Summary
Detta protokoll beskriver en jämförande analys, med hjälp av mitokondriella komplexa aktiviteter CI + CIII och CII + CIII i närvaro eller frånvaro av Na +, för att studera förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler.
Abstract
Ubikinon (Q) pooler i det inre mitokondriella membranet (IMM) är delvis segmenterade till antingen komplexa I- eller FAD-beroende enzymer. Sådan indelning kan enkelt bedömas genom en jämförande analys med NADH eller succinat som elektrondonatorer i fruset tinade mitokondrier, där cytokrom c (cyt c) reduktion mäts. Analysen är beroende av effekten av Na+ på IMM, vilket minskar dess flytbarhet. Här presenterar vi ett protokoll för att mäta NADH-cyt c oxidoreduktasaktivitet och succinat-cyt c-oxidoreduktasaktiviteter i närvaro av NaCl eller KCl. Reaktionerna, som är beroende av blandningen av reagens i en kyvett stegvis, mäts spektrofotometriskt under 4 minuter i närvaro av Na+ eller K+. Samma blandning utförs parallellt i närvaro av de specifika enzymhämmare för att subtrahera den ospecifika förändringen i absorbans. NADH-cyt c oxidoreduktasaktivitet minskar inte i närvaro av någon av dessa katjoner. Succinat-cyt c-oxidoreduktasaktiviteten minskar emellertid i närvaro av NaCl. Detta enkla experiment belyser: 1) effekten av Na + för att minska IMM-fluiditet och Q-överföring; 2) att superkomplex I +III2 skyddar ubikinonöverföring (Q) från att påverkas av att sänka IMM-fluiditeten; 3) att Q-överföring mellan CI och CIII skiljer sig funktionellt från Q-överföring mellan CII och CIII. Dessa fakta stöder förekomsten av funktionellt differentierade Q-pooler i IMM och visar att de kan regleras av mitokondriernas föränderliga Na + - miljö.
Introduction
Mitokondriellt oxidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) är den huvudsakliga vägen som driver adenosintrifosfat (ATP) syntes, reaktiva syrearter (ROS) produktion och konsumtion av reducerande ekvivalenter, såsom nikotinamidadenindinukleotid (NADH) eller succinat, av mitokondrier. OXPHOS-systemet består av fem proteinkomplex: Komplex I (CI) oxiderar NADH och reducerar Q till ubiquinol (QH2). Komplex II (CII) oxiderar succinat till fumarat och reducerar Q till QH2. Komplex III (CIII) oxiderar QH2 tillbaka till Q, vilket minskar cytokrom c (cyt c). Slutligen oxiderar komplex IV (CIV) cyt c och reducerar syre till vatten. Denna oxidoreduktionskedja, den så kallade elektrontransportkedjan (mETC), är kopplad till pumpning av H + över IMM, vilket skapar en elektrokemisk gradient som används av komplex V (CV) för att fosforylera adenosindifosfat (ADP) till ATP.
mETC-komplex kan antingen vara ensamma i IMM eller monteras i kvartära strukturer som kallas superkomplex. CIV kan monteras med CIII och bilda III2 + IV eller Q-respirasom (eftersom den kan andas i närvaro av CoQH2) 1,2,3 eller bilda homodimerer eller homooligomerer4. CIII kan interagera med CI och bilda superkomplexet I+III25. Slutligen kan CI också interagera med Q-respirasomen och bygga I + III2 + IV eller N-respirasom (eftersom den kan respirera konsumerar NADH)1,6,7,8,9,10.
Q och cyt c är mobila elektronbärare som ansvarar för att överföra elektroner från CI / CII till CIII respektive från CIII till CIV. Huruvida superkomplex inför en funktionell lokal begränsning för dessa transportörer har varit en fråga om intensiv debatt under de senaste två decennierna 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flera oberoende grupper har dock visat att Q och cyt c funktionellt kan segmenteras i pooler i IMM. När det gäller Q kan den funktionellt segmenteras i en specifik Q-pool för CI (CoQNAD) och en annan pool dedikerad till FAD-beroende enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. För att differentiera förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler krävdes emellertid överuttrycket av det alternativa oxidaset (AOX) och genereringen av specifika mtDNA-mutanter, som kan montera CI i frånvaro av CIII, 1,19,20.
Mekanismen för produktion av reaktiva syrearter (ROS) under hypoxi var okänd tills nyligen. Vid akut hypoxi genomgår CI den aktiva / deaktiva (A / D) övergången, vilket innebär minskningen av dess H + pumpande NADH-CoQ-oxidoreduktasaktivitet. En sådan minskning av H + -pumpningen försurar mitokondriell matris och löser delvis upp kalciumfosfatutfällningarna i mitokondriell matris och frigör löslig Ca2+. Denna ökning av löslig Ca2+ aktiverar Na+/Ca2+ -växlaren (NCLX), som extruderar Ca2+ i utbyte mot Na+. Mitokondriell Na + -ökning interagerar med fosfolipider på insidan av IMM, vilket minskar dess fluiditet och Q-överföring mellan CII och CIII, vilket slutligen producerar superoxidanjon, en redoxsignal21. Intressant nog minskade Q-överföringen endast mellan CII och CIII, men inte mellan CI och CIII, vilket belyser att 1) Na + endast kunde modulera en av de befintliga Q-poolerna i mitokondrierna; 2) det finns funktionellt differentierade Q-pooler i IMM. Således kan ett allmänt använt protokoll för studier av mitokondriella enzymaktiviteter användas för att bedöma förekomsten av de nämnda Q-poolerna.
Det aktuella protokollet är baserat på mätningen av reduktionen av oxiderad cyt c, substratet av CIII, genom absorbans i närvaro av succinat (dvs CII-substrat) eller NADH (dvs CI-substrat). Samma prov är uppdelat i två, varav en kommer att behandlas med KCl och den andra med samma koncentration av NaCl. På detta sätt, med tanke på att Na + minskar IMM-fluiditeten, om Q fanns i en unik pool i IMM, skulle både CI + CIII och CII + CIII minska i närvaro av Na +. Men om Q fanns i delvis segmenterade funktionella Q-pooler skulle effekten av Na+ mestadels (eller endast) vara uppenbar på CII+CIII-aktiviteten, men inte på CI+CIII. Som nyligenpublicerats 21 påverkar Na+ endast Q-överföringen mellan CII och CIII (figur 1C,D), men inte mellan CI och CIII (figur 1A,B).
Detta protokoll, tillsammans med en mängd tekniker, har använts för att bekräfta förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler i IMM, en dedikerad till CI (dvs. QNAD) och en annan tillägnad FAD-länkade enzymer (dvs. Q FAD)1,3,7; en iakttagelse som, även om den fortsätter att debatteras22, har bekräftats oberoende av flera grupper 7,19. Således påverkar supermonteringen av CI till superkomplex den lokala rörligheten för Q, vilket underlättar dess användning av CIII inom superkomplexet 1,7,13,14,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt guiden för vård och användning av försöksdjur och godkändes av den institutionella etiska kommittén vid Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spanien, i enlighet med EU:s direktiv av den 22 september 2010 (2010/63/UE) och med det spanska kungliga dekretet av den 1 februari 2013 (53/2013). Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur som användes och deras lidande.
OBS: Denna jämförande analys för att studera segmenteringen av mitokondriella Q-pooler beskrivs enligt följande:
1. Kvantifiering av proteiner
- Frys och tina de isolerade mitokondrierna26 från en vild muslever tre gånger (dvs mitokondriella membran) före experiment för att göra organellerna permeabla för reaktionssubstraten.
- Kvantifiera proteinmängden i det isolerade mitokondriprovet med Bradford- eller Bicinchoninic acid (BCA) -metoder. När det gäller Bradford, tillsätt 2 μl prov till 1 ml 1x Bradford-reagens.
- Dela upp provet i fyra delprov på 20 μg vardera (nämligen: A, B, C, D; Figur 2A).
2. Mätning av CI+CIII-aktivitet
OBS: Denna del av protokollet använder proverna A och B för att mäta CI + CIII-aktivitet (figur 2B).
- Dela proverna A och B i två delprov på 10 μg vardera (nämligen A1, A2, B1 och B2). Blanda vart och ett av delproven i en 1 ml kyvett med 30 μl cyt c (10 mg/ml), 10 μl 100 mM malonat och tillsätt förvärmd C1/C2-buffert (tabell 1) vid 37 °C upp till 980 μl (979 μl för cuvetterna A2 och B2).
VARNING: Detta steg innebär användning av de giftiga reagenserna malonat och kaliumcyanid.
ANMÄRKNING: cyt c (10 mg/ml) måste beredas färskt genom att blanda 10 mg cyt c i 1 ml 10 mM K2HPO4-lösning , pH justerat till 7,2, och det måste bibehållas i is under hela experimentet. - Tillsätt 10 μl 1 M KCl i cuvetterna A1 och A2 och tillsätt 10 μl 1 M NaCl i cuvetterna B1 och B2.
- Tillsätt 1 μl 1 mM rotenon i kyvetten som innehåller delproven A2 och B2.
VARNING: Detta steg innebär användning av det giftiga reagensrotonet. - Strax före mätningen, tillsätt 10 μL NADH (10 mM) i alla cuvetter.
OBS: 10 μL tillsätts företrädesvis på kyvettens steg, så reaktionen börjar vid blandning. - Blanda kyvetten genom att försiktigt vända den tre gånger. Placera den i absorbanskuvettläsaren (UV/VISJASCO spektrofotometer).
- Klicka på Mät > Parametrar > Allmänt och ställ in mätparametrarna på Våglängd: 550 nm och Tid: 4 min avläsning; tryck på Acceptera och Start för att starta experimentet.
- I slutet av mätningen sparar du lutningen som består av den linjära ökningen av absorbansen genom att klicka på Arkiv och Spara som. Lutningen kan också samlas in manuellt.
3. Mätning av CII + CIII-aktivitet
OBS: Denna del av protokollet använder proverna C och D för att mäta CII + CIII-aktivitet (figur 2C).
- Dela proverna C och D i två delprov på 10 μg vardera (nämligen C1, C2, D1 och D2). Blanda vart och ett av delproven i en 1 ml kyvett med 30 μl cyt c (10 mg/ml), 1 μl 1 mM rotenon och tillsätt förvärmd C1/C2-buffert vid 37 °C upp till 980 μl (970 μl för kuvetter C2 och D2).
VARNING: Detta steg innebär användning av de giftiga reagenserna kaliumcyanid och rotenon.
ANMÄRKNING: cyt c (10 mg/ml) måste beredas färskt genom att blanda 10 mg cyt c i 1 ml 10 mM K2HPO4-lösning , pH justerat till 7,2, och det måste bibehållas i is under hela experimentet. - Tillsätt 10 μl 1 M KCl i cuvetterna C1 och C2 och tillsätt 10 μl 1 M NaCl i cuvetterna D1 och D2.
- Tillsätt 1 μl 1 mM antimycin A i kyvetten som innehåller delproven C2 och D2.
VARNING: Detta steg innebär användning av det giftiga reagenset antimycin A. - Strax före mätningen, tillsätt 10 μL succinat (1 M) i alla cuvetter.
OBS: 10 μL tillsätts företrädesvis på kyvettens steg, så reaktionen börjar vid blandning. - Blanda kyvetten försiktigt och vänd den tre gånger. Placera den i absorbanskuvettläsaren (UV/VIS-spektrofotometer).
- Klicka på Mät > Parametrar > Allmänt och ställ in mätparametrarna på Våglängd: 550 nm och Tid: 4 min avläsning; tryck på Acceptera och Start för att starta experimentet.
- I slutet av mätningen sparar du lutningen som består av den linjära ökningen av absorbansen genom att klicka på Arkiv och Spara som. Lutningen kan också samlas in manuellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska resultat från detta protokoll representeras nedan (figur 3). När reducerad cyt c-absorbans lokaliseras vid 550 nm måste alla hämningslösa delprov visa en ökning av absorbansen vid 550 nm. Inhiberade delprov visar idealiskt en platt linje eller något ökande lutning (figur 3). Sluttningar från inhiberade delprov ska subtraheras från hämningslösa delprov.
Proverna A och B, båda korrigerade genom sin korrespondenthämning och som representerar NADH:cyt c oxidoreduktasaktivitet, har en liknande lutning (figur 3A). Delproven C och D, båda korrigerade genom deras korrespondentinshämning och som representerar succinat:cyt c-oxidoreduktasaktivitet, är emellertid olika, eftersom aktiviteten hos delprov C är högre än aktiviteten hos delprov D (figur 3B). Observera att basal absorbans kan skilja sig något mellan proverna (figur 3A).
Dessa resultat (dvs. sluttningar som redan korrigerats av deras hämmare; Tabell 2) kan representeras genom att dividera mängden protein som används (0,01 mg) som a.u./min/mg protein. Från detta värde kan graden av cyt c-reduktion beräknas ytterligare med hjälp av Lamber-Beer-lagen21.
Viktigt är att dessa resultat kan variera beroende på flera faktorer: (i) Provernas ursprung. Med tanke på att olika vävnader och celltyper har en varierande sammansättning av OXPHOS-komplex och superkomplex kan absoluta värden och relativa förändringar variera mellan prover. (ii) Med tanke på att olika vävnader kan ha en varierande sammansättning av OXPHOS-komplex och superkomplex kan tillsats av fler frysta tinade mitokondrier (för att kompensera lägre absoluta värden för en viss vävnad) till reaktionsblandningen ha en sekundär effekt, vilket är att förhållandet mellan Na+ eller K+ per mg protein/fosfolipid i provet minskar. Därför bör försiktighet iakttas när man varierar antingen mängden mitokondrier eller den Na+/K+-koncentration som tillsätts provet. iii) Interexperimentell variation kan uppstå på grund av varaktighet och temperatur för frys-tö-cykler, kommersiella reagenssatser eller varierande lagringsbuffert av isolerade mitokondrier.
Figur 1: Na+ minskar specifikt elektronöverföringen mellan CII och CIII, men inte mellan CI och CIII. (B) Elektronöverföring mellan NADH och cyt c, som sker genom QNAD i superkomplexet I+III2, påverkas inte av intramitochondriell Na+. (C) Schematisk representation av elektronöverföringen mellan succinat och cyt c, som sker genomQ FAD i CII. (D) Elektronöverföring mellan NADH och cyt c, som sker genomQ FAD i superkomplexet I +III2, minskar med hög intramitochondriell Na+. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk representation av protokollet från indelningen av det ursprungliga provet till den kinetiska mätningen. (B) Schema över de successiva stegen av reagenstillsatser för CI +CIII-aktivitet i delprov A1 och B1. Den röda cirkeln representerar den plats där NADH helst bör läggas till. Observera att den enda skillnaden med delprov A2 och B2 är den extra tillsatsen av rotenon i den senare. C) Schema över de successiva stegen i reagenstillsatser för CII+CIII-aktivitet i delproven C1 och D1. Den röda cirkeln representerar den plats där succinat helst bör läggas till. Observera att den enda skillnaden med delprov C2 och D2 är den extra tillsatsen av antimycin A i den senare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekt av Na+ på cyt c-reduktion genom muslever mitokondriella membran vid NADH eller succinattillsats. (A) Representativa spår som visar effekten av Na+ på cyt c-reduktion genom muslever mitokondriella membran som oxiderar NADH. (B) Representativa spår som visar effekten av Na+ på cyt c-reduktion genom muslever mitokondriella membran som oxiderar succinat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förening | Koncentration |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 2,5 mg/ml |
Tabell 1: Sammansättning av C1/C2-buffert. Buffertkompositionen presenteras i molära koncentrationer.
| Förväntade priser | +KCl (medelvärde) | +KCl (SD) | +NaCl (medelvärde) | +NaCl (SD) | Mann-Whitney P-värde |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Individuella värden | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Individuella värden | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tabell 2: Förväntade ränteintervall. De förväntade värdena för varje aktivitet presenteras i godtyckliga enheter. Motsvarande statistiska test mellan +KCl och +NaCl presenteras också. "n" representerar antalet replikat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om detta protokoll representerar ett mycket enkelt förfarande för att identifiera förekomsten av de delvis segmenterade Q-poolerna, finns det några kritiska steg att ta hänsyn till. Substrat (dvs NADH eller succinat) tillsätts företrädesvis sist eftersom autooxidering av dessa föreningar kan förekomma. Kyvettes vändning måste vara försiktig för att undvika bildandet av bubblor som kan störa avläsningen.
Dessutom presenterar den nuvarande tekniken några begränsningar som är värda att nämna. Mätningar utförs inte i intakta mitokondrier. Således kan det artificiella innehållet och andelen av bufferten resultera i skillnader med mitokondriernas ursprungliga miljö.
Reagenser tillsätts i överskott, och de kanske inte representerar den verkliga tillgängligheten av substrat i intakta vävnader.
Nuvarande metoder innebär generering och användning av mycket specifika genetiska modeller och utrustning som inte är lätt tillgängliga i många laboratorier1. Detta protokoll ger en tillförlitlig och lätt att göra metod för att mäta förekomsten av de delvis differentierade Q-poolerna med hjälp av allmänt tillgängliga reagenser och verktyg. Således är det möjligt att det kan tillämpas i framtida studier som jämför genetiska modeller av mitokondriell sjukdom.
Rörligheten hos de mobila elektronbärarna i mETC är fortfarande ett mycket debatterat ämne25,27, även om förekomsten av delvis differentierade pooler blir accepterad 7,12,18,28,29. Nyligen har högupplöst respirometri och detaljerad biokemisk karakterisering av flera OXPHOS-mutanter som uttrycker AOX1, tillsammans med raffinerade kryoelektronmikroskopistudier som bevarar den naturliga lipidmiljön7, fört ljus in i diskussionen. Detta utgör tunga argument för förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler.
Dessutom har fysiologiska stimuli visat sig regleras av de olika Q-poolerna; i synnerhet det akuta hypoxiska svaret som drivs av intramitokondriell Na+. Högre Na+ nivåer i mitokondrier under hypoxi minskar elektronöverföringen mellan CII och CIII, frikopplar Q-cykeln vid nivån av CIII och producerar en superoxidanjon. Däremot minskade elektronöverföringen mellan CI och CIII inte21. Det nuvarande protokollet förklarar utförligt det förfarande genom vilket dessa resultat erhölls.
Ytterligare kontroller kan tillämpas på det aktuella protokollet om behandlingen som studeras utförs i cellule eller in vivo, som är de isolerade komplexa aktiviteterna för CI, CII och CIII, eftersom deras individuella mängder eller enskilda aktiviteter kan variera tillsammans med behandlingen. Efter ett mycket liknande förfarande som beskrivits ovan sågs inga skillnader i någon av dessa isolerade aktiviteter21 i närvaro eller frånvaro av Na+. Att notera har det beskrivits att Na + kan öka D / A-övergången30. Protokollet som användes vid denna observation involverade dock användningen av subtokondriella partiklar (SMP), medan vårt protokoll använder mitokondriella membran, vilket belyser behovet av membranpotential över IMM för den redovisade effekten30.
Det bör noteras att frys-tina cykler inte löser upp membranen som tvättmedel gör, så enstaka komplex och superkomplex är fortfarande fästa vid fosfolipid dubbelskikt. Detta framgår av det faktum att syreförbrukning av frysta tinade mitokondrier genom antingen CI eller CII kan mätas i närvaro av cytokrom c31. Dessutom, om det fanns en effekt av frys-tina cykler på CII + CIII-aktivitet, skulle det inte bara ses i "NaCl 10 mM" -prover utan också i "KCl 10 mM" -prover. Detta skulle göra antingen mätningen omöjlig (eftersom CII skulle separeras från CIII genom membrannedbrytning) eller sänkas till en punkt där skillnader mellan K+ och Na+ inte skulle ses. Som framgår av figur 2B är detta dock inte fallet. Tillägget av KCl i protokollet är utformat för att kassera möjliga effekter av antingen osmolaritet eller jonstyrka på de uppmätta aktiviteterna. Den slutliga osmolariteten i båda fallen, "10 mM KCl" -provet och "10 mM NaCl" -provet, är lika (116 mEq / L) och den enda skillnaden mellan proverna är närvaron av 10 mM K + eller 10 mM Na +. Icke desto mindre, om K + -katjoner från bufferten hade en effekt, skulle det manifesteras i både "KCl 10 mM" och "NaCl 10 mM" -prover, vilket gör en sådan effekt oskiljbar i något av proverna.
I de olika katjonernas förmåga att binda fosfolipider är det som verkligen är avgörande koordinationskemin och jonradien för varje katjon (som framhävs experimentellt i vårt ursprungliga papper21 och teoretiskt i Böckmann et al.32). Medan K+ visar ett genomsnittligt koordinationsnummer på sex, är det genomsnittliga koordinationsnumret Na+ fem, vilket resulterar i en annan koordinationskomplex geometri, vilket innebär mycket olika effekter av K+ och Na+ på ett fosfolipid dubbelskikt33.
Det bör också noteras att jonradien för K+ och Na+ är olika. Medan K + har en jonradie på 280 pm, har Na + en jonradie på 227 pm. Denna skillnad påverkar direkt deras interaktion med anjoner (eller zwitterioner), eftersom en lägre jonradie (dvs. mindre elektronskal) resulterar i en starkare interaktion med en negativt laddad molekyl eftersom den positiva jonkärnan är mer exponerad som om den hade extra elektronskal (dvs. högre jonradie). Faktum är att alla katjoner möjligen kan interagera med fosfolipider; emellertid, endast de med specifika kemisk-fysikaliska egenskaper kan ha specifika effekter på en fosfolipid dubbelskikt, såsom Na+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez och E. R. Martínez-Jimenez för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av MICIN: RTI2018-099357-B-I00 och HFSP (RGP0016/2018). CNIC stöds av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) och Pro CNIC Foundation och är ett Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Bild 2 skapad med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A.
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al.
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A.
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A.
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J.
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T.
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
