Электропорация-опосредованная доставка рибонуклеопротеинов Cas9 и мРНК в свежеизолированные первичные гепатоциты мыши
Summary
Этот протокол описывает методы выделения первичных гепатоцитов мыши из печени и электропорации CRISPR-Cas9 в виде рибонуклеопротеинов и мРНК для нарушения терапевтического гена-мишени, связанного с наследственным метаболическим заболеванием печени. Описанные методы приводят к высокой жизнеспособности и высоким уровням генной модификации после электропорации.
Abstract
Этот протокол описывает быстрый и эффективный метод выделения первичных гепатоцитов мыши с последующей опосредованной электропорацией доставки CRISPR-Cas9 в виде рибонуклеопротеинов (RNP) и мРНК. Первичные мышиные гепатоциты были выделены с использованием трехступенчатого метода ретроградной перфузии, что привело к высоким выходам до 50 × 106 клеток на печень и жизнеспособности клеток >85%. Этот протокол содержит подробные инструкции по нанесению покрытий, окрашиванию и культивированию гепатоцитов. Результаты показывают, что электропорация обеспечивает высокую эффективность трансфекции в 89%, что измеряется процентом зеленых флуоресцентных белковых (GFP)-положительных клеток и умеренной жизнеспособностью клеток >35% в гепатоцитах мышей.
Чтобы продемонстрировать полезность этого подхода, CRISPR-Cas9, нацеленный на ген гидроксифенилпируватдиоксигеназы, был электропорирован в первичные гепатоциты мыши в качестве доказательства принципиального редактирования генов для нарушения терапевтического гена, связанного с наследственным метаболическим заболеванием (IMD) печени. Более высокое целевое редактирование на 78% наблюдалось для RNP по сравнению с 47% эффективностью редактирования с мРНК. Функциональность гепатоцитов оценивали in vitro с использованием альбуминового анализа, который показал, что доставка CRISPR-Cas9 в виде РНК и мРНК приводит к сопоставимой жизнеспособности клеток в первичных гепатоцитах мышей. Перспективным применением этого протокола является генерация мышиных моделей генетических заболеваний человека, влияющих на печень.
Introduction
ИМД печени – это генетические нарушения, характеризующиеся дефицитом важнейшего печеночного фермента, участвующего в метаболизме, что приводит к накоплению токсичных метаболитов. Без лечения ИМД печени приводят к органной недостаточности или преждевременной смерти 1,2. Единственным лечебным вариантом для пациентов с ИМД печени является ортотопическая трансплантация печени, которая ограничена из-за низкой доступности донорских органов и осложнений от иммуносупрессивной терапии после процедуры 3,4. Согласно последним данным, собранным Сетью закупок и трансплантации органов, только 40-46% взрослых пациентов в списке ожидания трансплантации печени получают орган, в то время как 12,3% этих пациентов умирают, находясь в листе ожидания5. Более того, только 5% всех редких заболеваний печени имеют одобренное FDA лечение6. Ясно, что существует критическая потребность в новых методах лечения ИМД печени. Тем не менее, для разработки новых терапевтических вариантов требуются соответствующие модели заболеваний.
Моделирование заболеваний человека с использованием систем in vitro и in vivo остается препятствием для разработки эффективных методов лечения и изучения патологии ИМД печени. Гепатоциты у пациентов с редкими заболеваниями печени трудно получить7. Животные модели имеют решающее значение для развития понимания патологии заболевания и для тестирования терапевтических стратегий. Однако одним из препятствий является создание моделей из эмбрионов, несущих смертельные мутации. Например, попытки создать мышиные модели синдрома Алагилле (ALGS) с эмбрионами, содержащими гомозиготные делеции последовательности 5 кб вблизи 5′-конца гена Jag1 , привели к ранней смерти эмбрионов8. Кроме того, генерация мышиных моделей путем редактирования генов в эмбриональных стволовых клетках может быть трудоемкой и ресурсоемкой9. Наконец, мутации будут появляться вне целевой ткани, что приведет к путанице переменных, которые могут препятствовать изучению заболевания9. Редактирование соматических генов позволит упростить редактирование в ткани печени и обойти проблемы, связанные с созданием моделей с использованием эмбриональных стволовых клеток.
Электропорация позволяет доставлять CRISPR-Cas9 непосредственно в ядро путем применения высоковольтных токов для пермеабилизации клеточной мембраны и совместима со многими типами клеток, включая те, которые непримиримы к методам трансфекции, таким как эмбриональные стволовые клетки человека, плюрипотентные стволовые клетки и нейроны 10,11,12 . Однако низкая жизнеспособность является потенциальным недостатком электропорации; оптимизация процедуры может привести к высоким уровням доставки при ограничении токсичности13. Недавнее исследование демонстрирует возможность электропорации компонентов CRISPR-Cas9 в первичные гепатоциты мыши и человека в качестве высокоэффективного подхода14. Электропорация ex vivo в гепатоцитах может быть применена для создания новых мышиных моделей для человеческих IMD печени.
Этот протокол обеспечивает подробную пошаговую процедуру выделения гепатоцитов мыши из печени и последующего электропорации CRISPR-Cas9 в виде комплексов RNP, состоящих из белка Cas9 и синтетической однонаправленной РНК (sgRNA) или мРНК Cas9 в сочетании с sgRNA для получения высоких уровней редактирования генов на мишени. Кроме того, протокол предоставляет методы количественной оценки эффективности, жизнеспособности и функциональности редактирования генов после электропорации CRISPR-Cas9 в свежеизолированные гепатоциты мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Шаги, изложенные в протоколе для выделения гепатоцитов, являются сложными и требуют практики для мастерства. Существует несколько ключевых шагов для успешного выделения гепатоцитов из печени. Во-первых, правильная канюляция нижней полой вены необходима для полной перфузии печени. Отс…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC получил финансирование от Центра биоинженерии Южной Каролины по регенерации и формированию тканей Пилотный грант, поддержанный Национальным институтом общих медицинских наук (NIGMS) Национальных институтов здравоохранения, Американской ассоциацией по изучению заболеваний печени и Американским обществом генной и клеточной терапии под номерами гранта P30 GM131959, 2021000920, и 2022000099, соответственно. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Американского общества генной и клеточной терапии или Американской ассоциации по изучению заболеваний печени. Схема для рисунка 1 была создана с помощью BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
- Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
- Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
- Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
- Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
- . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
- Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
- Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
- Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
- . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
- Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).
