Elektroporatie-gemedieerde toediening van Cas9 ribonucleoproteïnen en mRNA in vers geïsoleerde primaire muizenhepatocyten
Summary
Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van primaire muizenhepatocyten uit de lever en het elektropoderen van CRISPR-Cas9 als ribonucleoproteïnen en mRNA om een therapeutisch doelgen geassocieerd met een erfelijke stofwisselingsziekte van de lever te verstoren. De beschreven methoden resulteren in een hoge levensvatbaarheid en hoge niveaus van genmodificatie na elektroporatie.
Abstract
Dit protocol beschrijft een snelle en effectieve methode voor het isoleren van primaire muizenhepatocyten gevolgd door elektroporatie-gemedieerde toediening van CRISPR-Cas9 als ribonucleoproteïnen (RRP’s) en mRNA. Primaire muizenhepatocyten werden geïsoleerd met behulp van een driestaps retrograde perfusiemethode, wat resulteerde in hoge opbrengsten van maximaal 50 × 106 cellen per lever en de levensvatbaarheid van >85%. Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het plateren, kleuren en kweken van hepatocyten. De resultaten geven aan dat elektroporatie een hoge transfectie-efficiëntie van 89% biedt, zoals gemeten door het percentage groene fluorescerende eiwit (GFP) -positieve cellen en de bescheiden levensvatbaarheid van >35% in muizenhepatocyten.
Om het nut van deze aanpak aan te tonen, werd CRISPR-Cas9 gericht op het hydroxyfenylpyruvaatdioxygenase-gen geëlektropoeerd in primaire muizenhepatocyten als proof-of-principle genbewerking om een therapeutisch gen te verstoren dat verband houdt met een erfelijke stofwisselingsziekte (IMD) van de lever. Een hogere on-target bewerking van 78% werd waargenomen voor RRP’s in vergelijking met 47% bewerkingsefficiëntie met mRNA. De functionaliteit van hepatocyten werd in vitro geëvalueerd met behulp van een albuminetest die aangaf dat het leveren van CRISPR-Cas9 als RNP’s en mRNA resulteert in vergelijkbare cel levensvatbaarheid in primaire muizenhepatocyten. Een veelbelovende toepassing voor dit protocol is het genereren van muismodellen voor menselijke genetische ziekten die de lever aantasten.
Introduction
IMD’s van de lever zijn genetische aandoeningen die worden gekenmerkt door het tekort aan een cruciaal leverenzym dat betrokken is bij het metabolisme dat leidt tot de accumulatie van toxische metabolieten. Zonder behandeling leiden IMD’s van de lever tot orgaanfalen of vroegtijdig overlijden 1,2. De enige curatieve optie voor patiënten met IMD’s van de lever is orthotopische levertransplantatie, die beperkt is vanwege de lage beschikbaarheid van donororganen en complicaties van immunosuppressieve therapie na de procedure 3,4. Volgens recente gegevens verzameld door het Organ Procurement and Transplantation Network, krijgt slechts 40% -46% van de volwassen patiënten op de wachtlijst voor levertransplantatie een orgaan, terwijl 12,3% van deze patiënten sterft terwijl ze op de wachtlijststaan 5. Bovendien heeft slechts 5% van alle zeldzame leverziekten een door de FDA goedgekeurde behandeling6. Het is duidelijk dat er een kritieke behoefte is aan nieuwe behandelingen voor IMD’s van de lever. Er zijn echter geschikte ziektemodellen nodig om nieuwe therapeutische opties te ontwikkelen.
Het modelleren van menselijke ziekten met behulp van in vitro en in vivo systemen blijft een obstakel voor het ontwikkelen van effectieve therapieën en het bestuderen van de pathologie van IMD’s van de lever. Hepatocyten van patiënten met zeldzame leverziekten zijn een uitdaging om7 te verkrijgen. Diermodellen zijn cruciaal voor het ontwikkelen van een goed begrip van ziektepathologie en voor het testen van therapeutische strategieën. Een obstakel is echter het genereren van modellen uit embryo’s met dodelijke mutaties. Pogingen om muismodellen van het Alagillesyndroom (ALGS) te maken met embryo’s met homozygote deleties van een 5 kb-sequentie in de buurt van het 5-einde van het Jag1-gen resulteerden bijvoorbeeld in de vroege dood van de embryo’s8. Bovendien kan het genereren van muismodellen door genbewerking in embryonale stamcellen tijd- en middelenintensief zijn9. Ten slotte zullen mutaties buiten het beoogde weefsel verschijnen, wat leidt tot verstorende variabelen die de studie van de ziekte kunnen belemmeren9. Somatische genbewerking zou het gemakkelijker maken om leverweefsel te bewerken en omzeilt de uitdagingen die gepaard gaan met het genereren van modellen met behulp van embryonale stamcellen.
Elektroporatie maakt de afgifte van CRISPR-Cas9 rechtstreeks in de kern mogelijk door hoogspanningsstromen toe te passen om het celmembraan te doordringen en is compatibel met vele celtypen, waaronder die welke onverzettelijk zijn voor transfectietechnieken, zoals menselijke embryonale stamcellen, pluripotente stamcellen en neuronen 10,11,12 . Een lage levensvatbaarheid is echter een mogelijk nadeel van elektroporatie; het optimaliseren van de procedure kan hoge afgifteniveaus opleveren terwijl de toxiciteit wordt beperkt13. Een recente studie toont de haalbaarheid aan van het elektropoderen van CRISPR-Cas9-componenten in primaire muizen en menselijke hepatocyten als een zeer efficiënte aanpak14. Ex vivo elektroporatie in hepatocyten heeft het potentieel om te worden toegepast om nieuwe muismodellen te genereren voor menselijke IMD’s van de lever.
Dit protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze procedure voor het isoleren van muizenhepatocyten uit de lever en vervolgens het elektropoderen van CRISPR-Cas9 als RNP-complexen, bestaande uit Cas9-eiwit en synthetisch single-guide RNA (sgRNA), of Cas9-mRNA in combinatie met sgRNA om hoge niveaus van on-target genbewerking te verkrijgen. Daarnaast biedt het protocol methoden voor het kwantificeren van genbewerkingsefficiëntie, levensvatbaarheid en functionaliteit na elektroporatie van CRISPR-Cas9 in vers geïsoleerde muizenhepatocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De stappen die in het protocol voor hepatocytenisolatie worden beschreven, zijn uitdagend en vereisen oefening voor vaardigheid. Er zijn verschillende belangrijke stappen voor de succesvolle hepatocytenisolatie uit de lever. Ten eerste is een goede cannulatie van de inferieure vena cava essentieel voor volledige leverperfusie. De afwezigheid van blancheren in de lever na perfusie duidt op verplaatsing van de katheter (tabel 1). De inferieure vena cava (retrograde perfusie) werd in de procedure gecannulee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC ontving financiering van South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot grant ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) van de National Institutes of Health, de American Association for the Study of Liver Diseases Foundation en American Society of Gene &Cell Therapy onder subsidienummers P30 GM131959, 2021000920, respectievelijk 2022000099. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de American Society of Gene &Cell Therapy of de American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Het schema voor figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
- Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
- Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
- Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
- Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
- . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
- Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
- Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
- Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
- . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
- Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).
