFP nei polmoni sarà esaminata al microscopio a fluorescenza per convalidare i risultati di bioluminescenza osservati. Questo sofisticato sistema che combina luciferasi e strumenti di rilevamento basati sulla fluorescenza valuta le metastasi del cancro in vivo, che ha un grande potenziale per l’uso nelle terapie del cancro al seno e nella gestione della malattia.
Introduction
I tumori al seno sono tipi frequenti di cancro in tutto il mondo, con circa 250.000 nuovi casi diagnosticati ogni anno negli Stati Uniti1. Nonostante la sua alta incidenza, una nuova serie di farmaci antitumorali ha migliorato significativamente gli esiti delle pazienti con cancro al seno2. Tuttavia, questi trattamenti sono ancora inadeguati, poiché molti pazienti sperimentano una recidiva della malattia e una diffusione metastatica agli organi vitali2, che è la causa principale della morbilità e della mortalità del paziente. Pertanto, una delle principali sfide nella ricerca sul cancro al seno è identificare i meccanismi molecolari che regolano la formazione di metastasi distali per sviluppare nuovi mezzi per inibire il loro sviluppo.
Le metastasi del cancro sono un processo dinamico in cui le cellule si staccano dal tumore primario e invadono i tessuti vicini attraverso la circolazione sanguigna. Pertanto, i modelli animali in cui le cellule subiscono una cascata metastatica simile possono facilitare l’identificazione dei meccanismi che governano questo processo 3,4. Inoltre, questi modelli in vivo sono essenziali per lo sviluppo di agenti terapeutici per il cancro al seno 5,6. Tuttavia, questi modelli ortotopici non possono indicare l’effettiva cinetica di crescita del tumore in quanto l’effetto è determinato solo al termine. Pertanto, abbiamo istituito uno strumento basato sulla luciferasi per rilevare lo sviluppo del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale. Inoltre, queste cellule esprimono GFP per rilevare le colonie metastatiche. Questo approccio è relativamente semplice e non comporta alcuna procedura invasiva3. Pertanto, la combinazione di luciferasi e rilevamento della fluorescenza è una strategia utile per far progredire gli studi preclinici sulle terapie del cancro al seno e sulla gestione della malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli esperimenti su animali sono obbligatori per la ricerca sul cancro 7,8,9, e in effetti molti protocolli sono stati sviluppati 3,6,10,11,12,13,14. Tuttavia, la maggior parte di questi studi ha det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Y.D.S. Vorremmo ringraziare il Wohl Institute for Translational Medicine presso l’Hadassah Medical Center, Gerusalemme, per aver fornito la struttura di imaging per piccoli animali. Questo studio è stato supportato dal Research Career Development Award dell’Israel Cancer Research Fund.
Materials
| 1.7 mL eppendorf tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 µL tips | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µL tips | Lifegene | LRT1000 | |
| 15 mL tubes | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µL tips | Lifegene | LRT200 | |
| 6 well cell culture plate | COSTAR | 3516 | |
| 96 well Plates BLACK flat bottom | Bar Naor | BN30496 | |
| Automated Cell Counters | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III sorter | BD | ||
| BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Syringes 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Style Dish | CORNING | 430599 | |
| Countess cell counting chamber slides | Thermofisher | C10228 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Eclipse 80i microscope | Nikon | ||
| eppendorf Centrifuge 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| HEK293T | Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem) | ||
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| L-Glutamine Solution | Biological industries | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminescence measurement | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pasteur pipettes | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Provided by David M. Sabatini’s lab (Whitehead institute, Boston, USA) |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Petri dish 90 mm (90×15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipettes 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipettes 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipettes 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Reagent Reservoirs | Bar Naor | BN20621STR200TC | |
| SMZ18 Stereo microscopes | Nikon | ||
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 190359400 | |
| Syringe filters | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries | 03-102-1B | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1a | |
| Vacuum driven Filters | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | disinfectant | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Sigma Aldrich | #6366236001 |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, 23-34 (2015).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175 (2011).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967 (2015).
- Baker, M. The whole picture. Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).
- Wang, Y., Tseng, J. -. C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).
- Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (115), e54040 (2016).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077 (2010).
- Lv, X., et al. Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173 (2020).
- Cheng, R. Y. S., et al. Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316 (2020).
- Bajikar, S. S., et al. Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer. Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).
- Khatib, A., et al. The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).
