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Medicine

एक Murine Hindlimb Gangrene मॉडल में Footpad वास्कुलचर के उच्च संकल्प तीन आयामी इमेजिंग

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63284
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1, 1,2, 4, 1,2, 1,2, 1,2
1Dewitt Daughtry Family Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 2Vascular Biology Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3University of Miami, 4Analytical Imaging Core Facility, University of Miami

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल परिधीय धमनी रोग के एक अद्वितीय, नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का वर्णन करता है जो एफवीबी चूहों में हिंडलिंब गैंग्रीन को प्रेरित करने के लिए नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ अवरोधक के प्रशासन के साथ ऊरु धमनी और शिरा इलेक्ट्रोकोगुलेशन को जोड़ता है। इंट्राकार्डियक डीआईआई परफ्यूजन का उपयोग तब फुटपैड वास्कुलचर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, तीन-आयामी इमेजिंग के लिए किया जाता है।

Abstract

परिधीय धमनी रोग (पीएडी) एथेरोस्क्लेरोटिक जोखिम कारकों के क्रोनिक एक्सपोजर के परिणामस्वरूप रुग्णता का एक महत्वपूर्ण कारण है। अपने सबसे गंभीर रूप से पीड़ित रोगियों, पुरानी अंग-धमकी ischemia (CLTI), पुराने दर्द, दर्द के बिना सीमित चलने की दूरी, और nonhealing घावों सहित दैनिक जीवन के लिए पर्याप्त हानि का सामना करना पड़ता है। पैड का अध्ययन करने के लिए विभिन्न जानवरों में प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन माउस हिंडलिंब इस्केमिया सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इन मॉडलों में इस्केमिक अपमान के जवाब में महत्वपूर्ण भिन्नता हो सकती है जो उपयोग किए गए माउस तनाव और साइट, संख्या और धमनी व्यवधान के साधनों पर निर्भर करती है। यह प्रोटोकॉल एक नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (एनओएस) अवरोधक के प्रशासन के साथ ऊरु धमनी और शिरा इलेक्ट्रोकोएगुलेशन के संयोजन की एक अनूठी विधि का वर्णन करता है ताकि मित्र वायरस बी (एफवीबी) चूहों में फुटपैड गैंग्रीन को मज़बूती से प्रेरित किया जा सके जो सीएलटीआई के ऊतक हानि जैसा दिखता है। जबकि लेजर डॉपलर परफ्यूजन इमेजिंग (एलडीपीआई) जैसे रिपरफ्यूजन का आकलन करने के पारंपरिक साधनों की अभी भी सिफारिश की जाती है, लिपोफिलिक डाई 1,1'-डायोक्टाडेसिल-3,3,3', 3'-टेट्रामेथिलिनडोकार्बोसायनिन पर्क्लोरेट (डीआईआई) के इंट्राकार्डियक परफ्यूजन का उपयोग वास्कुलचर को लेबल करने के लिए किया जाता है। बाद में पूरे माउंट confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी उच्च संकल्प के लिए अनुमति देता है, तीन आयामी (3 डी) footpad संवहनी नेटवर्क के पुनर्निर्माण है कि hindlimb ischemia मॉडल में reperfusion का आकलन करने के पारंपरिक साधनों के पूरक.

Introduction

परिधीय धमनी रोग (पीएडी), एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण चरम सीमाओं में कम रक्त प्रवाह की विशेषता है, संयुक्त राज्य अमेरिका में 6.5 मिलियन लोगों और दुनिया भर में 200 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। पीएडी अनुभव वाले रोगियों ने अंग समारोह और जीवन की गुणवत्ता को कम कर दिया है, और सीएलटीआई वाले लोग, पीएडी का सबसे गंभीर रूप, 5 साल की मृत्यु दर के साथ विच्छेदन और मृत्यु के लिए जोखिम में वृद्धि हुई है। नैदानिक अभ्यास में, टखने-ब्रेकियल इंडेक्स (एबीआई) <0.9 वाले रोगियों को पीएडी माना जाता है, और एबीआई <0.4 वाले रोगियों को सीएलटीआई 3 होने के रूप में आराम के दर्द या ऊतक हानि से जुड़ा हुआ है। लक्षण दैनिक गतिविधि के आधार पर समान एबीआई वाले रोगियों के बीच भिन्न होते हैं, इस्किमिया के लिए मांसपेशियों की सहिष्णुता, एनाटॉमिक विविधताएं, और संपार्श्विक विकास में अंतर 4। अंक और अंग गैंग्रीन सभी संवहनी occlusive रोगों है कि CLTI में परिणाम की सबसे गंभीर अभिव्यक्ति है. यह शुष्क परिगलन का एक रूप है जो नरम ऊतकों को ममीफ करता है। एथेरोस्क्लेरोटिक पीएडी के अलावा, यह मधुमेह के रोगियों में भी देखा जा सकता है, जैसे कि बुएर्गर की बीमारी और रेनॉड की घटना, या अंत-चरण गुर्दे की बीमारी की स्थापना में कैल्सीफिलैक्सिस 5,6।

पीएडी / सीएलटीआई के रोगजनन का अध्ययन करने और संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए कई प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे आम माउस हिंडलिंब इस्केमिया बना हुआ है। चूहों में हिंडलिंब इस्केमिया को प्रेरित करना आमतौर पर इलियाक या ऊरु धमनियों से रक्त प्रवाह की बाधा से पूरा होता है, या तो सीवन बंधाव, इलेक्ट्रोकोगुलेशन, या वांछित पोत को संकुचित करने के अन्य साधनों द्वारा। ये तकनीकें हिंडलिंब में परफ्यूजन को काफी कम करती हैं और जांघ और बछड़े की मांसपेशियों में नवसंवहनीकरण को उत्तेजित करती हैं। हालांकि, संपार्श्विक वितरण में शारीरिक मतभेदों के कारण आंशिक रूप से इस्केमिक अपमान के प्रति संवेदनशीलता में आवश्यक मुरीन तनाव-निर्भर अंतर हैं8,9। उदाहरण के लिए, C57BL /6 चूहे हिंडलिंब इस्केमिया के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी हैं, जो कम अंग समारोह का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन आम तौर पर फुटपैड में गैंग्रीन का कोई सबूत नहीं है। दूसरी ओर, BALB / c चूहों में ischemia से उबरने के लिए एक स्वाभाविक रूप से खराब क्षमता होती है और आमतौर पर अकेले ऊरु धमनी बंधाव के बाद पैर या निचले पैर के ऑटो-विच्छेदन का विकास होता है। ischemia के लिए इस गंभीर प्रतिक्रिया चिकित्सीय खिड़की को संकीर्ण करता है और अंग reperfusion और समारोह के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन को रोक सकते हैं. दिलचस्प बात यह है कि, मुरीन गुणसूत्र 7 पर स्थित एक एकल मात्रात्मक विशेषता लोकस में आनुवंशिक अंतर को ऊतक परिगलन और अंग reperfusion10 के लिए C57BL / 6 और BALB / c चूहों की इन विभेदक संवेदनशीलताओं में फंसाया गया है।

C57BL/6 और BALB/c उपभेदों की तुलना में, FVB चूहे अकेले ऊरु धमनी बंधाव के लिए एक मध्यवर्ती लेकिन असंगत प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं। कुछ जानवरों काले ischemic नाखून या mummified अंकों के रूप में footpad gangrene विकसित, फिर भी ischemia11 के किसी भी overt संकेत के बिना दूसरों. Nω-Nitro-L-arginine मिथाइल एस्टर हाइड्रोक्लोराइड (L-NAME), एक नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (NOS) अवरोधक 12 का सहवर्ती प्रशासन, प्रतिपूरक वासोडिलेटरी तंत्र को रोकता है और हिंडलिंब ऊतक में ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ाता है। ऊरु धमनी बंधाव या जमावट के साथ संयोजन में, यह दृष्टिकोण लगातार एफवीबी चूहों में फुटपैड ऊतक हानि का उत्पादन करता है जो सीएलटीआई के एट्रोफिक परिवर्तनों जैसा दिखता है लेकिन शायद ही कभी अंग ऑटो-विच्छेदन 11 में प्रगति करता है। ऑक्सीडेटिव तनाव पीएडी / सीएलटीआई की पहचान में से एक है और एंडोथेलियल डिसफंक्शन और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) 13,14 की कम जैव उपलब्धता द्वारा प्रचारित किया जाता है। NO एक प्लुरिपोटेंट अणु है जो आमतौर पर धमनी और केशिका रक्त प्रवाह, प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण, और ल्यूकोसाइट भर्ती और सक्रियण 13 पर लाभकारी प्रभाव डालता है। एनओएस के कम स्तर को एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम को सक्रिय करने के लिए भी दिखाया गया है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है और एथेरोस्क्लेरोसिस 15 की प्रगति को तेज करता है।

एक बार hindlimb ischemia का एक मॉडल स्थापित किया जाता है, बाद के अंग reperfusion और किसी भी संभावित उपचार के चिकित्सीय प्रभाव की निगरानी भी आवश्यक हैं। प्रस्तावित मुरीन गैंग्रीन मॉडल में, पैर की सकल उपस्थिति का आकलन करने के लिए फेबर स्कोर का उपयोग करके ऊतक हानि की डिग्री को पहले परिमाणित किया जा सकता है (0: सामान्य, 1-5: नाखूनों का नुकसान जहां स्कोर प्रभावित नाखूनों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, 6-10: अंकों का शोष जहां स्कोर प्रभावित अंकों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, 11-12: आंशिक और पूर्ण पैर शोष, क्रमशः) 9. हिंडलिंब परफ्यूजन के मात्रात्मक माप को आमतौर पर एलडीपीआई का उपयोग करके बनाया जाता है, जो ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) 16 में पिक्सेल-स्तर परफ्यूजन को इंगित करने के लिए लेजर लाइट और लाल रक्त कोशिकाओं के बीच डॉपलर इंटरैक्शन पर निर्भर करता है। जबकि यह तकनीक मात्रात्मक, गैर-आक्रामक और दोहराए गए माप के लिए आदर्श है, यह हिंडलिंब वास्कुलचर 16 का दानेदार शारीरिक विवरण प्रदान नहीं करती है। अन्य इमेजिंग तौर-तरीके, जैसे माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी), चुंबकीय अनुनाद एंजियोग्राफी (एमआरए), और एक्स-रे माइक्रोएंजियोग्राफी, या तो महंगे साबित होते हैं, जिसमें परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है, या अन्यथा तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण 16। 2008 में, ली एट अल ने लिपोफिलिक कार्बोसाइनिन डाई DiI17 के साथ रेटिना के भीतर रक्त वाहिकाओं को लेबल करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया। डीआईआई एंडोथेलियल कोशिकाओं में शामिल है और प्रत्यक्ष प्रसार द्वारा, संवहनी झिल्ली संरचनाओं जैसे एंजियोजेनिक स्प्राउट्स और स्यूडोपोडल प्रक्रियाओं को दागता है17,18। एंडोथेलियल कोशिकाओं में इसके प्रत्यक्ष वितरण और डाई की अत्यधिक फ्लोरोसेंट प्रकृति के कारण, यह प्रक्रिया रक्त वाहिकाओं की तीव्र और लंबे समय तक चलने वाली लेबलिंग प्रदान करती है। 2012 में, बोडेन एट अल ने डीआईआई परफ्यूजन की तकनीक को मुरीन हिंडलिंब इस्केमिया मॉडल के लिए अनुकूलित किया, जो ऊरु धमनी बंधाव के बाद काटी गई जांघ एडक्टर मांसपेशियों के पूरे-माउंट इमेजिंग के माध्यम से था।

वर्तमान विधि hindlimb ischemia और जीन या सेल आधारित चिकित्सीय के जवाब में neovascularization का आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ती और तकनीकी रूप से व्यवहार्य तरीका प्रदान करता है। एक और अनुकूलन में, यह प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन में फुटपैड वास्कुलचर की छवि के लिए डीआईआई परफ्यूजन के आवेदन का वर्णन करता है और हिंडलिंब गैंग्रीन के एक मुरीन मॉडल में 3 डी।

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Protocol

प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु प्रयोगों को मियामी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। एफवीबी चूहों, दोनों नर और मादा, दोनों, 8-12 सप्ताह की आयु के, अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था।

1. L-NAME समाधान की तैयारी

  1. एक लैमिनर प्रवाह हुड में बाँझ स्थितियों के तहत, 50 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए 20 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ 1 जी एल-नाम पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करके एक एल-नाम स्टॉक समाधान तैयार करें। स्टॉक समाधान को 300-500 μL ऐलीकोट में 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एक काम कर रहे एल-नाम समाधान बनाने के लिए, एल-नाम स्टॉक समाधान का एक एलीकोट पिघलाएं और अंतिम 10 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ परिस्थितियों में पीबीएस (1: 4) के साथ पतला करें।
  3. PBS (pH 7.4) तैयार करने के लिए, NaCl के 8 g, KCl के 0.2 g, Na2HPO4 के 1.44 g, और 0.23 g NaH2PO4 को 800 mL आसुत जल में भंग करें। HCl के साथ pH को 7.4 पर समायोजित करें। 1,000 mL की कुल मात्रा में पानी जोड़ें और 0.22 μm बोतल शीर्ष फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    नोट: इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) 4 μL / g L-NAME काम करने वाले समाधान का इंजेक्शन L-NAME की वांछित 40 mg / kg खुराक के बराबर है। उपयोग के दौरान एल-नाम काम करने वाले समाधान को बर्फ पर रखा जाना चाहिए, और स्टॉक समाधान के ताजा पिघले हुए एलीकोट का उपयोग करके नए dilutions को दैनिक बनाया जाना चाहिए।

2. हिंडलिंब गैंग्रीन के रासायनिक और सर्जिकल प्रेरण

  1. FVB चूहों, 8-12 सप्ताह की आयु प्राप्त करें, या तो एक प्रजनक से या नस्ल में सुविधा ( सामग्री की तालिका देखें)। सर्जरी से 2 घंटे पहले, एल-नेम की 40 मिलीग्राम / किलोग्राम आईपी खुराक का प्रशासन करें।
  2. पीबीएस में पतला 100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किलोग्राम xylazine ( सामग्री की तालिका देखें) के आईपी इंजेक्शन के साथ चूहों को बेहोश करें। पैर की अंगुली-चुटकी पलटा की अनुपस्थिति से पर्याप्त बेहोश करने की क्रिया की पुष्टि करें और प्रक्रिया के दौरान श्वसन दर की निगरानी जारी रखें।
    1. कतरनी और / या एक depilatory क्रीम का उपयोग कर द्विपक्षीय hindlimbs और groins से बालों को निकालें। एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप सुपाइन के तहत जानवर की स्थिति; विस्तार और जगह में extremities टेप. सर्जिकल साइट के लिए povidone-आयोडीन समाधान परिधीय रूप से लागू करके सर्जिकल क्षेत्र sterilize.
  3. 10-20x आवर्धन के तहत, कैंची या एक स्केलपेल का उपयोग करें ताकि कमर क्रीज के साथ 1 सेमी चीरा लगाया जा सके, जो वंक्षण स्नायुबंधन से हीन है। ठीक संदंश और एक बाँझ कपास टिप applicator का उपयोग करने के लिए स्पष्ट रूप से वंक्षण स्नायुबंधन से वंक्षण वसा पैड पार्श्व विच्छेदन और अंतर्निहित ऊरु म्यान को उजागर इतना है कि ऊरु धमनी, नस, और तंत्रिका स्पष्ट रूप से पहचाना जाता है (चित्रा 1).
  4. ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, ऊरु म्यान छेदना। ध्यान से ऊरु धमनी से दूर ऊरु तंत्रिका ब्रश. ऊरु धमनी (LCFA) की पार्श्व circumflex शाखा के टेक-ऑफ की पहचान करें जो ऊरु तंत्रिका तक गहरी होती है (चित्र1)।
    1. ऊरु धमनी और शिरा के इलेक्ट्रोकोएगुलेशन के साथ आगे बढ़ें जो एलसीएफए के निकटस्थ है, जो कि कॉटेरी डिवाइस को सक्रिय करता है ( सामग्री की तालिका देखें) और धीरे-धीरे जहाजों को साइड-टू-साइड गति के साथ संपर्क करता है, यह सुनिश्चित करता है कि ऊरु तंत्रिका अच्छी तरह से अलग-थलग है और थर्मल चोट से सुरक्षित रहती है। कैंची के साथ coagulated पोत खंड विभाजित करें।
  5. वंक्षण वसा पैड को औसत दर्जे से जुटाकर डिस्टल ऊरु धमनी और नस के जोखिम के साथ आगे बढ़ें। सतही एपिगैस्ट्रिक धमनी और सेफेनोपोप्लाइटल जंक्शन को अधिक दूरस्थ रूप से पहचानें।
    1. इन दो स्थानों के बीच ऊरु म्यान को छेदें और ध्यान से ऊरु वाहिकाओं से दूर ऊरु तंत्रिका को विच्छेदित करें। चरण 2.4.1 में वर्णित ऊरु धमनी और शिरा के जमावट और ट्रांससेक्शन के साथ आगे बढ़ें।
  6. बाँझ PBS से भरे एक सिरिंज का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र की सिंचाई करें। रक्तस्राव के किसी भी क्षेत्र के लिए 3-5 मिनट के लिए एक कपास टिप applicator के साथ कोमल दबाव लागू करके hemostasis प्राप्त करें।
    1. एक सरल निरंतर फैशन में अवशोषित 5-0 सीवन का उपयोग करके चीरा के बंद होने के साथ आगे बढ़ें। पश्चात के दर्द से राहत के लिए निरंतर-रिलीज buprenorphine ( सामग्री की तालिका देखें) की एक 1 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे की खुराक का प्रशासन करें।
  7. LDPI द्वारा ligated hindlimb में footpad परफ्यूजन के नुकसान की पुष्टि करें ( सामग्री की तालिका देखें)। जबकि अभी भी anesthetized, LDPI मशीन के नीचे एक प्रवण स्थिति में एक अंधेरे फोम पैड पर जानवर जगह में जगह है और जगह में पैरों को सुरक्षित करने के लिए बिजली के टेप के छोरों का उपयोग करें।
    1. द्विपक्षीय पैरों के LDPI के साथ आगे बढ़ें। एक बार स्कैनिंग पूरी हो जाने के बाद, प्रत्येक फुटपैड के चारों ओर एक आरओआई खींचें और माध्य फ्लक्स मान प्राप्त करें।
    2. परफ्यूजन सूचकांक की गणना लिगेटेड से गैर-लिगेटेड फुटपैड तक माध्य फ्लक्स मानों के अनुपात के रूप में करें। सुनिश्चित करें कि परफ्यूजन इंडेक्स 0.1 से कम है।
  8. कोर शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड या ओवरहेड लैंप के साथ जानवर को एक साफ पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें। चूहों को पशु सुविधा में वापस स्थानांतरित करने से पहले संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली सुनिश्चित करें।

3. एल नाम के पश्चात प्रशासन और hindlimb gangrene की निगरानी

  1. पोस्टऑपरेटिव दिनों में 1-3 पर, प्रत्येक जानवर को एल-नेम की अतिरिक्त 40 मिलीग्राम / किलोग्राम आईपी खुराक का प्रशासन करें। उसी समय, इस्केमिक अंग से पैर का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करें।
  2. Faber hindlimb ischemia score9 का उपयोग कर hindlimb ischemia और गैंग्रीन की डिग्री की मात्रा निर्धारित करें। स्कोर 1-5: इस्केमिक नाखूनों की संख्या; स्कोर 6-10: 1-5 इस्केमिक अंक; स्कोर 11 और 12: आंशिक और पूर्ण पैर शोष। पोस्टऑपरेटिव दिनों 1-3 और फिर साप्ताहिक पर रिकॉर्ड फैबर स्कोर।

4. DiI की तैयारी और पशु परफ्यूजन के लिए काम समाधान

  1. DiI स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, 100% इथेनॉल के 16.7 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम DiI क्रिस्टल ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें। एल्यूमीनियम पन्नी में कवर और कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर एक रॉकिंग मंच पर छोड़ दें।
  2. डिलुएंट तैयार करने के लिए, 5% ग्लूकोज समाधान उत्पन्न करने के लिए 1,000 मिलीलीटर आसुत पानी में 50 ग्राम ग्लूकोज को भंग करें। एक 0.22 μm बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर. एक काम कर रहे डिल्यूएंट समाधान तैयार करने के लिए 1: 4 अनुपात में पीबीएस और 5% ग्लूकोज समाधान मिलाएं।

5. उपकरण सेटअप और DiI परफ्यूजन

  1. उपयोग से तुरंत पहले काम करने वाले डिलुएंट समाधान (चरण 4.2 में तैयार) के 10 मिलीलीटर में 10 मिलीलीटर में डीआईआई स्टॉक समाधान के 200 μL जोड़कर DiI काम करने वाला समाधान बनाएं। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए हाथ से मिलाएं।
  2. श्रृंखला में दो या तीन 3-तरफ़ा स्टॉपकॉक्स और एक 25 जी तितली सुई से कनेक्ट करें। पीबीएस के 4 एमएल, डीआईआई समाधान के 10 एमएल, और 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन के 10 मिलीलीटर के साथ 10 एमएल सिरिंज तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. फॉर्मेलिन के साथ सिरिंज को समीपस्थ प्रवाह बंदरगाह से कनेक्ट करें और लाइन से हवा को फ्लश करने के लिए समाधान को इंजेक्ट करें; बंदरगाह को बंद करने के लिए स्टॉपकॉक को चालू करें। एक ही प्रक्रिया को क्रमिक रूप से दोहराएं, सिरिंज को डीआईआई के साथ और फिर पीबीएस को क्रमशः मध्य और डिस्टल इनफ्लो बंदरगाहों से जोड़ते हुए, स्टॉपकॉक असेंबली के माध्यम से सभी हवा के बुलबुले को फ्लश करने का ध्यान रखते हुए।
    नोट: सुनिश्चित करें कि स्टॉपकॉक असेंबली या ट्यूबिंग के किसी भी हिस्से में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। हवा के बुलबुले परफ्यूजन के दौरान छोटी धमनियों को रोक सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप खराब इंट्रावैस्कुलर डीआईआई वितरण और समझौता इमेजिंग परिणाम होते हैं।
  4. एक बार सेटअप पूरा हो जाने के बाद, एक प्रेरण कक्ष में CO2 ओवरडोज द्वारा जानवर को euthanize करें।
  5. जानवर को एक अवशोषक पैड पर एक सुपाइन स्थिति में perfused होने के लिए रखें और सुइयों के साथ सुरक्षित एक्सिले और निचले छोर।
  6. कैंची का उपयोग करके, उदर गुहा को खोलने के लिए एक अनुप्रस्थ चीरा बनाएं। बेनकाब करें और फिर वक्ष गुहा तक पहुंचने के लिए बाएं और दाएं डायाफ्राम को विभाजित करें।
    1. उरोस्थि के दोनों ओर छाती की दीवार को निचले पसलियों से पहली या दूसरी पसलियों तक काटें, आंतरिक वक्षीय (स्तन) धमनियों से औसत दर्जे की बचत करें। उरोस्थि के निचले छोर को समझने के लिए एक हेमोस्टैट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए जानवर के सिर की ओर इसे प्रतिबिंबित करें।
  7. बाएं वेंट्रिकल की पहचान करें, जो दाएं वेंट्रिकल की तुलना में रंग में हल्का दिखाई देता है। धीरे से कुंद संदंश के साथ दिल को समझें और तितली सुई को बाएं वेंट्रिकल में डालें।
    1. सही आलिंद पंचर करने के लिए कैंची या 18 जी सुई का उपयोग करें, जिससे रक्त और परफ्यूजन समाधान ों को नाली के लिए दिल में लौटने की अनुमति मिलती है। एक या दो हाथों से सुई को स्थिर करें, ध्यान रखें कि अनजाने में सही वेंट्रिकल को पंचर न करें और प्रणालीगत परिसंचरण के बजाय फुफ्फुसीय को पारफ्यूज न करें।
  8. पीबीएस के साथ सिरिंज के लिए बंदरगाह खोलें और संवहनी प्रणाली से रक्त फ्लश करने के लिए 1-2 मिनट के लिए 1-2 एमएल / मिनट की दर से 2-4 मिलीलीटर को मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करें। दाएं आलिंद से रक्तस्राव को देखकर सफल परफ्यूजन सुनिश्चित करें। इंजेक्शन के बाद, पीबीएस सिरिंज के बंदरगाह को बंद करें।
  9. डीआईआई के साथ सिरिंज के लिए बंदरगाह खोलें और 5 मिनट के लिए 1-2 एमएल / मिनट की दर से 5-10 मिलीलीटर इंजेक्ट करें। कान, नाक और हथेलियों की निगरानी करें जो डीआईआई समाधान के इंजेक्शन के साथ थोड़ा गुलाबी होना चाहिए। इंजेक्शन के बाद, DiI सिरिंज के बंदरगाह को बंद करें और फिक्सेटिव के इंजेक्शन से पहले डाई को शामिल करने की अनुमति देने के लिए 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  10. फॉर्मेलिन के साथ सिरिंज के लिए बंदरगाह खोलें और 5 मिनट के लिए 1-2 एमएल / मिनट की दर से 5-10 मिलीलीटर इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद, बाएं वेंट्रिकल से सुई को हटा दें और ब्याज के ऊतकों को काटने के लिए आगे बढ़ें।
  11. भारी कैंची का उपयोग करके, टखने पर टिबिया को अलग करें, निचले पैरों से बाएं और दाएं पैरों को पूरी तरह से अलग करें। 10% फॉर्मेलिन समाधान के 1-2 मिलीलीटर के साथ एक 6- या 12-अच्छी तरह से प्लेट में काटे गए पैरों को रखें। प्लेट को पन्नी के साथ लपेटें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए footpad ऊतक की तैयारी

  1. अगले दिन, 6- या 12-अच्छी तरह से प्लेट में फिक्सेटिव समाधान को 1-2 मिलीलीटर पीबीएस प्रति अच्छी तरह से बदलें।
  2. पैर की त्वचा के लिए, सबसे पहले, पैर के प्लांटर और पृष्ठीय पहलुओं पर एक स्केलपेल के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं। फिर, दांतेदार संदंश और एक छोटे से हेमोस्टैट का उपयोग करके, ध्यान से पैर और अंकों से सभी त्वचा को हटा दें, अंतर्निहित नरम ऊतकों को नुकसान न पहुंचाएं।
  3. ऊतकों के बढ़ते और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें, अधिमानतः परफ्यूजन और फसल के 1-2 दिनों के भीतर। वैकल्पिक रूप से, पीबीएस के 1-2 एमएल के साथ 6- या 12-अच्छी तरह से प्लेटों पर फुटपैड वापस करें; पन्नी के साथ कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए अप करने के लिए 1 महीने के लिए प्रतिदीप्ति बनाए रखने के लिए।
  4. ऊतकों को माउंट करने के लिए, व्यक्तिगत रूप से दो ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच पैर रखें, जिसमें फोम बायोप्सी पैड खुद पर मुड़ा हुआ है (ऊतक की मोटाई के आधार पर एक या दो बार) प्रत्येक छोर पर ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक छोर पर ग्लास स्लाइड को एक साथ संपीड़ित करने के लिए दो छोटे बाइंडर क्लिप का उपयोग करें (अंतिम मोटाई लगभग 1 मिमी)।
    नोट: मोटे ऊतकों को लंबे समय तक स्कैनिंग समय की आवश्यकता होगी। चमड़ी वाले फुटपैड को ऊतक की मोटाई को कम करने के लिए इमेजिंग से एक दिन पहले ग्लास स्लाइड के बीच संकुचित किया जा सकता है।

7. Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी

  1. इमेजिंग सत्र के लिए तैयार करें: इमेजिंग सिस्टम को चालू करें और अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर शुरू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। छवियों को कैप्चर करने के लिए कम आवर्धन / कम संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (उदाहरण के लिए, x5 / 0.15) का उपयोग करें क्योंकि कम आवर्धन लेंस में आमतौर पर इस प्रयोग के लिए आवश्यक लंबी काम करने वाली दूरी होती है।
  2. हाँ से चरण सक्रिय करें संवाद बॉक्स पर क्लिक करें. कॉन्फ़िगरेशन टैब में 561 nm लेजर को सक्रिय करें। मुख्य स्क्रीन पर, दृश्यमान बटन पर क्लिक करके एक दृश्यमान बीम पथ सक्रिय करें. संबंधित सक्रिय चेकबॉक्स पर क्लिक करके 570-600 nm श्रेणी के लिए एक डिटेक्टर सेट करें।
  3. > अधिग्रहण प्राप्त करें टैब में टाइल स्कैन चिह्न का चयन करें और वांछित रिज़ॉल्यूशन (512 x 512 या 1024 x 1024) सेट करें।
  4. माइक्रोस्कोप चरण पर कांच की स्लाइड के बीच संकुचित शुष्क-घुड़सवार (कोई पानी या पीबीएस नहीं जोड़ा गया) ऊतक नमूना की स्थिति और ध्यान में ऊतक लाने के लिए।
  5. स्कैनिंग सीमाएँ सेट करने के लिए, नमूने के ऊपरी बाएँ या दाएँ कोने पर नेविगेट करें. अधिग्रहण टैब में, टाइल स्कैन मेनू के तहत, स्थिति चिह्नित करें बटन पर क्लिक करें. विपरीत कोने पर नेविगेट करें (क्रमशः निचले दाएं या बाएं) और एक बार फिर मार्क पोजीशन बटन पर क्लिक करें।
  6. Z-स्टैक की गहराई सेट करने के लिए, स्क्रीन के निचले-बाएँ कोने पर लाइव बटन पर क्लिक करें और नमूने के केंद्र में नेविगेट करें. नमूने के नीचे स्क्रॉल करने के लिए z-अक्ष घुंडी का उपयोग करें।
  7. अधिग्रहण टैब में, Z-स्टैक मेनू के अंतर्गत, प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करें. नमूने के शीर्ष पर स्क्रॉल करें और अंत बटन पर क्लिक करें। Z-चरण आकार पर क्लिक करें और वांछित मूल्य (जैसे, 50 μm) पर सेट करें।
  8. स्क्रीन के निचले दाएं कोने में, छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रारंभ करें पर क्लिक करें।

8. मात्रात्मक विश्लेषण और फुटपैड संवहनी के 3 डी पुनर्निर्माण

  1. डाउनलोड करें और फिजी (ImageJ) के नवीनतम संस्करण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पोत विश्लेषण plugin20 स्थापित करें. फिजी में माइक्रोस्कोपी छवि फ़ाइलों को खोलें, जो अलग-अलग जेड-श्रृंखला को जेड-स्टैक में संयोजित करेगा जिसे छवि के निचले भाग में स्लाइडर का उपयोग करके जेड-अक्ष में देखा जा सकता है।
  2. समग्र Z-स्टैक छवि का चयन करें और फिर मेनू छवि के तहत, एक दो-आयामी प्रक्षेपण बनाने के लिए स्टैक > Z प्रोजेक्ट चुनें। अगला, Z-प्रोजेक्शन को बाइनरी बनाने की प्रक्रिया > तहत बाइनरी में कनवर्ट > करें।
  3. संवहनी घनत्व > प्लगइन्स के तहत संवहनी घनत्व प्लगइन चलाएँ। जब संकेत दिया जाता है, तो फ़ुटपैड और अंकों की परिधि के चारों ओर एक ROI का पता लगाने के लिए कर्सर का उपयोग करें। उस पोत घनत्व पर ध्यान दें जो रिपोर्ट किया गया है, जिसे आरओआई (संवहनी क्षेत्र अंश) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है।
  4. फिजी में 3 डी पुनर्निर्माण बनाने के लिए, स्टैक्स > 3 डी प्रोजेक्ट का चयन करें और मेनू छवि के तहत वांछित रोटेशन अक्ष, कोण और गति सेट करें। वैकल्पिक रूप से, स्लाइस के रूप में छवियों को विज़ुअलाइज़ करने या वांछित अक्षों में पुनर्निर्माण में हेरफेर करने के लिए प्लगइन्स मेनू के तहत वॉल्यूम व्यूअर का चयन करें।
  5. अधिक शामिल 3 डी रेंडरिंग के लिए, वैकल्पिक छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। फ़ाइलों को वांछित सॉफ़्टवेयर के प्रारूप में कनवर्ट करें और टाइल सिलाई कार्यक्षमता का उपयोग करके व्यक्तिगत टाइल स्कैन को सिलाई करें।
  6. अलग-अलग टाइल स्कैन को एक साथ सिलाई करने के बाद, समग्र फ़ाइल खोलें और वॉल्यूम सतह प्रतिपादन के साथ आगे बढ़ें। सरफेस क्रिएशन विज़ार्ड खोलने के लिए नई सतह जोड़ें पर क्लिक करें और मेनू के माध्यम से टॉगल करने के लिए तीरों का उपयोग करें, विशेष रूप से आरओआई और थ्रेशोल्ड तीव्रता सेट करें। एक बार सतह प्रतिपादन से संतुष्ट होने के बाद, संसाधित छवि के वीडियो बनाने के लिए एनीमेशन कार्यक्षमता का उपयोग करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का विवरण ischemia और ऊतक हानि को प्रेरित करने का एक विश्वसनीय साधन है murine footpad L-NAME प्रशासन के साथ ऊरु धमनी और शिरा जमावट के संयोजन का उपयोग कर, एक नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ अवरोधक, अतिसंवेदनशील FVB चूहों में. चित्रा 1 मुरीन हिंडलिंब वास्कुलचर की शारीरिक रचना का विवरण देता है और ऊरु धमनी और शिरा जमावट (पीला एक्स) की साइटों को इंगित करता है, जो पार्श्व सर्कमफ्लेक्स फेमोरल धमनी (एलसीएफए) के समीपस्थ और सेफेनोप्रोप्लाइटल जंक्शन के समीपस्थ है। एलसीएफए की पहचान करने की आवश्यकता है, और इस संरचना से संबंधित जमावट साइटों को सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं में सुसंगत रखा जाता है। जैसा कि वर्णित है, सर्जिकल प्रक्रियाओं से 2 घंटे पहले और पोस्टऑपरेटिव दिनों में 1-3 पर, चूहों को ऑक्सीडेटिव तनाव के ऊंचे ऊतक स्तर को बनाए रखने के लिए एल-नाम के 40 मिलीग्राम / किग्रा आईपी भी प्रशासित किया गया था। चित्रा 2 ऊतक हानि में भिन्नता को दर्शाता है जिसे सर्जरी के एक सप्ताह बाद इस मॉडल से उम्मीद की जा सकती है, जिसमें फेबर स्कोर 9 प्रत्येक छवि के निचले दाएं कोने में दर्ज किया गया है।

DiI परफ्यूजन 5 और 20 दिनों के बाद FVB चूहों में ऊरु धमनी और शिरा जमावट के बाद किया गया था ताकि ischemia के प्रेरण के बाद hindlimb reperfusion का आकलन किया जा सके। चित्रा 3A वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए विच्छेदन के बाद मुरीन शरीर रचना विज्ञान को दर्शाता है। कार्डियक परफ्यूजन शुरू करने के लिए एक तितली सुई को बाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है। ध्यान दें कि बाएं वेंट्रिकल दाएं वेंट्रिकल की तुलना में रंग में थोड़ा पतला दिखाई देता है। चित्रा 3B श्रृंखला में जुड़े स्टॉपकॉक्स और पीबीएस, डीआईआई समाधान और फिक्सेटिव से भरे तीन सिरिंज के साथ स्थापित उपकरण ों को दर्शाता है। DiI परफ्यूजन के बाद, पैरों को काटा गया, चमड़ी और माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच संकुचित किया गया, जैसा कि चित्र 3 C, D में दिखाया गया है, 5x आवर्धन के तहत एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग से पहले। पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी छवियों ने गैर-लिगेटेड कंट्रोल फुटपैड (चित्रा 4 ए) में सामान्य संवहनी शरीर रचना विज्ञान का खुलासा किया, जो सर्जरी के 5 दिन बाद लिगेटेड हिंडलिंब के फुटपैड पर गंभीर रूप से कम परफ्यूजन की तुलना में (चित्रा 4 बी)। सर्जरी के बीस दिन बाद, फुटपैड पर परफ्यूजन में काफी सुधार हुआ (चित्रा 4 सी, डी, और चित्रा 5 बी), हालांकि गैर-लिगेटेड नियंत्रण (चित्रा 4 ए और चित्रा 5 ए) की सीमा तक नहीं। फिजी में वेसल डेंसिटी प्लगइन का उपयोग करके ऊपर वर्णित के रूप में संवहनी को परिमाणित किया गया था। नियंत्रण फुटपैड के लिए संवहनी अंश 28% था। सर्जरी के पांच दिन बाद, फुटपैड संवहनी अंश को गंभीर रूप से 2% तक कम कर दिया गया था, लेकिन धीरे-धीरे 20 दिनों के बाद दो अलग-अलग चूहों में 15% और 18% तक ठीक हो गया। 3 डी में फुटपैड संवहनी शरीर रचना विज्ञान की कल्पना करने के लिए, हमने पहले वर्णित सतह प्रतिपादन बनाने के लिए वैकल्पिक छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर में एक सिले हुए माइक्रोस्कोपी छवि को आयात किया (पूरक चित्रा 1)। सतह रेंडरिंग का एक वीडियो तब एनीमेशन कार्यक्षमता (वीडियो 1) का उपयोग करके बनाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: मुरीन हिंडलिंब वास्कुलचर और ऊरु धमनी और शिरा जमावट की साइटों की शारीरिक रचना। बाहरी इलियाक धमनी वंक्षण स्नायुबंधन के लिए ऊरु धमनी (एफए) डिस्टल के रूप में जारी रहती है। ऊरु धमनी की पहली शाखाओं में पार्श्व सर्कमफ्लेक्स (एलसीएफए) और गहरी ऊरु धमनियां (चित्रित नहीं) शामिल हैं। अधिक दूरस्थ रूप से, समीपस्थ पुच्छल ऊरु (PCFA) और सतही पुच्छल epigastric धमनियों (SCEA) शाखा FA समीपस्थ से saphenous (SA) और popliteal धमनियों (PA) के विभाजन के लिए निकटस्थ. ऊरु वाहिकाओं के साथ-साथ ऊरु तंत्रिका (एफएन) पाठ्यक्रम और ऊरु वाहिकाओं के जमावट से पहले धीरे-धीरे अलग किया जाना चाहिए। एफए और फेमोरल शिरा (एफवी) जमावट साइटों को भी इंगित किया जाता है (एक्स)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इसी फैबर स्कोर के साथ FVB चूहों में hindlimb गैंग्रीन की प्रतिनिधि छवियों. इस मॉडल द्वारा प्रेरित इस्केमिक परिवर्तनों की डिग्री एक या अधिक इस्केमिक नाखूनों (फैबर स्कोर 1-5) से गैंगरेनस अंकों (फेबर स्कोर 6-10) और आंशिक या पूर्ण पैर शोष तक भिन्न होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पशु विच्छेदन और DiI परफ्यूजन के लिए उपकरण सेटअप और इमेजिंग के लिए माउस पैर के बढ़ते. (A) DiI परफ्यूजन के दौरान मुरीन शरीर रचना विज्ञान की संरचनात्मक तस्वीर। उदर और वक्षीय गुहाओं को खोला जाता है, उरोस्थि परिलक्षित होती है, और पसलियों को उरोस्थि के दोनों ओर काट दिया जाता है। स्टॉपकॉक असेंबली से जुड़ी एक 25 जी तितली सुई को बाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है। (बी) तीन 3-तरफ़ा स्टॉपकॉक श्रृंखला में जुड़े हुए हैं। तीन 10 एमएल सिरिंज फिक्सेटिव, डीआईआई और पीबीएस से भरे होते हैं और स्टॉपकॉक असेंबली से जुड़े होते हैं। एक 25 जी तितली सुई समीपस्थ स्टॉपकॉक के बहिर्वाह बंदरगाह से जुड़ी होती है। (सी) स्लाइड्स को एक साथ संपीड़ित करने के लिए प्रत्येक छोर पर एक मुड़ा हुआ फोम बायोप्सी पैड और बाइंडर क्लिप के साथ दो माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच बढ़ते चमड़ी वाले पैर। (d) माइक्रोस्कोप स्लाइड्स के बीच संकुचित चमड़ी वाले पैर का एक वैकल्पिक दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस फुटपैड के कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि 5x छवियां डीआईआई परफ्यूजन के बाद आरओआई के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए मात्रात्मक पोत घनत्व के साथ। (बी) ऊरु धमनी और शिरा जमावट के 5 दिन बाद फुटपैड वास्कुलचर न्यूनतम पोत ओपेसिफिकेशन के साथ गंभीर रूप से कम परफ्यूजन दिखाता है। (सी) ऊरु धमनी और शिरा जमावट के 20 दिन बाद फुटपैड वास्कुलचर मेटाटार्सल और डिजिटल धमनियों में डिस्टल प्रवाह के कुछ पुनर्गठन को दर्शाता है। (डी) एक अतिरिक्त माउस फुटपैड की छवि ऊरु धमनी और शिरा जमावट के 20 दिनों के बाद प्राप्त की गई जो माइक्रोवैस्कुलर ओपेसिफिकेशन की तुलना में न्यूनतम बड़े पोत को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फुटपैड वास्कुलचर की आवर्धित छवियां। (ए) 5x और नियंत्रण फुटपैड वास्कुलचर की 20x छवियां मेटाटार्सल और डिजिटल धमनियों के माध्यम से बरकरार परफ्यूजन का प्रदर्शन करती हैं। (बी) 5x और 20x ligated hindlimb से फुटपैड की छवियों 20 दिनों के पश्चात बड़े metatarsal धमनी शाखाओं के माध्यम से कम परफ्यूजन दिखा रहा है, लेकिन एक व्यापक, आलीशान केशिका नेटवर्क के विकास. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: footpad vasculature के 3 डी सतह प्रतिपादन के एनीमेशन. फुटपैड वास्कुलचर की सतह प्रतिपादन प्रदर्शित करने वाला वीडियो वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त करने योग्य 3 डी रिज़ॉल्यूशन को दर्शाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: DiI परफ्यूजन छवियों की सतह प्रतिपादन में कदम. (ए) मूल DiI परफ्यूजन छवि छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में आयातित. (बी) दहलीज तीव्रता की स्थापना के दौरान डीआईआई परफ्यूजन छवि पर ओवरलेड सतह प्रतिपादन। (C) DiI परफ्यूजन माइक्रोस्कोपी छवि का अंतिम 3D सतह प्रतिपादन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

जबकि माउस hindlimb ischemia PAD और CLTI में neovascularization का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया preclinical मॉडल है, वहाँ ischemia गंभीरता और वसूली में महत्वपूर्ण भिन्नता विशिष्ट माउस तनाव और साइट, संख्या, और धमनी व्यवधान की विधि के आधार पर है. ऊरु धमनी बंधाव और एल-नाम के आईपी प्रशासन का संयोजन मज़बूती से FVB mice11 में hindlimb gangrene को प्रेरित कर सकता है। एक ही उपचार के परिणामस्वरूप C57BL /6 चूहों में ऊतक हानि के बिना हिंडलिम्ब ischemia होता है, जबकि BALB / c चूहों में, पैर या पैर के ऑटो-विच्छेदन को अकेले ऊरु धमनी बंधाव द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। इस प्रकार, एफवीबी चूहों में समवर्ती एल-नाम प्रशासन के साथ ऊरु धमनी जमावट की उपर्युक्त वर्णित तकनीक, जिसमें इस्केमिया अपमान के लिए एक मध्यवर्ती प्रतिक्रिया है, फुटपैड गैंग्रीन का एक अद्वितीय और पुनरुत्पादन योग्य मॉडल प्रदान करता है जो सीएलटीआई की ओर ले जाने वाली बीमारियों की सबसे गंभीर अभिव्यक्ति में देखा जाता है। इस मॉडल के साथ देखे गए ऊतक हानि की डिग्री कुछ इस्केमिक नाखूनों से कई गैंग्रीनस अंकों तक भिन्न हो सकती है, लेकिन शायद ही कभी पैर या पैर के ऑटो-विच्छेदन के लिए प्रगति करती है, जो अंग reperfusion और फ़ंक्शन के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। BALB / c चूहों के विपरीत, जिसमें गैंग्रीन की शुरुआत अंग ऑटो-विच्छेदन के साथ तेजी से होती है, आमतौर पर एक सप्ताह से भी कम समय में होती है, इस FVB माउस गैंग्रीन मॉडल में ऊतक हानि की देरी से शुरुआत होती है। ऊरु धमनी जमावट तीव्र रूप से हिंदलिंब में रक्त के प्रवाह को प्रतिबंधित करता है। फिर भी, पोस्टऑपरेटिव दिनों 0-3 पर एल-नाम प्रशासन के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव का संचय अधिक क्रमिक है, जिसमें 7-14 दिनों के बीच पीक एट्रोफिक परिवर्तन देखे गए हैं। इसलिए, यह मॉडल एक बेहतर चिकित्सीय विंडो प्रदान करता है ताकि सकल ऊतक उपस्थिति पर एक विशेष हस्तक्षेप के प्रभावों का मूल्यांकन किया जा सके और ऊतक हानि के बचाव के अलावा reperfusion को परिमाणित किया जा सके और अंग समारोह का आकलन किया जा सके।

सर्जिकल तकनीक के बारे में, ऊरु धमनी और शिरा दोनों के जमावट या बंधन को ऊरु धमनी के अलगाव की तुलना में इस ऑपरेशन की सापेक्ष आसानी के कारण पसंद किया जाता है। जबकि यह तकनीक शिरापरक घनास्त्रता और अपर्याप्तता का कारण बन सकती है, यह इस्केमिक अपमान को जोड़ती है और गैंगरेनस परिवर्तनों को अधिक मज़बूती से प्रेरित करने में मदद करती है। इसके अतिरिक्त, पुरानी शिरापरक अपर्याप्तता (सीवीआई) सामान्य आबादी में अत्यधिक प्रचलित है, जिसमें 10% -30% वयस्क प्रभावित होते हैं। लगातार, पीएडी वाले लगभग 20% रोगियों, विशेष रूप से गंभीर धमनी अपर्याप्तता वाले लोगों में, कोमॉर्बिड सीवीआई 21,22 भी होते हैं। भले ही कोई ऊरु शिरा को लिगेट या जमा करने का फैसला करता है, प्रयोगात्मक समूहों में ऊरु धमनी व्यवधान स्थिरांक की विशिष्ट साइट (ओं) को बनाए रखना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। अधिक समीपस्थ बंधन, जैसे कि इलियाक धमनी, अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम संपार्श्विकों के रोड़ा का कारण बनते हैं और धमनीजनन 8,16 की संभावना को सीमित करते हैं। हालांकि, अंग के दूरस्थ भाग में एंजियोजेनेसिस, विशेष रूप से गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशी, अभी भी ट्रिगर किया जाना चाहिए। FVB चूहों में, डबल बंधाव या ऊरु धमनी के जमावट सिर्फ पार्श्व circumflex ऊरु धमनी के समीपस्थ और saphenopopliteal विभाजन के समीपस्थ अधिक लगातार एक एकल बंधाव या जमावट साइट की तुलना में गैंग्रीन को प्रेरित करता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पीएडी और सीएलटीआई रोगियों में, अंग ischemia atherosclerotic बाधा (एक पुरानी प्रक्रिया) के कारण होता है। इसके विपरीत, माउस मॉडल में, अंग ischemia शल्य चिकित्सा (एक तीव्र प्रक्रिया) प्रेरित है। यद्यपि इस FVB माउस हिंडलिंब गैंग्रीन मॉडल में ऊतक हानि की देरी से चोटी की गंभीरता के साथ गैंग्रीन की अपेक्षाकृत धीमी शुरुआत होती है, यह सीधे पीएडी और सीएलटीआई की पुरानी, प्रगतिशील धमनी स्टेनोसिस विशेषता के साथ तुलनीय नहीं है। अन्य समूहों ने एक बाहरी धातु आस्तीन और नमी-अवशोषित सामग्री की एक आंतरिक परत शामिल है जो धीरे-धीरे आत्म-विस्तार ति होती है, में एमेरॉइड कंस्ट्रिक्टर का उपयोग करके सबएक्यूट फेमोरल धमनी रोड़ा तकनीकों का विकास किया गया है। इस तकनीक को भड़काऊ मार्करों की अभिव्यक्ति में कमी, 4-5 सप्ताह में कम रक्त प्रवाह वसूली, और मांसपेशियों परिगलन 23,24 को कम करने के परिणामस्वरूप दिखाया गया है। ischemia तीक्ष्णता में अंतर के अलावा, युवा, स्वस्थ जानवरों का उपयोग करने वाले प्रीक्लिनिकल मॉडल भी मधुमेह, उच्च रक्तचाप, मोटापा, हाइपरलिपिडिमिया, धूम्रपान और संक्रमण जैसे जोखिम कारकों को दोहराने में विफल रहते हैं जो प्रमुख प्रतिकूल अंग घटनाओं और संवहनी रोग के बोझ में योगदान करते हैं।

मुरीन हिंडलिंब ischemia के अधिकांश अध्ययनों में, इस्केमिक हिंडलिंब में रक्त प्रवाह की बहाली आमतौर पर LDPI24,25 के माध्यम से मूल्यांकन की जाती है। यह विधि गैर-आक्रामक और दोहराने योग्य है, लेकिन कोर शरीर के तापमान, संवेदनाहारी उपयोग, बालों की उपस्थिति और hindlimbs26 की स्थिति से प्रभावित हो सकती है। इन प्रक्रियाओं का मानकीकरण और एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में गैर-लिगेटेड हिंडलिंब का उपयोग करने से किसी भी भिन्नता को कम करने में मदद मिल सकती है। LDPI के विपरीत, माइक्रो-सीटी और MRA उच्च-रिज़ॉल्यूशन, 3 डी शारीरिक जानकारी प्रदान करते हैं लेकिन पारंपरिक रूप से इसके विपरीत एजेंट 16 के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। एक्स-रे माइक्रोएंजियोग्राफी भी आक्रामक और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है16,27। डीआईआई की तरह, रेडियोपेक सिलिकॉन कास्टिंग एजेंटों के साथ परफ्यूजन परिधीय वास्कुलचर 28 के पोस्टमार्टम 3 डी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट लेक्टिन के इंट्राकार्डियक या पूंछ शिरा इंजेक्शन को ऊतक वास्कुलचर 29 के लेबलिंग के लिए भी वर्णित किया गया है। ब्याज के ऊतकों की फसल के बाद, एंडोथेलियल-विशिष्ट मार्करों (जैसे, सीडी 31, वॉन विलेब्रांड कारक) के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग का उपयोग अक्सर केशिका घनत्व 30 को मापने के लिए किया जाता है।

ऊपर उल्लिखित तकनीकों की तुलना में, DiI परफ्यूजन कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, अभिकर्मकों और आवश्यक सामग्री अपेक्षाकृत सस्ती हैं, बशर्ते कि एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप तक पहुंच उपलब्ध हो। यह विधि वास्कुलचर के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति देती है, जिसे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। जबकि यह प्रोटोकॉल फुटपैड वास्कुलचर पर केंद्रित है, अन्य मुरीन हिंडलिंब ऊतकों की पूरे-माउंट इमेजिंग, विशेष रूप से गैस्ट्रोकेनेमियस और एडक्टर मांसपेशियों, एंजियोजेनेसिस और आर्टेरियोजेनेसिस 19 अध्ययनों के लिए भी संभव और प्रासंगिक है। इस तकनीक को चूहों और खरगोशों सहित बड़े पशु मॉडल के लिए संशोधित किया जा सकता है, परफ्यूजन समाधानों की मात्रा में वृद्धि करके। हालांकि, ऊतक के आकार के बारे में इमेजिंग बाधाओं को नीचे वर्णित किया गया है।

DiI परफ्यूजन के महत्वपूर्ण भाग इस प्रकार हैं। उपकरण में हवा के बुलबुले छोटे जहाजों को रोक सकते हैं और वास्कुलचर में डीआईआई के वितरण में बाधा डाल सकते हैं, जिससे इमेजिंग परिणाम प्रभावित होते हैं। इस प्रकार, स्टॉपकॉक उपकरण में किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने और परफ्यूजन से पहले ट्यूबिंग करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। एक 0.22 μm बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से DiI को छोड़कर सभी समाधान फ़िल्टर भी किसी भी सूक्ष्म कणों को हटाने के लिए सिफारिश की है. इंट्राकार्डियक परफ्यूजन के दौरान, फेफड़ों की सावधानीपूर्वक निगरानी करें। यदि वे बढ़े हुए हो जाते हैं और गुलाबी रंग में गुलाबी हो जाते हैं, तो यह एक संकेत है कि तितली की सुई सही वेंट्रिकल के माध्यम से प्रवेश कर गई है और इसे थोड़ा वापस लेने की आवश्यकता है।

DiI परफ्यूजन की एक महत्वपूर्ण सीमा प्रक्रिया की टर्मिनल प्रकृति है, जो दोहराए गए माप की अनुमति नहीं देती है। क्योंकि खराब परफ्यूजन परिणाम अंतर्निहित धमनी अपर्याप्तता या तकनीकी त्रुटि को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, आंतरिक नियंत्रण के रूप में गैर-लिगेटेड हिंडलिंब की कटाई और इमेजिंग की सिफारिश की जाती है। इमेजिंग के संबंध में, लेजर प्रवेश के लिए इष्टतम ऊतक मोटाई संपीड़न के बाद ~ 1 मिमी है। नतीजतन, बड़े ऊतकों को स्लाइड पर माउंट करने और माइक्रोस्कोप चरण और आनुपातिक रूप से लंबे समय तक छवि अधिग्रहण समय पर समायोजित करने के लिए छोटे टुकड़ों में विभाजित करने की आवश्यकता होती है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल पीएडी और सीएलटीआई का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय प्रीक्लिनिकल मॉडल की रूपरेखा तैयार करता है। विशेष रूप से, एल-नाम के समवर्ती प्रशासन के साथ ऊरु धमनी और शिरा जमावट, एक एनओएस अवरोधक, मज़बूती से एफवीबी चूहों के फुटपैड में ऊतक हानि को प्रेरित करता है। पोस्टमार्टम, इंट्राकार्डियक डीआईआई परफ्यूजन का उपयोग तब वास्कुलचर को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए किया जाता है। Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ काटे गए पैरों के बाद के पूरे माउंट इमेजिंग उच्च संकल्प के लिए अनुमति देता है, फुटपैड वास्कुलचर के 3 डी पुनर्निर्माण और धमनी और केशिका नेटवर्क के विज़ुअलाइज़ेशन जो हिंडलिंब इस्केमिया मॉडल में reperfusion का आकलन करने के पारंपरिक साधनों को पूरा करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों [R01HL149452 और VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)] से Z-J L और OC V को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम मियामी परियोजना की माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा को भी धन्यवाद देते हैं ताकि मियामी स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय में उनकी छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर तक पहुंच प्रदान की जा सके।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binder clips (small) Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) VWR 10148-584
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Invitrogen D282
Electrocautery device Gemini Cautery System 5917
Ethanol (100%) VWR 89370-084
Fiji (ImageJ) software NIH Used version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy pads Fisher Scientific 22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%) VWR 89370-094
FVB mice Jackson Laboratory 001800
Glucose Sigma-Aldrich G7528
HCl (1 M) Sigma-Aldrich 13-1700
Imaris software Oxford Instruments Used version 9.6.0.
Isoflurane Pivetal NDC 46066-755-04
KCl Sigma-Aldrich P9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) Sigma-Aldrich N5751
Laser Doppler perfusion imager MoorLDI moorLDI2-HIR Used moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) VWR 48311-703
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NaOH Sigma-Aldrich S8263
Needles (27 G) BD 305109
Povidone-iodine swabstick (10%) Medline MDS093901ZZ
Surgical instruments Roboz Surgical Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable) DemeTECH G275017B0P
Syringes (10 mL) BD 305482
Three-way stopcocks Cole-Parmer 19406-49
Vascular Analysis Plugin Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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चिकित्सा मुद्दा 181 Hindlimb ischemia गैंग्रीन ऊरु धमनी बंधाव एल नाम DiI परफ्यूजन परिधीय धमनी रोग neovascularization एंजियोजेनेसिस
एक Murine Hindlimb Gangrene मॉडल में Footpad वास्कुलचर के उच्च संकल्प तीन आयामी इमेजिंग
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Ribieras, A. J., Ortiz, Y. Y.,… More

Ribieras, A. J., Ortiz, Y. Y., Shrestha, S., Huerta, C. T., Shao, H., Boulina, M. E., Vazquez-Padron, R. I., Liu, Z. J., Velazquez, O. C. High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model. J. Vis. Exp. (181), e63284, doi:10.3791/63284 (2022).

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