Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados
Summary
Este protocolo descreve técnicas para isolar hepatócitos primários do fígado e eletroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas e mRNA para interromper um gene alvo terapêutico associado a uma doença metabólica herdada do fígado. Os métodos descritos resultam em alta viabilidade e altos níveis de modificação genética após a eletroporação.
Abstract
Este protocolo descreve um método rápido e eficaz para isolar hepatócitos primários do rato seguido pela entrega mediada por eletroporação de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) e mRNA. Os hepatócitos primários do camundongo foram isolados usando um método de perfusão retrógrada de três etapas, resultando em altos rendimentos de até 50 × 106 células por fígado e viabilidade celular de >85%. Este protocolo fornece instruções detalhadas para chapeamento, coloração e hepatócitos. Os resultados indicam que a eletroporação proporciona uma alta eficiência de transfecção de 89%, medida pela porcentagem de células positivas de proteína fluorescente verde (GFP) e viabilidade celular modesta de >35% em hepatócitos de camundongos.
Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, o CRISPR-Cas9 direcionado ao gene de dioxygenase hidroxifenyfenyruvate foi eletroporado em hepatócitos primários como prova de princípio de edição de genes para interromper um gene terapêutico relacionado a uma doença metabólica herdada (IMD) do fígado. Observou-se maior escíctil de 78% para RNPs em comparação com 47% de eficiência de edição com mRNA. A funcionalidade dos hepatócitos foi avaliada in vitro usando um ensaio de albumina que indicava que a entrega de CRISPR-Cas9 como RNPs e mRNA resulta em viabilidade celular comparável em hepatócitos de camundongos primários. Uma aplicação promissora para este protocolo é a geração de modelos de camundongos para doenças genéticas humanas que afetam o fígado.
Introduction
IMDs do fígado são distúrbios genéticos caracterizados pela deficiência de uma enzima hepática crucial envolvida no metabolismo que leva ao acúmulo de metabólitos tóxicos. Sem tratamento, as IMDs do fígado resultam em falência de órgãos ou morte prematura 1,2. A única opção curativa para pacientes com IMDs do fígado é o transplante hepático ortotópico, que é limitado devido à baixa disponibilidade de órgãos doadores e complicações da terapia imunossupressor após o procedimento 3,4. De acordo com dados recentes coletados pela Rede de Captação e Transplante de Órgãos, apenas 40%-46% dos pacientes adultos na lista de espera por transplante de fígado recebem um órgão, enquanto 12,3% desses pacientes morrem enquanto estão na listade espera 5. Além disso, apenas 5% de todas as doenças raras do fígado têm um tratamento aprovado pela FDA6. É claro que há uma necessidade crítica de novos tratamentos para IMDs do fígado. No entanto, modelos adequados de doenças são necessários para desenvolver novas opções terapêuticas.
Modelar doenças humanas usando sistemas in vitro e in vivo continua sendo um obstáculo para o desenvolvimento de terapias eficazes e o estudo da patologia dos DDM do fígado. Hepatócitos de pacientes com doenças hepáticas raras são desafiadores para obter7. Modelos animais são cruciais para o desenvolvimento da compreensão da patologia da doença e para testar estratégias terapêuticas. No entanto, um obstáculo é a geração de modelos a partir de embriões portadores de mutações letais. Por exemplo, tentativas de criar modelos de camundongos da Síndrome de Alagille (ALGS) com embriões contendo exclusões homozigosas de uma sequência de 5 kb perto do final de 5′do gene Jag1 resultaram na morte precoce dos embriões8. Além disso, gerar modelos de mouse por edição de genes em células-tronco embrionárias pode ser otempo e o recurso intensivo 9. Por fim, mutações aparecerão fora do tecido alvo, levando a variáveis de confusão que podem impedir o estudo da doença9. A edição de genes somáticos permitiria uma edição mais fácil no tecido hepático e contornaria os desafios associados à geração de modelos usando células-tronco embrionárias.
A eletroporação permite a entrega do CRISPR-Cas9 diretamente no núcleo, aplicando correntes de alta tensão para permeabiliizar a membrana celular e é compatível com muitos tipos de células, incluindo aquelas que são intransigentes às técnicas de transfecção, como células-tronco embrionárias humanas, células-tronco pluripotentes e neurônios 10,11,12 . No entanto, a baixa viabilidade é uma potencial desvantagem da eletroporação; otimizar o procedimento pode produzir altos níveis de entrega ao mesmo tempo em que limita a toxicidade13. Um estudo recente demonstra a viabilidade de eletroporar componentes CRISPR-Cas9 em hepatócitos primários e humanos como uma abordagem altamente eficiente14. A eletroporação ex vivo em hepatócitos tem potencial para ser aplicada para gerar novos modelos de camundongos para IMDs humanos do fígado.
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo detalhado para isolar hepatócitos de camundongos do fígado e, posteriormente, eletroporar CRISPR-Cas9 como complexos RNP, consistindo de proteína Cas9 e RNA de guia único sintético (sgRNA), ou Cas9 mRNA combinado com sgRNA para obter altos níveis de edição de genes no alvo. Além disso, o protocolo fornece métodos para quantificar a eficiência, a viabilidade e a funcionalidade de edição de genes após a eletroporação do CRISPR-Cas9 em hepatócitos de camundongos recém-isolados.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas descritas no protocolo para isolamento hepatócito são desafiadoras e exigem prática de proficiência. Existem vários passos-chave para o isolamento hepatócito bem sucedido do fígado. Em primeiro lugar, a canulação adequada da veia cava inferior é essencial para a perfusão hepática completa. A ausência de branqueamento no fígado após a perfusão indica deslocamento do cateter (Tabela 1). A veia cava inferior (perfusão retrógrada) foi cânulada no procedimento por ser mais simples…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A RNC recebeu financiamento do Centro de Bioengenharia da Carolina do Sul de Regeneração e Formação de Tecidos A bolsa piloto apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) dos Institutos Nacionais de Saúde, da Associação Americana para o Estudo das Doenças hepáticas e da Sociedade Americana de Terapia Genética & Celular sob os números de subvenção P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, respectivamente. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais da Sociedade Americana de Terapia Genética & Celular ou da Associação Americana para o Estudo das Doenças Hepáticas. O esquema para a Figura 1 foi criado com BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
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