אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 ו-mRNA לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים מהכבד ואלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים ו-mRNA כדי לשבש גן מטרה טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית של הכבד. השיטות המתוארות מביאות לכדאיות גבוהה ולרמות גבוהות של שינוי גנים לאחר אלקטרופורציה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים ולאחר מכן אספקה בתיווך אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים (RNPs) ו-mRNA בתיווך אלקטרופורציה. הפטוציטים ראשוניים של עכברים בודדו בשיטת זלוף מדרדרת בת שלושה שלבים וכתוצאה מכך הופקו תשואות גבוהות של עד 50 × 106 תאים לכל כבד וכדאיות התאים של >85%. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לציפוי, צביעה וגידול הפטוציטים. התוצאות מצביעות על כך שאלקטרופורציה מספקת יעילות טרנספקציה גבוהה של 89%, כפי שנמדדה על ידי אחוז התאים החיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) והכדאיות התאית הצנועה של >35% בהפטוציטים של עכברים.
כדי להדגים את התועלת של גישה זו, CRISPR-Cas9 המכוון לגן הידרוקסיפנילפירובט דיאוקסיגנאז התחשמל לתוך הפטוציטים ראשוניים של עכברים כעריכה גנטית הוכחה עקרונית כדי לשבש גן טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית (IMD) של הכבד. עריכה גבוהה יותר על המטרה של 78% נצפתה עבור RNPs לעומת 47% יעילות עריכה עם mRNA. הפונקציונליות של הפטוציטים הוערכה במבחנה באמצעות בדיקת אלבומין שהצביעה על כך שאספקת CRISPR-Cas9 כ-RNPs ו-mRNA גורמת לכדאיות דומה של תאים בהפטוציטים ראשוניים של עכברים. יישום מבטיח לפרוטוקול זה הוא יצירת מודלים של עכברים למחלות גנטיות אנושיות המשפיעות על הכבד.
Introduction
IMDs של הכבד הם הפרעות גנטיות המאופיינות על ידי מחסור של אנזים כבד חיוני המעורב בחילוף החומרים שמוביל להצטברות של מטבוליטים רעילים. ללא טיפול, IMDs של הכבד לגרום לאי ספיקת איברים או מוות בטרם עת 1,2. אפשרות הריפוי היחידה לחולים עם IMDs של הכבד היא השתלת כבד אורתוטופית, המוגבלת בשל הזמינות הנמוכה של איברים תורמים וסיבוכים מטיפול מדכא חיסון בעקבות ההליך 3,4. על פי נתונים שנאספו לאחרונה על ידי הרשת לרכש והשתלת איברים, רק 40%-46% מהחולים הבוגרים ברשימת ההמתנה להשתלת כבד מקבלים איבר, בעוד 12.3% מהחולים הללו מתים בזמן שהם ברשימת ההמתנה5. יתר על כן, רק 5% מכלל מחלות הכבד הנדירות יש טיפול שאושר על ידי ה- FDA6. ברור כי יש צורך קריטי בטיפולים חדשניים עבור IMDs של הכבד. עם זאת, נדרשים מודלים מתאימים למחלה כדי לפתח אפשרויות טיפוליות חדשות.
מידול מחלות אנושיות באמצעות מערכות in vitro ו – in vivo נותר מכשול לפיתוח טיפולים יעילים ולחקר הפתולוגיה של IMDs של הכבד. הפטוציטים מחולים עם מחלות כבד נדירות מאתגרים להשיג7. מודלים של בעלי חיים חיוניים לפיתוח הבנה של פתולוגיה של מחלות ולבדיקת אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, מכשול אחד הוא יצירת מודלים מעוברים הנושאים מוטציות קטלניות. לדוגמה, ניסיונות ליצור מודלים עכבריים של תסמונת אלג’יל (ALGS) עם עוברים המכילים מחיקות הומוזיגוטיות של רצף של 5 קילובייט ליד 5′-הקצה של הגן Jag1 הביאו למוות מוקדם של העוברים8. בנוסף, יצירת מודלים של עכברים על ידי עריכת גנים בתאי גזע עובריים יכולה להיות עתירת זמן ומשאבים9. לבסוף, מוטציות יופיעו מחוץ לרקמה הממוקדת, מה שיוביל למשתנים מבלבלים שעלולים לעכב את המחקר של המחלה9. עריכת גנים סומטיים תאפשר עריכה קלה יותר ברקמת הכבד ותעקוף את האתגרים הכרוכים ביצירת מודלים באמצעות תאי גזע עובריים.
אלקטרופורציה מאפשרת העברה של CRISPR-Cas9 ישירות לתוך הגרעין על ידי הפעלת זרמי מתח גבוה כדי לחדור לקרום התא ותואמת לסוגי תאים רבים, כולל אלה שאינם מתאימים לטכניקות טרנספקציה, כגון תאי גזע עובריים אנושיים, תאי גזע פלוריפוטנטיים ותאי עצב 10,11,12 . עם זאת, כדאיות נמוכה היא חיסרון פוטנציאלי של אלקטרופורציה; אופטימיזציה של ההליך יכולה להניב רמות גבוהות של מסירה תוך הגבלת רעילות13. מחקר שנערך לאחרונה מדגים את ההיתכנות של אלקטרופורציה של רכיבי CRISPR-Cas9 לעכברים ראשוניים ולהפטוציטים אנושיים כגישה יעילה ביותר14. אלקטרופורציה של Ex vivo בהפטוציטים יש פוטנציאל להיות מיושם כדי ליצור מודלים חדשים של עכברים עבור IMDs אנושיים של הכבד.
פרוטוקול זה מספק הליך מפורט שלב אחר שלב לבידוד הפטוציטים של עכברים מהכבד ולאחר מכן אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כקומפלקסי RNP, המורכבים מחלבון Cas9 ו-RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA), או Cas9 mRNA בשילוב עם sgRNA כדי להשיג רמות גבוהות של עריכת גנים על המטרה. בנוסף, הפרוטוקול מספק שיטות לכימות היעילות, הכדאיות והפונקציונליות של עריכת גנים בעקבות אלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 להפטוציטים של עכברים שזה עתה בודדו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים המתוארים בפרוטוקול לבידוד הפטוציטים הם מאתגרים ודורשים תרגול לצורך מיומנות. ישנם מספר שלבים מרכזיים לבידוד מוצלח של הפטוציטים מהכבד. ראשית, שימור תקין של הווריד הנבוב התחתון קאווה חיוני לזלוף מלא בכבד. היעדר ההדבקה בכבד לאחר הזלוף מצביע על תזוזה של הצנתר (טבלה 1). הווריד הנ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC קיבלה מימון ממרכז הביו-הנדסה של דרום קרוליינה להתחדשות ויצירת רקמות מענק פיילוט הנתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) של המכונים הלאומיים לבריאות, האגודה האמריקאית לחקר מחלות כבד הקרן, והחברה האמריקאית לטיפול בגנים ותאים תחת מספרי מענק P30 GM131959, 2021000920, 2022000099, בהתאמה. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של האגודה האמריקאית לתרפיה גנטית ותא או האגודה האמריקאית לחקר הקרן לחקר מחלות כבד. הסכימה עבור איור 1 נוצרה עם BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
- Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
- Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
- Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
- Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
- . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
- Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
- Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
- Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
- . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
- Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).
