Summary
Questo documento descrive un metodo basato su colture di espianto per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche umane primarie e specifiche per il paziente e fibroblasti dermici. Inoltre, viene presentato un nuovo metodo per misurare la contrazione cellulare e la successiva analisi, che può essere utilizzato per studiare le differenze specifiche del paziente in queste cellule.
Abstract
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nel mezzo aortico. Il loro meccanismo contrattile è importante per la trasmissione della forza nell'aorta e regola la vasocostrizione e la vasodilatazione. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine dell'apparato contrattile SMC sono associate a malattie aortiche, come gli aneurismi dell'aorta toracica. Misurare la contrazione SMC in vitro è impegnativo, specialmente in modo ad alta produttività, che è essenziale per lo screening del materiale del paziente. I metodi attualmente disponibili non sono adatti a questo scopo. Questo documento presenta un nuovo metodo basato sul rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cellula (ECIS). In primo luogo, viene descritto un protocollo di espianto per isolare le SMC primarie umane specifiche del paziente dalle biopsie aortiche e dai fibroblasti dermici primari umani specifici del paziente per lo studio degli aneurismi aortici. Successivamente, viene fornita una descrizione dettagliata di un nuovo metodo di contrazione per misurare la risposta contrattile di queste cellule, compresa la successiva analisi e il suggerimento per confrontare diversi gruppi. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la contrazione delle cellule aderenti nel contesto di studi traslazionali (cardiovascolari) e studi di screening di pazienti e farmaci.
Introduction
Le cellule muscolari lisce (SMC) sono il tipo di cellula predominante nello strato mediale aortico, lo strato più spesso dell'aorta. All'interno della parete, sono orientati radialmente e sono coinvolti, tra le altre funzioni, nella vasocostrizione e nella vasodilatazione1. Il macchinario contrattile SMC è coinvolto nella trasmissione della forza nell'aorta attraverso il collegamento funzionale con la matrice extracellulare2. Mutazioni in geni che codificano per le proteine dell'apparato contrattile SMC, come la catena pesante della miosina muscolare liscia (MYH11) e l'actina della muscolatura liscia (ACTA2), sono state correlate a casi di aneurismi dell'aorta toracica familiare, sottolineando la rilevanza della contrazione della SMC nel mantenimento dell'integrità strutturale e funzionale dell'aorta 1,2 . Inoltre, le mutazioni nella via di segnalazione del TGFβ sono anche associate agli aneurismi aortici e i loro effetti nella fisiopatologia dell'aneurisma aortico possono essere studiati anche nei fibroblasti cutanei3.
La misurazione ad alto rendimento della contrazione SMC in vitro è impegnativa. Poiché la contrattilità SMC non può essere misurata in vivo nell'uomo, i saggi in vitro su cellule umane presentano un'alternativa fattibile. Inoltre, lo sviluppo dell'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) in modelli animali è indotto chimicamente, ad esempio, dalla perfusione di elastasi o causato da una mutazione specifica. Pertanto, i dati sugli animali non sono paragonabili allo sviluppo di AAA nell'uomo, che per lo più ha una causa multifattoriale, come il fumo, l'età e / o l'aterosclerosi. In vitro La contrattilità SMC è stata finora misurata principalmente mediante microscopia a forzadi trazione 4,5, quantificazione dei flussi di calcio intracellulare a fluorescenza Fura-26 e saggi di rughe di collagene7. Mentre la microscopia con forza di trazione fornisce preziose informazioni numeriche sulle forze generate da una singola cellula, non è adatta per lo screening ad alto rendimento a causa della complessa elaborazione dei dati matematici e dell'analisi di una cellula alla volta, il che significa che è molto dispendioso in termini di tempo misurare un numero rappresentativo di cellule per donatore. I saggi di tintura fura-2 e di rughe di collagene consentono la determinazione superficiale della contrazione e non danno un risultato numerico preciso, rendendoli meno adatti a discriminare le differenze specifiche del paziente. La compromissione della contrazione della SMC nelle cellule derivate dall'aorta dei pazienti con aneurisma dell'aorta addominale è stata dimostrata per la prima volta ottimizzando un nuovo metodo per misurare la contrazione della SMC in vitro8. Ciò è stato fatto riutilizzando il metodo di rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cella (ECIS). ECIS è un test in tempo reale a medio rendimento per la quantificazione del comportamento e della contrazione delle cellule aderenti 9,10,11 come la crescita e il comportamento SMC nei saggi di guarigione e migrazione delle ferite 12,13,14. Il metodo esatto è descritto nella sezione del protocollo. In questo modo ottimizzato, l'ECIS può anche essere utilizzato per studiare la contrazione dei fibroblasti a causa delle loro dimensioni e morfologia simili.
Lo scopo di questo documento è quello di fornire una descrizione graduale del metodo per misurare la contrazione SMC in vitro utilizzando ECIS8 e confrontando la contrazione tra controllo e SMC paziente. In primo luogo, viene spiegato l'isolamento e la coltura delle SMC primarie dalle biopsie aortiche di controllo e del paziente, che possono essere utilizzate per la misurazione della contrazione. In secondo luogo, vengono descritte le misurazioni e l'analisi della contrazione, insieme alla verifica dell'espressione del marcatore SMC. Inoltre, questo documento descrive il metodo per l'isolamento dei fibroblasti dermici specifici del paziente la cui contrazione può essere misurata utilizzando la stessa metodologia. Queste cellule possono essere utilizzate per studi specifici del paziente incentrati sull'aneurisma aortico o altre patologie cardiovascolari15 o studi prognostici utilizzando un protocollo di transdifferenziazione che consente la misurazione della contrazione prima dell'intervento chirurgico all'aneurisma16.
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Protocol
NOTA: Le biopsie aortiche sono state ottenute durante la riparazione dell'aneurisma aperto nei centri medici dell'Università di Amsterdam, nel centro medico dell'Università VU, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam e l'ospedale Dijklander, Hoorn, Paesi Bassi. Il tessuto aortico di controllo è stato ottenuto dal pezzo dell'aorta attaccato all'arteria renale raccolta per i trapianti di rene. Sono stati inclusi solo i pazienti di età superiore ai 18 anni e tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato a partecipare allo studio. Tutto il materiale è stato raccolto in conformità con i regolamenti della Dichiarazione WMA di Helsinki e le linee guida istituzionali del Comitato etico medico del VU Medical Center. Tutti gli esperimenti e i protocolli sperimentali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e approvati dal Comitato Etico Medico del VU Medical Center. Per informazioni complete sul controllo e sulle linee cellulari del paziente utilizzate, fare riferimento a 8.
1. Isolare le SMC umane primarie dalle biopsie aortiche
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture tissutali. Indossare guanti e utilizzare tecniche asettiche standard quando si maneggiano campioni di sangue umano e tessuto umano. Le SMC sono coltivate in 231 Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium integrato con 100 U / mL di penicillina, 100 μg / mL di streptomicina e Smooth Muscle Growth Supplement indicato come SMC medium.
- Sterilizzare due paia di pinze chirurgiche e un bisturi immergendole in etanolo al 70% e successivamente asciugandole.
- Pipetta 2 mL di mezzo SMC in una capsula di Petri in cui verrà eseguita la dissezione del tessuto.
- Pipettare 2,5 mL di SMC medium in due palloni T25. Ruotare i palloni in modo che il piccolo volume di medio copra l'intera superficie.
- Trasportare la biopsia della parete aortica umana raccolta dalla sala operatoria al laboratorio su ghiaccio in un tubo di plastica sterile con soluzione di trasferimento tissutale fredda e sterile (vedere la tabella dei materiali) o 0,9% NaCl.
- Aprire il tubo con il tessuto all'interno del cappuccio di coltura del tessuto. Estrarre la biopsia dal tubo usando la pinza sterilizzata e metterla nella capsula di Petri (Figura 1A).
- Ispezionare visivamente la biopsia per identificare i tre strati aortici, la tunica intima (interna), media (al centro) e avventizia (strato esterno). Cerca la presenza di placche aterosclerotiche sul lato intima e tessuto connettivo viscido sul lato avventiziale (Figura 1B) per distinguere gli strati.
- Per isolare gli SMC dal supporto, rimuovere gli altri due livelli. Posizionare il tessuto con la placca intima rivolta verso l'alto per primo (Figura 1B). Rimuovere la placca solida allontanandola dal tessuto con una pinza mentre si spinge il tessuto verso il basso con l'altra coppia di pinze. Rimuovere gli strati successivi di placca fino a quando lo strato mediale rosa e uniforme è visibile.
- Capovolgere il tessuto (Figura 1C). Ripetere la stessa procedura, come nel passaggio 1.7, estraendo il livello avventizia (Figura 1D). Assicurati di rimuovere tutte le parti visibili in tutti i tentativi necessari, poiché questo livello non si stacca facilmente dal supporto.
NOTA: È essenziale che gli strati intimale e avventiziale siano rimossi correttamente per ottenere una popolazione SMC il più pulita possibile. - Una volta isolato lo strato mediale, tagliare il tessuto a cubetti di circa 1 mm x 1 mm x 1 mm. Premere il supporto verso il basso con una pinza e tagliare il tessuto in una direzione usando il bisturi. Non tagliare avanti e indietro; effettuare tagli puliti e unidirezionali per ridurre al minimo i danni. Cerca di creare il maggior numero possibile di cubi, date le dimensioni della biopsia (Figura 1E).
- Posizionare i pezzi di tessuto nel quarto superiore del pallone T25 usando la pinza. Posizionare 10-20 cubetti per pallone se la quantità di materiale lo consente (Figura 1F).
NOTA: utilizzare una pinza liscia per ridurre al minimo l'adesione del tessuto alle costole della pinza e staccare facilmente il tessuto nel pallone. - Incubare i cubetti di tessuto nei palloni T25 per circa 10 giorni al 5% di CO2 a 37 °C in un incubatore.
NOTA: la prima crescita cellulare è prevista in quel periodo. Le celle che inizialmente migrano potrebbero sembrare più piccole delle normali SMC. - Una volta osservata la crescita cellulare, aggiungere 2,5 ml di terreno al pallone, assicurandosi di non pipettarlo sui pezzi di tessuto per evitare che si stacchino.
- Dopo circa altri 5 giorni, quando si osservano gruppi di cellule intorno ai pezzi di tessuto, cambiare il terreno di coltura. Se i pezzi di tessuto si staccano, rimuoverli in quanto non si ricollegano.
- Una volta che le cellule sono confluenti all'80-90%, trasferirle in un pallone T75 e continuare a coltivare in questo formato.
NOTA: si consiglia un rapporto di divisione 1:2 o 1:3. Congelare un backup delle celle a un passaggio precoce. Le cellule generalmente mantengono le loro proprietà fino al passaggio 10; i passaggi successivi non dovrebbero essere usati per esperimenti.
2. Isolare i fibroblasti dermici primari dalle biopsie cutanee
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture tissutali. Indossare guanti e utilizzare tecniche asettiche standard quando si maneggiano campioni di sangue umano e tessuto umano. I fibroblasti sono coltivati in basale media integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina, indicato come mezzo fibroblastico.
- Sterilizzare due paia di pinze chirurgiche e un bisturi immergendole in etanolo al 70% e successivamente asciugandole.
- Pipetta 2 mL di mezzo fibroblastico in una capsula di Petri in cui verrà eseguita la dissezione del tessuto.
- Pipettare 2,5 mL di fibroblasto medio in due palloni T25. Ruotare i palloni in modo che il piccolo volume di medio copra l'intera superficie.
- Trasportare la biopsia cutanea raccolta dalla sala operatoria al laboratorio su ghiaccio in soluzione di trasferimento tissutale fredda e sterile (vedere la tabella dei materiali) o 0,9% NaCl in un tubo di plastica sterile.
- Aprire il tubo con il tessuto all'interno del cappuccio di coltura del tessuto. Estrarre la biopsia dal tubo usando la pinza sterilizzata e metterla nella capsula di Petri (Figura 2A).
- Ispezionare visivamente la biopsia per identificare i tre strati della pelle, l'epidermide, il derma e il grasso sottocutaneo. Cerca una superficie della pelle riconoscibile, a volte con capelli visibili, per identificare l'epidermide. Sul lato opposto, cerca il grasso sottocutaneo, che è spesso giallo e viscido. Identificare lo strato tra l'epidermide e il grasso sottocutaneo come derma, la fonte di fibroblasti vitali (Figura 2B).
- Per isolare i fibroblasti dal derma, rimuovere gli altri due strati e posizionare il tessuto su un lato in modo che tutti e tre gli strati siano visibili.
NOTA: A differenza del tessuto aortico, gli strati della pelle non possono essere separati l'uno dall'altro; quindi, devono essere tagliati. Il tessuto è anche più gommoso, rendendo più difficile il taglio. Usa un bisturi affilato. - Tenere il tessuto verso il basso con una pinza. Tagliare in parallelo al confine tra epidermide e derma. Tagliare via l'intera epidermide. Cerca di tagliare in una linea pulita e non muoverti avanti e indietro per evitare danni ai tessuti.
- Capovolgere il tessuto. Ripetere la stessa procedura del passaggio 2.8; questa volta, tagliare all'interno del derma parallelamente al bordo con il grasso sottocutaneo.
- Una volta isolato il derma, tagliare il tessuto a cubetti di circa 1 x 1 x 1 mm3. Premere il tessuto verso il basso con una pinza e tagliare il tessuto in una direzione usando il bisturi. Non tagliare avanti e indietro; effettuare tagli puliti e unidirezionali per ridurre al minimo i danni. Cerca di creare il maggior numero possibile di cubi, date le dimensioni della biopsia (Figura 2C).
- Posizionare i pezzi di tessuto nel quarto superiore del pallone T25 usando la pinza. Posizionare 10-20 cubi per pallone se la quantità di materiale lo consente (Figura 2D).
NOTA: utilizzare una pinza liscia per ridurre al minimo l'adesione del tessuto alle costole della pinza e staccare facilmente il tessuto nel pallone. - Incubare i cubetti di tessuto nei palloni T25 per circa 10 giorni al 5% di CO2 a 37 °C in un incubatore.
NOTA: la prima crescita cellulare è prevista intorno a allora. Le cellule che inizialmente migrano potrebbero sembrare più piccole dei normali fibroblasti. - Una volta osservata la crescita cellulare, aggiungere 2,5 ml di terreno al pallone, assicurandosi di non pipettarlo sui pezzi di tessuto per evitare che si stacchino.
- Dopo circa altri 5 giorni, quando si possono osservare gruppi di cellule intorno ai pezzi di tessuto, cambiare il terreno di coltura. Se i pezzi di tessuto si staccano, rimuoverli in quanto non si ricollegano.
- Una volta che le cellule sono confluenti all'80-90%, trasferirle in un pallone T75 e continuare a coltivare in questo formato.
NOTA: si consiglia un rapporto di divisione 1:2 o 1:3. Congelare un backup delle celle a un passaggio precoce. Le cellule generalmente mantengono le loro proprietà fino al passaggio 10; i passaggi successivi non dovrebbero essere usati per esperimenti.
3. Misurazione della contrazione (esempio SMC)
- Preparare un array ECIS 96w10e (vedere la Figura 3A per un'immagine rappresentativa dell'array con elettrodi e celle ingranditi seminati sugli elettrodi).
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture tissutali.- Rivestire un array sterile 96w10e con 200 μL di 10 mM di L-cisteina per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il piatto due volte con acqua sterile. Lasciare asciugare la piastra per una notte nella cappa di coltura del tessuto con il coperchio leggermente aperto.
NOTA: Il rivestimento della piastra con L-cisteina è necessario solo quando si utilizza la piastra per la prima volta. - Il giorno successivo, sterilizzare UV piastra e coperchio per 30 minuti. Ruotare il coperchio verso l'alto in modo che l'interno sia sterilizzato. Una volta sterilizzata la piastra, non aprire la piastra all'esterno della cappa di flusso.
- Sezionamento di celle nella matrice ECIS
- Soluzione di gelatina sterile all'1% preriscaldata a bagnomaria per 30 min.
NOTA: la soluzione viene conservata in frigorifero e potrebbe solidificarsi, rendendo difficile la pipettatura. - Successivamente, rivestire i pozzetti con 100 μL della soluzione di gelatina all'1 % per pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora.
- Aspirare la gelatina dai pozzetti.
- Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato e seminare gli SMC in triplice copia a una densità di semina di 30.000 cellule / pozzetto in 200 μL di mezzo SMC.
- Posizionare la piastra con gli SMC nel supporto del pozzetto ECIS 96 nell'incubatore di colture cellulari. Fare doppio clic sul software ECIS Applied Biophysics per aprire il programma e premere il pulsante Setup .
- Controllare se tutti gli elettrodi hanno contatto con il supporto (verde; rosso se nessuna connessione) nel pannello inferiore sinistro etichettato Well Configuration. Se gli elettrodi non sono collegati correttamente, regolare la piastra nel supporto prima di iniziare la misurazione.
- Selezionate il tipo di piastra (matrice a 96 pozzetti) nello stesso pannello facendo clic su Tipo matrice(Array type).
- Nel pannello superiore destro Data Collection Setup, fare clic su singola frequenza e modificare il valore di impedenza a 4000 Hz e l'intervallo a 8 s.
- Fare clic sul pulsante Start per avviare le misurazioni. Attendere l'apertura di un nuovo pannello, in cui è possibile salvare il file ECIS.
- Consentire alle celle di attaccarsi e stabilire un monostrato per 48 ore.
NOTA: l'attacco e la diffusione delle celle sugli elettrodi generano un valore di resistenza basale (Figura 3B).
- Soluzione di gelatina sterile all'1% preriscaldata a bagnomaria per 30 min.
- Stimolazione delle cellule per indurre la contrazione
- Indurre la contrazione SMC stimolando le cellule con 10 μg/mL di ionoforo di calcio, ionomicina.
NOTA: La ionomicina indurrà l'afflusso di Ca2+ extracellulare, attivando la cascata contrattile; vedere la Figura 4A per immagini rappresentative di cellule contratte non stimolate e stimolate. - Diluire 1 mg di ionomicina in polvere in 100 μL di dimetilsolfossido per ottenere una soluzione madre di 10 mg/mL e conservare aliquote da 10 μL a -20 °C. Prima dell'uso, diluire la soluzione di ionomicina 1:10 in mezzo SMC per preparare la soluzione di lavoro da aggiungere alle cellule.
- Eseguire la stimolazione cellulare mentre l'array è ancora nel supporto dell'array all'interno dell'incubatore di colture cellulari e gli elettrodi sono collegati al sistema.
- Per stimolare le cellule, rimuovere il coperchio e posizionarlo su una superficie sterile all'interno dell'incubatore. Preparare due pipette, impostate a 2 μL e 150 μL.
- Prima di iniziare la stimolazione, premere Mark nel software e inserire un commento.
NOTA: Questo renderà più facile trovare i tempi esatti della stimolazione durante l'analisi dei dati. - Pipettare 2 μL della soluzione di lavoro di ionomicina in ciascun pozzo il più rapidamente possibile. Una volta che tutte le cellule sono state stimolate, mescolare il mezzo nei pozzetti usando la seconda pipetta.
NOTA: a causa degli effetti rapidi, non è necessario modificare le punte tra diverse linee cellulari e condizioni. Lavorare rapidamente stimolando e mescolando perché la ionomicina ha un effetto acuto. Quando si stimola una piastra piena, stimolare un massimo di 3 colonne contemporaneamente. Dopo ogni stimolazione, attendere almeno 30 minuti fino alla stimolazione successiva per consentire alle cellule di riprendersi dalla temperatura e dal cambiamento di CO2 causato dall'apertura della porta dell'incubatore. - Subito dopo aver terminato la stimolazione, premere nuovamente Mark per aggiungere un commento che la stimolazione è stata eseguita.
- Terminare l'esperimento di stimolazione
- Registrare i valori di impedenza per circa 5 minuti dopo la stimolazione della ionomicina. Terminare la registrazione premendo Fine.
- Riutilizzare gli array ECIS fino a tre volte: lavare i pozzetti due volte con acqua sterile e incubare la piastra a 37 °C per 2-3 ore con tripsina o un reagente simile. Ripetere i passaggi 3.1.2 e 3.1.3.
- Indurre la contrazione SMC stimolando le cellule con 10 μg/mL di ionoforo di calcio, ionomicina.
- Esportazione dei dati
- Per esportare i dati, fare clic su File | Esportare i dati | In Excel (selezionato). Selezionare una cartella in cui salvare il file.
- Fare clic su Separa quando il programma chiede di combinare o separare i fogli.
- Analisi dell'output contrattile
- Per calcolare la risposta contrattile, utilizzare la seguente equazione (1), dove C indica la contrazione (espressa in % della variazione rispetto al basale), la prestimulazione (PrS) indica il valore di resistenza (espresso in Ω) poco prima della stimolazione della ionomicina e la post-stimolazione (PoS) indica la resistenza (espressa in Ω) 2 minuti dopo aver terminato la stimolazione.
(1)
NOTA: Come mostrato nell'equazione (1), il valore di impedenza di un pozzo riempito con terreno di coltura senza cellule attaccate (valore di 290 Ω) viene sottratto da tutti i risultati nel calcolo finale. Si raccomanda di misurare le risposte contrattili in triplice copia in ogni esperimento ed eseguire tre esperimenti indipendenti con la stessa linea cellulare per tenere conto di qualsiasi variazione inter- e intra-sperimentale. - Una volta eseguiti i tre esperimenti indipendenti, raggruppare i dati calcolando la media delle tre misurazioni, inclusa la deviazione standard (SD).
- Per calcolare la risposta contrattile, utilizzare la seguente equazione (1), dove C indica la contrazione (espressa in % della variazione rispetto al basale), la prestimulazione (PrS) indica il valore di resistenza (espresso in Ω) poco prima della stimolazione della ionomicina e la post-stimolazione (PoS) indica la resistenza (espressa in Ω) 2 minuti dopo aver terminato la stimolazione.
- Confronto di diversi gruppi
- Per definire l'intervallo di contrazione normale e indagare le successive domande di ricerca specifiche, utilizzare il gruppo di controllo per definire la "contrazione normale" e confrontarla con la risposta contrattile dei pazienti o dei gruppi di trattamento.
- Calcolare la media e la SD dell'intero gruppo di controllo, cioè dei valori finali per tutte le linee cellulari, come descritto al punto 3.5.2.
- Utilizzare l'intervallo della media ± 2SD per identificare le cellule dell'altro gruppo che non rientrano in questo intervallo, indicando che hanno una risposta contrattile alterata.
NOTA: Il meccanismo alla base della risposta contrattile alterata è soggetto a domande di ricerca specifiche ed è dipendente dalle cellule e dalle condizioni e non sarà discusso in questo protocollo.
(1)4. Rilevare la presenza di marcatori specifici SMC
- Isolamento dell'RNA
- Seminare le stesse linee cellulari specifiche del paziente utilizzate per le misurazioni di contrazione in piastre a 6 pozzetti, un pozzetto per linea cellulare. Contare le cellule utilizzando un contatore di celle automatizzato e seminare le cellule a una densità di semina di 200.000 cellule / pozzetto in mezzo SMC e consentire loro di attaccarsi durante la notte.
- Lavare le cellule una volta con PBS sterile.
- Lisare le cellule e isolare le celle secondo le istruzioni del produttore.
- Sintesi del cDNA
- Eseguire la sintesi del cDNA in 20 μL di una miscela di reazione a trascrizione inversa. Diluire le concentrazioni di RNA isolato totale secondo le istruzioni fornite dal produttore.
- qPCR
- Misurare l'espressione genica dei geni marcatori SMC, ad esempio ACTA2, CNN1, SMTN e TAGLN per confermare che le cellule isolate sono effettivamente SMC e rilevare i marcatori SMC. Verificare la correlazione dei risultati con l'output contrattile.
- Utilizzare almeno due geni di pulizia per normalizzare i dati, ad esempio YWHAZ e TBP.
NOTA: L'esecuzione e l'analisi qPCR possono essere eseguite utilizzando diverse macchine PCR e software compatibile, a seconda di ciò che è disponibile e ottimizzato in laboratorio. Vedere la tabella supplementare S1 per le sequenze di primer.
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Representative Results
Per testare la riproducibilità di questo metodo, il metodo è stato prima convalidato utilizzando solo SMC di controllo. Per determinare la riproducibilità della misurazione interesperimentale, due misurazioni indipendenti di tutte le linee cellulari di controllo e paziente incluse sono state tracciate come un grafico Bland-Altman (Figura 3B). Il grafico ha dimostrato che questo metodo non mostra variabilità al di fuori dell'intervallo di confidenza, ad eccezione di una linea cellulare anomala. Inoltre, questi risultati hanno dimostrato che due pozzetti seminati all'interno dello stesso esperimento e stimolati simultaneamente mostrano praticamente la stessa curva di risposta contrattile (Figura 4C). Per convalidare se la risposta mostrata è la contrazione e non lo stress osmotico a causa della stimolazione della ionomicina, il mezzo è stato sostituito dopo la stimolazione ed è stato registrato il comportamento delle cellule. Ciò dimostra che le cellule stimolate hanno iniziato a diffondersi nuovamente sull'elettrodo (Figura 4D).
Come prima applicazione di questo nuovo metodo, la risposta contrattile nelle SMC derivata da pazienti sani, non dilatati aorta (n= 6) e aneurisma dell'aorta addominale (AAA) (n = 21; Figura 5A) è stato misurato, come mostrato in precedenza8. La risposta mediana del gruppo di controllo è stata del 61% (46-77%), rispetto alla risposta mediana, del 52% (15-75%) del gruppo di pazienti. I valori non erano significativamente diversi e una maggiore variabilità è stata notata nel gruppo di pazienti. A causa della novità del metodo, il gruppo di controllo è stato utilizzato per determinare la contrazione "normale". La Figura 5B mostra la media e la ± intervallo 2SD del gruppo di controllo e come questo intervallo viene utilizzato per identificare quattro pazienti che hanno valori di contrazione inferiori rispetto ai valori "normali". Determinare la causa della contrazione compromessa è l'obiettivo di uno studio meccanicistico separato. È stata eseguita un'analisi del bot occidentale per determinare se l'SMC utilizzato per l'esperimento esprime marcatori contrattili SMC. L'analisi western blot (Figura 6A) e la successiva quantificazione (Figura 6B) confermano che le cellule esprimono marcatori SMC. L'espressione del marcatore in tutti i gruppi era variabile e non era correlata con l'output contrattile. Per determinare la capacità proliferativa dell'SMC, è stata eseguita la qPCR per Ki67 (Figura 6C). L'espressione di Ki67 era rilevabile in tutte le cellule, ma non era correlata con l'output contrattile.
Figura 1: Isolamento SMC dal tessuto AAA aortico. (A) Materiali necessari per l'isolamento SMC dal tessuto aortico: tessuto aortico in una capsula di Petri, mezzo SMC, due palloni T25 riempiti con mezzo SMC, bisturi e due paia di pinze chirurgiche. (B) Lato intimale della parete aortica che mostra placche aterosclerotiche. (C) Strato avventiziale della parete aortica. (D) Separazione della tunica media e della tunica adventitia tirando con la pinza. (E) Dopo che il mezzo di tunica è stato isolato, il tessuto viene tagliato in piccoli pezzi usando una pinza e il bisturi. F) Pezzi di tessuto posti nel matraccio T25. Abbreviazioni: AAA = aneurisma dell'aorta addominale ; SMC = cellula muscolare liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento dei fibroblasti dal tessuto dermico. (A) Materiali necessari per l'isolamento dei fibroblasti dal tessuto dermico: tessuto dermico in una capsula di Petri, mezzo fibroblastico, due palloni T25 riempiti con mezzo fibroblastico, bisturi e due paia di pinze chirurgiche. (B) Biopsia cutanea che mostra grasso sottocutaneo sul lato superiore. (C) Dopo che il derma è stato isolato, il tessuto viene tagliato in piccoli pezzi usando una pinza e il bisturi. D) Pezzi di tessuto posti nel matraccio T25. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Configurazione della piastra ECIS e rappresentazione grafica della contrazione aortica SMC. (A) Sinistra; una piastra ECIS a 96 pozzetti. Medio; ingrandimento di un pozzo della piastra ECIS, che mostra i dieci elettrodi nella parte inferiore del pozzo. Giusto; immagine al microscopio ottico degli SMC seminati sulla piastra ECIS; ingrandimento 10x. (B) Curve di resistenza misurate da ECIS dopo la semina di SMC di controllo in triplice copia. La linea blu spessa rappresenta la media del triplicato e le linee tratteggiate rappresentano la SD dei triplicati. Nelle prime 4-5 ore dopo la semina, gli SMC si diffondono su tutta la superficie e viene misurata un'elevata resistenza (~ 1000 Ω). Una volta formato un monostrato SMC stabile, la resistenza si riduce nel tempo a circa 500 Ω. Questa cifra è modificata da 8. Abbreviazioni: ECIS = rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cella; SMC = cellula muscolare liscia; SD = deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misurazione della contrazione SMC utilizzando ECIS. (A) Sinistra; SMC monostrato di SMC di controllo prima della stimolazione per la contrazione. Giusto; controllare gli SMC dopo la stimolazione per la contrazione. Ingrandimento 10x. (B) Grafico delle differenze che dimostra la riproducibilità della misura interesperimentale tra due misure di contrazione separate. Le linee tratteggiate rappresentano l'intervallo di confidenza del 95% e la linea mediale spessa rappresenta la media di due misurazioni interesperimentali. Ogni punto dati rappresenta la deviazione dalla media di due misurazioni indipendenti dell'intero set di dati di controlli e pazienti (Viola ●; n = 27). (C) Riproducibilità intraesperimentale delle misure di contrazione ECIS. Curve di resistenza generate dal controllo SMC seminato in due pozzi. La linea tratteggiata verticale segna la stimolazione. (D) Recupero cellulare dopo stimolazione della contrazione. La linea blu spessa rappresenta il valore di resistenza di un SMC di controllo non stimolato. La linea blu tratteggiata rappresenta il valore di resistenza della stessa linea SMC di controllo, dopo la stimolazione contrassegnata dalla linea nera tratteggiata verticale. Circa 1 ora dopo la stimolazione (spessa linea nera tratteggiata verticale), il mezzo in entrambe le condizioni è stato aggiornato per rimuovere lo stimolo e il recupero delle cellule è stato monitorato per altre 3,5 ore. I valori di resistenza sono stati normalizzati alla prestimulazione dei valori per monitorare il comportamento delle cellule dopo la stimolazione. Questa cifra è modificata da 8. Abbreviazioni: ECIS = rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cella; SMC = cellula muscolare liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Contrazione SMC nel controllo e SMC dei pazienti AAA dopo stimolazione della ionomicina. (A) Risposta contrattile media di controllo (Blu ●; n = 6) e paziente AAA (Rosso ●; n = 21) SMC dopo stimolazione della ionomicina derivata da esperimenti multipli. (B) Risposta contrattile media di controllo (blu ●; n = 6), contrazione normale (rosso ●; n = 15) e bassa contrazione (rosso ●; n = 6) SMC di pazienti AAA derivati da più esperimenti. La contrazione è espressa in percentuali di diminuzione rispetto al valore basale prima della stimolazione. La linea nera orizzontale rappresenta la risposta contrattile media degli SMC di controllo. Le linee orizzontali tratteggiate segnano due SD sopra e sotto la media del gruppo di controllo. Il gruppo a bassa contrazione è definito come contrazione inferiore a due SD al di sotto della media del gruppo di controllo. Boxplot è mostrato come mediana con intervallo. Questa cifra è modificata da 8. Abbreviazioni: AAA = aneurisma dell'aorta addominale; ECIS = rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cellula; SMC = cellula muscolare liscia; SD = deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Espressione del marcatore SMC. I marcatori contrattili e proliferativi SMC sono stati analizzati in SMC di controllo (Δ; n = 6), contrazione normale, (●; n = 15) e bassa contrazione (○; n = 6). (A) Analisi Western blot di SMC utilizzata per gli esperimenti di contrazione. aSMA, calponina e SM22 sono stati quantificati e la tubulina è stata utilizzata come controllo del carico. (B) Quantificazione della macchia occidentale raffigurata in (A). (C) Analisi qPCR del marcatore di proliferazione Ki67. Questa cifra è modificata da 8. Abbreviazioni: SMC = cellula muscolare liscia; aSMA = alfa Actina della Muscolatura Liscia; qPCR = PCR quantitativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare S1: Sequenze di primer. Sequenze di primer qPCR avanti e indietro di geni di housekeeping e marcatori SMC analizzati. Questa tabella è stata modificata da 8. Abbreviazioni: SMC = cellula muscolare liscia; qPCR = PCR quantitativa. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo documento presenta un metodo per misurare la contrazione SMC in vitro, basato sui cambiamenti nell'impedenza e nell'occupazione della superficie. In primo luogo, viene descritto l'isolamento, la coltura e l'espansione delle SMC umane primarie specifiche del paziente e dei fibroblasti cutanei, seguite da come usarle per le misurazioni della contrazione.
Una limitazione dello studio è legata all'ottenimento delle cellule attraverso un protocollo di espianto. Le cellule che proliferano dalla biopsia potrebbero avere proprietà diverse rispetto al tessuto originale in vivo. Inoltre, i protocolli di espianto qui presentati non sono innovativi ma sono inclusi per presentare un flusso di lavoro completo da, in questo caso, materiale aneurisma aortico specifico per il paziente alle misurazioni di contrazione. La coltura delle cellule in vitro potrebbe anche influenzare alcune delle loro proprietà a causa della mancanza di fattori sistemici e della diversa rigidità del substrato. Ciò potrebbe spiegare la variabilità nell'espressione del marcatore SMC. A causa dell'assenza di marcatori di fibroblasti affidabili, i fibroblasti sono solitamente distinti in base all'assenza di marcatori rispetto ad altre cellule. Non abbiamo quindi caratterizzato i fibroblasti isolati con questo protocollo. Un'altra limitazione è che misurare la contrazione come fattore della superficie rimane in qualche modo indiretto. Le possibili conseguenze sono che l'output deriva dalla media della risposta dell'intero pozzo contenente migliaia di cellule. Pertanto, non è possibile determinare se tutte le cellule si contraggono meno o se ci sono cellule che abbassano la media.
La contrattilità SMC è stata precedentemente studiata utilizzando diverse tecniche. Rispetto alla microscopia a forza di trazione4, ECIS presenta molteplici vantaggi, in primo luogo, una maggiore produttività ed efficienza nel tempo. Come affermato nelle limitazioni, il compromesso è che le misurazioni della contrazione sono ottenute indirettamente, rendendo ECIS più adatto per lo screening di un numero maggiore di linee cellulari e gruppi e la misurazione della forza di trazione per studi meccanicistici a singola cellula più approfonditi. I gradienti di calcio6 erano precedentemente utilizzati come indicatori di contrazione; ECIS fornisce una misurazione della contrazione più affidabile in quanto misura la locomozione della cellula. La quantificazione delle immagini delle rughe di collagene causate dalla contrazione delle cellule seminate all'interno del gel5 fornisce una media dell'intera popolazione di cellule seminate, simile all'ECIS. Tuttavia, le misurazioni ottenute tramite ECIS sono molto più precise e forniscono un monitoraggio in tempo reale durante l'intero corso dell'osservazione, rendendole significativamente più informative.
In conclusione, questo documento descrive una nuova applicazione per il sistema ECIS, che può essere utilizzata per misurare la contrazione delle cellule aderenti, come SMC e fibroblasti. Questo metodo può essere utilizzato per studiare più linee cellulari in modo tempestivo ed efficiente, rendendolo adatto per lo screening di pazienti o farmaci. In linea con la ricerca sugli aneurismi aortici, questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per lo screening delle SMC di pazienti con altri disturbi cardiovascolari, come dissezioni e aterosclerosi.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, il team PAREL-AAA e tutti i chirurghi vascolari dell'ospedale UMC di Amsterdam, Zaans Medisch Centrum e Dijklander per aver fornito materiali e supporto per questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
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