Summary
Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.
Abstract
Las piscinas de ubiquinona (CoQ) en la membrana mitocondrial interna (IMM) están parcialmente segmentadas en enzimas complejas I o dependientes de FAD. Dicha subdivisión puede evaluarse fácilmente mediante un ensayo comparativo utilizando NADH o succinato como donantes de electrones en mitocondrias congeladas-descongeladas, en las que se mide la reducción del citocromo c (cyt c). El ensayo se basa en el efecto de Na+ sobre el IMM, disminuyendo su fluidez. Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa y las actividades de la succinato-cyt c oxidorreductasa en presencia de NaCl o KCl. Las reacciones, que se basan en la mezcla de reactivos en una cubeta de manera escalonada, se miden espectrofotométricamente durante 4 min en presencia de Na+ o K+. La misma mezcla se realiza en paralelo en presencia de inhibidores enzimáticos específicos para restar el cambio inespecífico en la absorbancia. La actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa no disminuye en presencia de ninguno de estos cationes. Sin embargo, la actividad de la oxidorreductasa de succinato-cyt c disminuye en presencia de NaCl. Este sencillo experimento destaca: 1) el efecto del Na+ en la disminución de la fluidez de la IMM y la transferencia de CoQ; 2) que el supercomplejo I + III2 protege la transferencia de ubiquinona (CoQ) de verse afectada por la disminución de la fluidez de IMM; 3) que la transferencia de CoQ entre IC y CIII es funcionalmente diferente de la transferencia de CoQ entre CII y CIII. Estos hechos apoyan la existencia de grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM y muestran que pueden ser regulados por el entorno cambiante de Na + de las mitocondrias.
Introduction
El sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es la principal vía que impulsa la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP), la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consumo de equivalentes reductores, como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) o succinato, por parte de las mitocondrias. El sistema OXPHOS se compone de cinco complejos de proteínas: el Complejo I (CI) oxida el NADH y reduce la CoQ en ubiquinol (CoQH2). El Complejo II (CII) oxida el succinato en fumarato y reduce la CoQ en CoQH2. El Complejo III (CIII) oxida la CoQH2 de nuevo en CoQ, reduciendo el citocromo c (cyt c). Finalmente, el complejo IV (CIV) oxida el citt c y reduce el oxígeno al agua. Esta cadena de oxidorreducción, la llamada cadena de transporte de electrones (mETC), está acoplada al bombeo de H + a través de la IMM, lo que crea un gradiente electroquímico utilizado por el complejo V (CV) para fosforilar el difosfato de adenosina (ADP) en ATP.
Los complejos mETC pueden estar solos en el IMM o ensamblarse en estructuras cuaternarias llamadas supercomplejos. El CIV puede ensamblarse con CIII, formando el III2+IV o Q-respirasoma (ya que es capaz de respirar en presencia de CoQH2)1,2,3 o formando homodímeros u homooligomeros4. CIII puede interactuar con CI, formando el supercomplejo I+III25. Finalmente, CI también es capaz de interactuar con el Q-respirasoma, construyendo el I+III2+IV o N-respirasoma (ya que puede respirar consumiendo NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ y cyt c son portadores de electrones móviles encargados de transferir electrones de CI/CII a CIII, y de CIII a CIV, respectivamente. Si los supercomplejos imponen o no una restricción local funcional para estos portadores ha sido un tema de intenso debate a lo largo de las últimas dos décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, varios grupos independientes han demostrado que coQ y cyt c se pueden segmentar funcionalmente en grupos en el IMM. Con respecto a la CoQ, se puede segmentar funcionalmente en una agrupación específica de CoQ para IC (CoQNAD) y otra agrupación dedicada a enzimas dependientes de FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. Sin embargo, para diferenciar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados, se requirió la sobreexpresión de la oxidasa alternativa (AOX) y la generación de mutantes específicos de ADNmt, que pueden ensamblar IC en ausencia de CIII, 1,19,20.
El mecanismo de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la hipoxia era desconocido hasta hace poco. Ante la hipoxia aguda, IC sufre la transición activa/deactiva (A/D), que implica la disminución de su actividad de bombeo H+ NADH-CoQ oxidorreductasa. Tal disminución en el bombeo de H + acidifica la matriz mitocondrial y disuelve parcialmente los precipitados de calcio-fosfato en la matriz mitocondrial, liberando Ca2 + soluble. Este aumento de Ca2+ soluble activa el intercambiador Na+/Ca2+ (NCLX), que extruye Ca2+ a cambio de Na+. El aumento de Na+ mitocondrial interactúa con los fosfolípidos en el lado interno de la IMM, disminuyendo su fluidez y transferencia de CoQ entre CII y CIII, produciendo finalmente anión superóxido, una señal redox21. Curiosamente, la transferencia de CoQ solo disminuyó entre CII y CIII, pero no entre IC y CIII, destacando que 1) Na+ fue capaz de modular solo uno de los grupos de CoQ existentes en las mitocondrias; 2) existen grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM. Por lo tanto, se puede utilizar un protocolo ampliamente utilizado para el estudio de las actividades enzimáticas mitocondriales para evaluar la existencia de las piscinas de CoQ mencionadas.
El protocolo actual se basa en la medición de la reducción de la cit c oxidada, el sustrato de CIII, por absorbancia en presencia de succinato (es decir, sustrato CII) o NADH (es decir, sustrato CI). La misma muestra se divide en dos, una de las cuales será tratada con KCl, y la otra con la misma concentración de NaCl. De esta manera, dado que el Na+ disminuye la fluidez de la IMM, si la CoQ existiera en un pool único en la IMM, tanto la CI+CIII como la CII+CIII disminuirían en presencia de Na+. Sin embargo, si la CoQ existiera en grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados, el efecto de Na+ sería mayormente (o sólo) evidente en la actividad de CII+CIII, pero no en la CI+CIII. Como se publicó recientemente21, na+ solo afecta la transferencia de CoQ entre CII y CIII (Figura 1C,D), pero no entre IC y CIII (Figura 1A,B).
Este protocolo, junto con una panoplia de técnicas, se ha utilizado para confirmar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados en el IMM, uno dedicado a CI (es decir, CoQNAD) y otro dedicado a enzimas ligadas a FAD (es decir, CoQFAD)1,3,7; una observación que, aunque se sigue debatiendo22, ha sido corroborada de forma independiente por varios grupos 7,19. Así, el superasamblaje de IC en supercomplejos impacta en la movilidad local de CoQ, facilitando su uso por el CIII dentro del supercomplejo 1,7,13,14,23,24,25.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética institucional del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), España, de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea de 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y con el Real Decreto español de 1 de febrero de 2013 (53/2013). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.
NOTA: Este ensayo comparativo para estudiar la segmentación de las piscinas de CoQ mitocondrial se describe de la siguiente manera:
1. Cuantificación de proteínas
- Congelar y descongelar las mitocondrias aisladas26 de un hígado de ratón de tipo salvaje tres veces (es decir, membranas mitocondriales) antes de la experimentación para hacer que los orgánulos sean permeables a los sustratos de reacción.
- Cuantificar la cantidad de proteína de la muestra de mitocondrias aisladas mediante métodos de Bradford o ácido bicinconinico (BCA). En el caso de Bradford, agregue 2 μL de muestra en 1 ml de 1x reactivo de Bradford.
- Divida la muestra en cuatro submuestras de 20 μg cada una (a saber: A, B, C, D; Figura 2A).
2. Medición de la actividad DE CI+CIII
NOTA: Esta parte del protocolo utiliza muestras A y B para medir la actividad de CI+CIII (Figura 2B).
- Divida las muestras A y B en dos submuestras de 10 μg cada una (a saber, A1, A2, B1 y B2). Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de 1 ml con 30 μL de citt c (10 mg/ml), 10 μL de malonato de 100 ml y agregue tampón C1/C2 precalentado (Tabla 1) a 37 °C hasta 980 μL (979 μL para cubetas A2 y B2).
PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso de los reactivos tóxicos malonato y cianuro de potasio.
NOTA: cyt c (10 mg/mL) debe prepararse fresco mezclando 10 mg de cyt c en 1 mL de solución de 10 mM K2HPO4 , pH ajustado a 7.2, y debe mantenerse en hielo durante todo el experimento. - Añadir 10 μL de 1 M KCl en las cubetas A1 y A2, y añadir 10 μL de 1 M NaCl en las cubetas B1 y B2.
- Añadir 1 μL de rotenona de 1 mM en la cubeta que contiene las submuestras A2 y B2.
PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso del reactivo tóxico rotenona. - Justo antes de la medición, agregue 10 μL de NADH (10 mM) en todas las cubetas.
NOTA: Los 10 μL se agregan preferiblemente en el paso de la cubeta, por lo que la reacción comienza al mezclar. - Mezcle la cubeta volteándola cuidadosamente tres veces. Colóquelo en el lector de cubetas de absorbancia (espectrofotómetro UV/VISJASCO).
- Haga clic en Medir > parámetros > General y establezca los parámetros de medición en Longitud de onda: 550 nm y Tiempo: 4 minutos de lectura; pulse los botones Aceptar e Inicio para comenzar el experimento.
- Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como. La pendiente también se puede recoger manualmente.
3. Medición de la actividad CII+CIII
NOTA: Esta parte del protocolo utiliza muestras C y D para medir la actividad de CII+CIII (Figura 2C).
- Divida las muestras C y D en dos submuestras de 10 μg cada una (a saber, C1, C2, D1 y D2). Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de 1 ml con 30 μL de citt c (10 mg/ml), 1 μL de rotenona de 1 mM y agregue tampón C1/C2 precalentado a 37 °C hasta 980 μL (970 μL para cubetas C2 y D2).
PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso de los reactivos tóxicos cianuro de potasio y rotenona.
NOTA: cyt c (10 mg/mL) debe prepararse fresco mezclando 10 mg de cyt c en 1 mL de solución de 10 mM K2HPO4 , pH ajustado a 7.2, y debe mantenerse en hielo durante todo el experimento. - Añadir 10 μL de 1 M KCl en las cubetas C1 y C2, y añadir 10 μL de 1 M NaCl en las cubetas D1 y D2.
- Añadir 1 μL de 1 mM de antimicina A en la cubeta que contiene las submuestras C2 y D2.
PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso del reactivo tóxico antimicina A. - Justo antes de la medición, agregue 10 μL de succinato (1 M) en todas las cubetas.
NOTA: Los 10 μL se agregan preferiblemente en el paso de la cubeta, por lo que la reacción comienza al mezclar. - Mezcle la cubeta con cuidado, volteándola tres veces. Colóquelo en el lector de cubetas de absorbancia (espectrofotómetro UV/VIS).
- Haga clic en Medir > parámetros > General y establezca los parámetros de medición en Longitud de onda: 550 nm y Tiempo: 4 min de lectura; pulse los botones Aceptar e Inicio para comenzar el experimento.
- Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como. La pendiente también se puede recoger manualmente.
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Representative Results
Los resultados típicos de este protocolo se representan a continuación (Figura 3). Como la absorbancia reducida de cyt c se localiza en 550 nm, todas las submuestras desinhibidas deben mostrar un aumento en la absorbancia a 550 nm. Las submuestras inhibidas muestran idealmente una pendiente de línea plana o ligeramente creciente (Figura 3). Las pendientes de las submuestras inhibidas deben restarse de las submuestras desinhibidas.
Las muestras A y B, ambas corregidas por su correspondiente inhibición y que representan la actividad de la OXidorreductasa NADH:cyt c, tienen una pendiente similar (Figura 3A). Sin embargo, las submuestras C y D, ambas corregidas por su correspondiente inhibición y que representan la actividad de la oxidorreductasa de succinato:cyt c, son diferentes, en el sentido de que la actividad de la submuestra C es mayor que la actividad de la submuestra D (Figura 3B). Tenga en cuenta que la absorbancia basal puede ser ligeramente diferente entre las muestras (Figura 3A).
Estos resultados (es decir, pendientes ya corregidas por su inhibidor; Tabla 2) se puede representar dividiendo la cantidad de proteína utilizada (0,01 mg) como a.u./min/mg de proteína. A partir de este valor, la tasa de reducción de cyt c se puede calcular aún más utilizando la ley lamber-beer21.
Es importante destacar que estos resultados pueden variar según varios factores: (i) Origen de las muestras. Dado que los diferentes tejidos y tipos de células tienen una composición variable de complejos y supercomplejos OXPHOS, los valores absolutos y los cambios relativos pueden variar entre las muestras. (ii) Dado que diferentes tejidos pueden tener una composición variable de complejos OXPHOS y supercomplejos, agregar más mitocondrias congeladas-descongeladas (para compensar valores absolutos más bajos de un determinado tejido) a la mezcla de reacción puede tener un efecto secundario, que es que la proporción de Na+ o K+ por mg de proteína/fosfolípido en la muestra disminuya. Por lo tanto, se debe tener precaución al variar la cantidad de mitocondrias o la concentración de Na +/ K + agregada a la muestra. (iii) La variación interexperimental puede surgir de la duración y la temperatura de los ciclos de congelación-descongelación, los reactivos del lote comercial o el almacenamiento variable de las mitocondrias aisladas.
Figura 1: Na+ disminuye específicamente la transferencia de electrones entre CII y CIII, pero no entre CI y CIII. (A) Representación esquemática de la transferencia de electrones entre NADH y cyt c, que ocurre a través del CoQNAD en el supercomplejo I + III2. (B) La transferencia de electrones entre NADH y cyt c, que ocurre a través del CoQNAD en el supercomplejo I + III2, no se ve afectada por El Na + intramitocondrial. (C) Representación esquemática de la transferencia de electrones entre el succinato y el cyt c, que ocurre a través delCOQ FAD en CII. (D) La transferencia de electrones entre NADH y cyt c, que ocurre a través delCOQ FAD en el supercomplejo I + III2, disminuye por Na + intramitocondrial alto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática del protocolo desde la subdivisión de la muestra original hasta la medición cinética. (A) Representación esquemática de la división submuestra, destacando el mismo origen de todas las submuestras. (B) Esquema de las etapas sucesivas de las adiciones de reactivos para la actividad CI+CIII en las submuestras A1 y B1. El círculo rojo representa la ubicación donde idealmente se debe agregar NADH. Tenga en cuenta que la única diferencia con las submuestras A2 y B2 es la adición adicional de rotenona en esta última. (C) Esquema de las sucesivas etapas de las adiciones de reactivos para la actividad CII+CIII en las submuestras C1 y D1. El círculo rojo representa la ubicación donde idealmente se debe agregar succinato. Tenga en cuenta que la única diferencia con las submuestras C2 y D2 es la adición adicional de antimicina A en esta última. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efecto de Na+ en la reducción de cyt c por las membranas mitocondriales hepáticas del ratón sobre NADH o adición de succinato. (A) Trazas representativas que muestran el efecto del Na+ sobre la reducción de cyt c por las membranas mitocondriales hepáticas del ratón que oxidan el NADH. (B) Trazas representativas que muestran el efecto del Na+ sobre la reducción de cyt c por las membranas mitocondriales del hígado de ratón oxidando el succinato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Compuesto | Concentración |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | 2,5 mg/ml |
Tabla 1: Composición del tampón C1/C2. La composición del tampón se presenta en concentraciones molares.
| Tasas previstas | +KCl (Media) | +KCl (SD) | +NaCl (Media) | +NaCl (SD) | Valor de Mann-Whitney P |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Valores individuales | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| IC + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Valores individuales | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Cuadro 2: Rangos de tasas esperadas. Los valores esperados para cada actividad se presentan en unidades arbitrarias. También se presenta la prueba estadística correspondiente entre +KCl y +NaCl. "n" representa el número de réplicas.
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Discussion
Aunque este protocolo representa un procedimiento muy sencillo para identificar la existencia de los grupos de CoQ parcialmente segmentados, hay algunos pasos críticos a tener en cuenta. Los sustratos (es decir, NADH o succinato) se agregan preferiblemente en último lugar, ya que puede ocurrir la autooxidación de estos compuestos. El volteo de cuvette debe ser cuidadoso para evitar la formación de burbujas que puedan interferir con la lectura.
Además, la presente técnica presenta algunas limitaciones que vale la pena mencionar. Las mediciones no se realizan en mitocondrias intactas. Por lo tanto, el contenido artificial y la proporción del tampón pueden resultar en diferencias con el entorno nativo de las mitocondrias.
Los reactivos se agregan en exceso, y es posible que no representen la verdadera disponibilidad de sustratos en los tejidos intactos.
Los métodos actuales implican la generación y el uso de modelos y equipos genéticos muy específicos que no están fácilmente disponibles en muchos laboratorios1. Este protocolo proporciona un método fiable y fácil de hacer para medir la existencia de los grupos de CoQ parcialmente diferenciados utilizando reactivos y herramientas ampliamente disponibles. Por lo tanto, es posible que se pueda aplicar en futuros estudios comparando modelos genéticos de enfermedad mitocondrial.
La movilidad de los portadores de electrones móviles en el mETC sigue siendo un tema muy debatido25,27, aunque se está aceptando la existencia de grupos parcialmente diferenciados 7,12,18,28,29. Recientemente, la respirometría de alta resolución y la caracterización bioquímica detallada de varios mutantes OXPHOS que expresan AOX1, junto con estudios de microscopía crioelectrónica refinada que preservan el entorno lipídico natural7, han sacado a la luz la discusión. Esto plantea fuertes argumentos a favor de la existencia de grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados.
Además, se ha demostrado que los estímulos fisiológicos están regulados por las diferentes piscinas de CoQ; en particular, la respuesta hipóxica aguda impulsada por Na+ intramitocondrial. Los niveles más altos de Na+ en las mitocondrias durante la hipoxia disminuyen la transferencia de electrones entre CII y CIII, desacoplando el ciclo Q a nivel de CIII y produciendo un anión superóxido. Por el contrario, la transferencia de electrones entre IC y CIII no disminuyó21. El protocolo actual explica ampliamente el procedimiento mediante el cual se obtuvieron estos resultados.
Se pueden aplicar controles adicionales al protocolo actual si el tratamiento en estudio se realiza en celulácula o in vivo, que son las actividades complejas aisladas de IC, CII y CIII, ya que sus cantidades individuales o actividades individuales pueden variar junto con el tratamiento. Siguiendo un procedimiento muy similar al descrito anteriormente, no se observaron diferencias en ninguna de estas actividades aisladas21 en presencia o ausencia de Na+. A tener en cuenta, se ha descrito que Na+ puede aumentar la transición D/A30. Sin embargo, el protocolo utilizado en esta observación implicó el uso de partículas submitocondriales (SMP), mientras que nuestro protocolo utiliza membranas mitocondriales, destacando la necesidad de potencial de membrana a través de la IMM para el efecto contabilizado30.
Cabe señalar que los ciclos de congelación-descongelación no disuelven las membranas como lo hacen los detergentes, por lo que los complejos individuales y los supercomplejos todavía están unidos a las bicapas de fosfolípidos. Esto se evidencia por el hecho de que el consumo de oxígeno de las mitocondrias congeladas-descongeladas a través de IC o CII se puede medir en presencia del citocromo c31. Además, si hubiera un efecto de los ciclos de congelación-descongelación sobre la actividad ciI+CIII, no solo se vería en muestras de "NaCl 10 mM", sino también en muestras de "KCl 10 mM". Esto haría imposible la medición (ya que ciI se separaría de CIII a través de la descomposición de la membrana) o más baja a un punto en el que no se verían diferencias entre K + y Na + . Sin embargo, como se ve en la Figura 2B, este no es el caso. La adición de KCl en el protocolo está diseñada para descartar posibles efectos de la osmolaridad o la fuerza iónica en las actividades medidas. La osmolaridad final en ambos casos, muestra "10 mM KCl" y muestra "10 mM NaCl", es igual (116 mEq/L) y la única diferencia entre muestras es la presencia de 10 mM K+ o 10 mM Na+. No obstante, si los cationes K+ del búfer tuvieran un efecto, se manifestaría en muestras de "KCl 10 mM" y "NaCl 10 mM", lo que haría que tal efecto fuera imperceptible en cualquiera de las muestras.
En la capacidad de los diferentes cationes para unirse a los fosfolípidos, lo que es realmente crucial es la química de coordinación y el radio iónico de cada catión (como se destacó experimentalmente en nuestro artículo original21, y teóricamente en Böckmann et al.32). Mientras que K+ muestra un número de coordinación promedio de seis, el número de coordinación promedio de Na+ es cinco, lo que resulta en una geometría compleja de coordinación diferente, lo que se traduce en efectos muy diferentes de K+ y Na+ en una bicapa de fosfolípidos33.
También debe tenerse en cuenta que el radio iónico de K + y Na + son diferentes. Mientras que K+ tiene un radio iónico de 280 pm, Na+ tiene un radio iónico de 227 pm. Esta diferencia impacta directamente en su interacción con los aniones (o zwitterions), ya que un radio iónico más bajo (es decir, menos capas de electrones) resulta en una interacción más fuerte con una molécula cargada negativamente ya que el núcleo iónico positivo está más expuesto como si tuviera capas de electrones adicionales (es decir, un radio iónico más alto). De hecho, todos los cationes son posiblemente capaces de interactuar con los fosfolípidos; sin embargo, solo aquellos con propiedades químico-físicas específicas pueden tener efectos específicos sobre una bicapa de fosfolípidos, como el Na+.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernández, A., al Dr. C. Jiménez y al E. R. Martínez-Jiménez por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por MICIN: RTI2018-099357-B-I00 y HFSP (RGP0016/2018). El CNIC cuenta con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 creada con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
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