新たに単離された初代マウス肝細胞へのCas9リボヌクレオタンパク質およびmRNAのエレクトロポレーション媒介送達
Summary
このプロトコルは、初代マウス肝細胞を肝臓から単離し、CRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質およびmRNAとしてエレクトロポレーションして、肝臓の遺伝性代謝疾患に関連する治療標的遺伝子を破壊する技術について記載している。記載された方法は、エレクトロポレーション後に高い生存率および高レベルの遺伝子改変をもたらす。
Abstract
このプロトコルは、初代マウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9をリボヌクレオタンパク質(RNP)およびmRNAとしてエレクトロポレーション媒介送達するための迅速かつ効果的な方法を記載している。初代マウス肝細胞を3段階逆行性灌流法を用いて単離し、肝臓あたり最大50×106 細胞の高収率および>85%の細胞生存率をもたらした。このプロトコルは、肝細胞のプレーティング、染色、および培養に関する詳細な手順を提供します。この結果は、エレクトロポレーションが緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞の割合およびマウス肝細胞における>35%の適度な細胞生存率によって測定されるように、89%の高いトランスフェクション効率を提供することを示している。
このアプローチの有用性を実証するために、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ遺伝子を標的とするCRISPR-Cas9を、肝臓の遺伝性代謝疾患(IMD)に関連する治療遺伝子を破壊するための原理実証遺伝子編集として初代マウス肝細胞にエレクトロポレーションした。mRNAによる47%の編集効率と比較して、RNPでは78%の高いオンターゲット編集が観察された。肝細胞の機能性を、RNPおよびmRNAとしてCRISPR-Cas9を送達することが初代マウス肝細胞において同等の細胞生存率をもたらすことを示したアルブミンアッセイを用いてイン ビトロ で評価した。このプロトコルの有望な用途は、肝臓に影響を及ぼすヒト遺伝性疾患のマウスモデルの生成である。
Introduction
肝臓のIMDは、毒性代謝産物の蓄積につながる代謝に関与する重要な肝酵素の欠乏を特徴とする遺伝性疾患である。治療がなければ、肝臓のIMDは臓器不全または早期死亡をもたらす1,2。肝臓のIMDを有する患者のための唯一の治癒的選択肢は、ドナー臓器の可用性が低いため、および手順3,4に続く免疫抑制療法による合併症のために制限されている同所性肝移植である。臓器調達移植ネットワークが収集した最近のデータによると、肝移植待機リストに載っている成人患者の40%〜46%のみが臓器を受けており、これらの患者の12.3%が待機リストで死亡しています5。さらに、すべてのまれな肝疾患のわずか5%がFDA承認の治療を受けています6。肝臓のIMDに対する新規治療が決定的に必要であることは明らかです。しかし、新しい治療選択肢を開発するには、適切な疾患モデルが必要です。
インビトロおよびインビボシステムを使用してヒト疾患をモデル化することは、効果的な治療法を開発し、肝臓のIMDの病理を研究するための障害であり続けている。まれな肝疾患を有する患者からの肝細胞は、7を得ることが困難である。動物モデルは、疾患病理学の理解を深め、治療戦略をテストするために不可欠です。しかし、1つの障害は、致命的な変異を持つ胚からモデルを生成することです。例えば、Jag1遺伝子の5’末端付近に5kb配列のホモ接合型欠失を含む胚を有するアラギル症候群(ALGS)のマウスモデルを作成しようとする試みは、胚の早期死をもたらした8。さらに、胚性幹細胞における遺伝子編集によるマウスモデルの生成は、時間とリソースを大量に消費する可能性がある9。最後に、突然変異は標的組織の外側に現れ、交絡変数をもたらし、疾患の研究を妨げる可能性がある9。体細胞遺伝子編集は、肝臓組織における編集を容易にし、胚性幹細胞を用いたモデル生成に関連する課題を迂回するであろう。
エレクトロポレーションは、高電圧電流を印加して細胞膜を透過させることにより、CRISPR-Cas9を核に直接送達することを可能にし、ヒト胚性幹細胞、多能性幹細胞、ニューロンなどのトランスフェクション技術に非妥協的なものを含む多くの細胞型と適合性である10,11,12.しかし、低い生存率はエレクトロポレーションの潜在的な欠点である。手順を最適化すると、毒性を制限しながら高レベルの送達をもたらすことができます13。最近の研究は、非常に効率的なアプローチとして、CRISPR-Cas9成分を初代マウスおよびヒト肝細胞にエレクトロポレーションすることの実現可能性を実証している14。肝細胞におけるエクスビボエレクトロポレーションは、肝臓のヒトIMDsのための新しいマウスモデルを生成するために適用される可能性を有する。
このプロトコルは、肝臓からマウス肝細胞を単離し、続いてCRISPR-Cas9を、Cas9タンパク質と合成シングルガイドRNA(sgRNA)、またはCas9 mRNAとsgRNAを組み合わせて高レベルのオンターゲット遺伝子編集を得るためのRNP複合体としてエレクトロポレーションするための詳細なステップバイステップ手順を提供します。さらに、このプロトコルは、新たに単離されたマウス肝細胞へのCRISPR-Cas9のエレクトロポレーション後の遺伝子編集効率、生存率、および機能性を定量する方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
肝細胞単離のためのプロトコルに概説されているステップは挑戦的であり、熟練のための練習を必要とする。肝臓からの肝細胞単離を成功させるためのいくつかの重要なステップがあります。まず、下大静脈の適切なカニューレレーションは、完全な肝臓灌流に不可欠です。灌流後の肝臓におけるブランチングの不在は、カテーテルの変位を示す(表1)。下大静脈(逆行性灌流)は、…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNCは、米国国立衛生研究所の国立一般医学研究所(NIGMS)、米国肝疾患研究協会財団、および米国遺伝子細胞療法学会の支援を受けて、サウスカロライナ州バイオエンジニアリングセンターから助成金番号P30 GM131959、2021000920、 と2022000099それぞれ。内容は著者の責任であり、必ずしも米国遺伝子細胞療法学会または米国肝疾患学会財団の公式見解を表すものではありません。図1の回路 図 は、BioRender.com で作成しました。
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Riferimenti
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