Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados
Summary
Este protocolo describe técnicas para aislar hepatocitos primarios de ratón del hígado y electroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas y ARNm para interrumpir un gen diana terapéutico asociado con una enfermedad metabólica hereditaria del hígado. Los métodos descritos dan como resultado una alta viabilidad y altos niveles de modificación genética después de la electroporación.
Abstract
Este protocolo describe un método rápido y eficaz para aislar los hepatocitos primarios de ratón seguido de la administración mediada por electroporación de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) y ARNm. Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron utilizando un método de perfusión retrógrada de tres pasos, lo que resultó en altos rendimientos de hasta 50 × 106 células por hígado y una viabilidad celular de >85%. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para el recubrimiento, tinción y cultivo de hepatocitos. Los resultados indican que la electroporación proporciona una alta eficiencia de transfección del 89%, medida por el porcentaje de células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) y una viabilidad celular modesta de >35% en hepatocitos de ratón.
Para demostrar la utilidad de este enfoque, CRISPR-Cas9 dirigido al gen hidroxifenilpiruvato dioxigenasa se electroporó en hepatocitos primarios de ratón como prueba de principio de edición de genes para interrumpir un gen terapéutico relacionado con una enfermedad metabólica hereditaria (IMD) del hígado. Se observó una mayor edición en el objetivo del 78% para los RNP en comparación con la eficiencia de edición del 47% con ARNm. La funcionalidad de los hepatocitos se evaluó in vitro mediante un ensayo de albúmina que indicó que la administración de CRISPR-Cas9 como RNPs y ARNm da como resultado una viabilidad celular comparable en hepatocitos primarios de ratón. Una aplicación prometedora para este protocolo es la generación de modelos de ratón para enfermedades genéticas humanas que afectan al hígado.
Introduction
Los IMD del hígado son trastornos genéticos caracterizados por la deficiencia de una enzima hepática crucial involucrada en el metabolismo que conduce a la acumulación de metabolitos tóxicos. Sin tratamiento, las IMD del hígado resultan en insuficiencia orgánica o muerte prematura 1,2. La única opción curativa para los pacientes con IMD del hígado es el trasplante hepático ortotópico, que es limitado debido a la baja disponibilidad de órganos de donantes y las complicaciones de la terapia inmunosupresora después del procedimiento 3,4. Según datos recientes recopilados por la Red de Procuración y Trasplante de Órganos, solo el 40%-46% de los pacientes adultos en la lista de espera de trasplante hepático reciben un órgano, mientras que el 12,3% de estos pacientes mueren mientras están en la lista de espera5. Además, solo el 5% de todas las enfermedades hepáticas raras tienen un tratamiento aprobado por la FDA6. Está claro que existe una necesidad crítica de nuevos tratamientos para los IMD del hígado. Sin embargo, se requieren modelos de enfermedad apropiados para desarrollar nuevas opciones terapéuticas.
El modelado de enfermedades humanas utilizando sistemas in vitro e in vivo sigue siendo un obstáculo para desarrollar terapias efectivas y estudiar la patología de los IMD del hígado. Los hepatocitos de pacientes con enfermedades hepáticas raras son difíciles de obtener7. Los modelos animales son cruciales para desarrollar una comprensión de la patología de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Sin embargo, un obstáculo es la generación de modelos a partir de embriones portadores de mutaciones letales. Por ejemplo, los intentos de crear modelos de ratón del síndrome de Alagille (ALGS) con embriones que contienen deleciones homocigotas de una secuencia de 5 kb cerca del extremo 5′ del gen Jag1 resultaron en la muerte prematura de los embriones8. Además, la generación de modelos de ratón mediante edición de genes en células madre embrionarias puede requerir mucho tiempo y recursos9. Por último, aparecerán mutaciones fuera del tejido diana, dando lugar a variables de confusión que pueden impedir el estudio de la enfermedad9. La edición de genes somáticos permitiría una edición más fácil en el tejido hepático y evitaría los desafíos asociados con la generación de modelos utilizando células madre embrionarias.
La electroporación permite la entrega de CRISPR-Cas9 directamente en el núcleo mediante la aplicación de corrientes de alto voltaje para permeabilizar la membrana celular y es compatible con muchos tipos de células, incluidas aquellas que son intransigentes a las técnicas de transfección, como las células madre embrionarias humanas, las células madre pluripotentes y las neuronas 10,11,12 . Sin embargo, la baja viabilidad es un inconveniente potencial de la electroporación; la optimización del procedimiento puede producir altos niveles de administración al tiempo que limita la toxicidad13. Un estudio reciente demuestra la viabilidad de electroporar componentes CRISPR-Cas9 en hepatocitos primarios de ratón y humanos como un enfoque altamente eficiente14. La electroporación ex vivo en hepatocitos tiene el potencial de ser aplicada para generar nuevos modelos de ratón para IMD humanos del hígado.
Este protocolo proporciona un procedimiento detallado paso a paso para aislar hepatocitos de ratón del hígado y, posteriormente, electroporar CRISPR-Cas9 como complejos RNP, que consisten en proteína Cas9 y ARN sintético de guía única (sgRNA), o ARNm Cas9 combinado con sgRNA para obtener altos niveles de edición de genes en el objetivo. Además, el protocolo proporciona métodos para cuantificar la eficiencia, viabilidad y funcionalidad de la edición de genes después de la electroporación de CRISPR-Cas9 en hepatocitos de ratón recién aislados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos descritos en el protocolo para el aislamiento de hepatocitos son desafiantes y requieren práctica para la competencia. Hay varios pasos clave para el aislamiento exitoso de hepatocitos del hígado. En primer lugar, la canulación adecuada de la vena cava inferior es esencial para la perfusión hepática completa. La ausencia de blanqueamiento en el hígado después de la perfusión indica desplazamiento del catéter (Tabla 1). La vena cava inferior (perfusión retrógrada) fue canulada en el p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC recibió fondos del Centro de Bioingeniería de Carolina del Sur de Regeneración y Formación de Tejidos Subvención Piloto apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) de los Institutos Nacionales de Salud, la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas y la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular bajo los números de subvención P30 GM131959, 2021000920, y 2022000099, respectivamente. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular o la Fundación de la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas. El esquema de la Figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
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