التسليم بوساطة الكهربية للبروتينات الريبونوكليوكرية Cas9 والحمض النووي الريبي المرسال إلى خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة حديثا
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنيات عزل خلايا الكبد الأولية للفئران عن الكبد وتحويل CRISPR-Cas9 كهربائيا كبروتينات ريبية و mRNA لتعطيل جين مستهدف علاجي مرتبط بمرض استقلابي وراثي في الكبد. تؤدي الطرق الموصوفة إلى قابلية عالية للاستمرار ومستويات عالية من تعديل الجينات بعد العزل الكهربائي.
Abstract
يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لعزل خلايا كبد الفئران الأولية متبوعة بتوصيل كريسبر-كاس9 بوساطة الكهربية كبروتينات ريبية نووية (RNPs) و mRNA. تم عزل خلايا الكبد الأولية للفئران باستخدام طريقة تروية رجعية من ثلاث خطوات مما أدى إلى غلات عالية تصل إلى 50 × 106 خلايا لكل كبد وبقاء الخلية بنسبة >85٪. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لطلاء خلايا الكبد وتلوينها وزراعتها. تشير النتائج إلى أن الكهربية توفر كفاءة نقل عالية تبلغ 89٪ ، كما تقاس بنسبة الخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) وقابلية الخلايا المتواضعة >35٪ في خلايا كبد الفئران.
ولإثبات فائدة هذا النهج، تم تحويل كريسبر-كاس9 الذي يستهدف جين هيدروكسي فينيل بيروفات ثنائي الأكسجيناز إلى خلايا كبد أولية للفئران كدليل على المبدأ لتحرير الجينات لتعطيل جين علاجي مرتبط بمرض استقلابي وراثي (IMD) في الكبد. لوحظ تحرير أعلى على الهدف بنسبة 78٪ ل RNPs مقارنة بكفاءة تحرير 47٪ مع mRNA. تم تقييم وظائف خلايا الكبد في المختبر باستخدام فحص الألبومين الذي أشار إلى أن تقديم CRISPR-Cas9 كRNPs و mRNA يؤدي إلى بقاء خلية مماثلة في خلايا الكبد الأولية للماوس. تطبيق واعد لهذا البروتوكول هو توليد نماذج الفئران للأمراض الوراثية البشرية التي تؤثر على الكبد.
Introduction
IMDs من الكبد هي اضطرابات وراثية تتميز بنقص إنزيم كبدي حاسم يشارك في عملية التمثيل الغذائي التي تؤدي إلى تراكم الأيضات السامة. بدون علاج ، تؤدي IMDs للكبد إلى فشل الأعضاء أو الوفاة المبكرة 1,2. الخيار العلاجي الوحيد للمرضى الذين يعانون من IMDs من الكبد هو زرع الكبد التقويمي ، وهو محدود بسبب انخفاض توافر الأعضاء المانحة والمضاعفات الناجمة عن العلاج المثبط للمناعة بعد الإجراء 3,4. وفقا للبيانات الأخيرة التي جمعتها شبكة شراء الأعضاء وزرعها ، فإن 40٪ -46٪ فقط من المرضى البالغين على قائمة انتظار زراعة الكبد يتلقون عضوا ، بينما يموت 12.3٪ من هؤلاء المرضى أثناء وجودهم في قائمة الانتظار5. علاوة على ذلك ، فإن 5٪ فقط من جميع أمراض الكبد النادرة لديها علاج معتمد من إدارة الأغذية والعقاقير6. من الواضح أن هناك حاجة ماسة لعلاجات جديدة ل IMDs في الكبد. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى نماذج المرض المناسبة لتطوير خيارات علاجية جديدة.
لا تزال نمذجة الأمراض البشرية باستخدام أنظمة المختبر وفي الجسم الحي عقبة أمام تطوير علاجات فعالة ودراسة أمراض IMDs في الكبد. خلايا الكبد من المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد النادرة هي تحديا للحصول على7. النماذج الحيوانية ضرورية لتطوير فهم لأمراض الأمراض واختبار الاستراتيجيات العلاجية. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات هي توليد نماذج من الأجنة التي تحمل طفرات قاتلة. على سبيل المثال، أدت محاولات إنشاء نماذج فأر من متلازمة ألاجيل (ALGS) مع أجنة تحتوي على حذف متماثل الزيجوت لتسلسل 5 كيلوبايت بالقرب من نهاية 5 لجين Jag1 إلى الموت المبكر للأجنة8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون توليد نماذج الفئران عن طريق تحرير الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية كثيف الوقت والموارد9. أخيرا ، ستظهر طفرات خارج الأنسجة المستهدفة ، مما يؤدي إلى متغيرات مربكة قد تعيق دراسة المرض9. سيسمح تحرير الجينات الجسدية بتحرير أسهل في أنسجة الكبد ويتجاوز التحديات المرتبطة بتوليد النماذج باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية.
تمكن الكهربية من توصيل كريسبر-كاس9 مباشرة إلى النواة من خلال تطبيق تيارات عالية الجهد لتخلل غشاء الخلية وهي متوافقة مع العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك تلك التي تتعنت على تقنيات النقل ، مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات ، والخلايا العصبية 10،11،12 . ومع ذلك ، فإن انخفاض الجدوى هو عيب محتمل للكهربية ؛ يمكن أن يؤدي تحسين الإجراء إلى مستويات عالية من التسليم مع الحد من السمية13. أظهرت دراسة حديثة جدوى تحويل مكونات CRISPR-Cas9 بالكهرباء إلى خلايا كبد بشرية وماوس أولية كنهج عالي الكفاءة14. الكهربية خارج الجسم الحي في خلايا الكبد لديها القدرة على تطبيقها لتوليد نماذج جديدة للفئران ل IMDs البشرية من الكبد.
يوفر هذا البروتوكول إجراء مفصلا خطوة بخطوة لعزل خلايا كبد الفئران عن الكبد ومن ثم إلكتروبورات CRISPR-Cas9 كمجمعات RNP ، تتكون من بروتين Cas9 والحمض النووي الريبي الاصطناعي أحادي التوجيه (sgRNA) ، أو Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع sgRNA للحصول على مستويات عالية من تحرير الجينات على الهدف. بالإضافة إلى ذلك، يوفر البروتوكول طرقا لقياس كفاءة تحرير الجينات وقابليتها للتطبيق ووظائفها بعد إلكتروبورات كريسبر-كاس9 في خلايا كبد الفئران المعزولة حديثا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الموضحة في بروتوكول عزل خلايا الكبد صعبة وتتطلب ممارسة للكفاءة. هناك العديد من الخطوات الرئيسية لعزل خلايا الكبد بنجاح عن الكبد. أولا ، يعد التعليب السليم للوريد الأجوف السفلي ضروريا لتروية الكبد الكاملة. يشير عدم وجود ابيضاض في الكبد بعد التروية إلى إزاحة القسطرة (الجدول 1</str…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقت RNC تمويلا من مركز الهندسة الحيوية في ساوث كارولينا لتجديد وتشكيل الأنسجة منحة تجريبية مدعومة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، والجمعية الأمريكية لدراسة مؤسسة أمراض الكبد ، والجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي تحت أرقام المنح P30 GM131959 ، 2021000920 ، 2022000099 ، على التوالي. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أو الجمعية الأمريكية لدراسة أمراض الكبد المؤسسة. تم إنشاء مخطط الشكل 1 مع BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
- Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
- Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
- Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
- Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
- . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
- Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
- Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
- Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
- . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
- Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).
