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Biology

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/63979
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Abstract

A resistência à insulina é um efeito reduzido da insulina sobre suas células-alvo, geralmente derivado da diminuição da sinalização dos receptores de insulina. A resistência à insulina contribui para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças derivadas da obesidade de alta prevalência em todo o mundo. Portanto, a compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência à insulina é de grande relevância. Vários modelos têm sido utilizados para estudar a resistência à insulina tanto in vivo quanto in vitro; Os adipócitos primários representam uma opção atraente para estudar os mecanismos de resistência à insulina e identificar moléculas que neutralizam essa condição e os alvos moleculares de drogas sensibilizadoras de insulina. Neste trabalho, estabelecemos um modelo de resistência insulínica utilizando adipócitos primários em cultura tratada com fator de necrose tumoral α (TNF-α).

As células precursoras de adipócitos (APCs), isoladas do tecido adiposo subcutâneo de camundongos digerido pela colagenase por tecnologia de separação magnética celular, são diferenciadas em adipócitos primários. A resistência à insulina é então induzida pelo tratamento com TNF-α, uma citocina pró-inflamatória que reduz a fosforilação/ativação da tirosina dos membros da cascata de sinalização da insulina. A diminuição da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato do receptor de insulina (IRS-1) e proteína quinase B (AKT) são quantificados por western blot. Este método fornece uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo.

Introduction

A insulina é um hormônio anabólico produzido pelas células β das ilhotas pancreáticas e o principal regulador do metabolismo da glicose e dos lipídios. Dentre suas diversas funções, a insulina regula a captação de glicose, a síntese de glicogênio, a gliconeogênese, a síntese proteica, a lipogênese e a lipólise1. O sinal molecular inicial após a interação da insulina com seu receptor (IR) é a ativação da atividade intrínseca da tirosina proteína quinase do IR2, resultando em sua autofosforilação3 e na subsequente ativação de uma família de proteínas conhecidas como substratos do receptor de insulina (IRS), que se liga a proteínas adaptadoras levando à ativação de uma cascata de proteínas quinases4 . A insulina ativa duas vias principais de sinalização: fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)-proteína quinase B (AKT) e proteína quinase ativada por mitógeno Ras (MAPK). O primeiro constitui um importante ponto de ramificação ou nó 4,5 para a ativação de numerosos efetores a jusante envolvidos em diversas funções fisiológicas, incluindo a regulação da homeostase do combustível, enquanto o segundo regula o crescimento e diferenciação celular 4,6. As ações da insulina dependem, em última instância, do tipo celular e do contexto fisiológico7.

Um dos principais tecidos metabólicos responsivos à insulina é o tecido adiposo. O tecido adiposo branco é o tipo de gordura mais abundante em humanos e roedores, distribuído na gordura subcutânea (entre a pele e os músculos) e na gordura visceral (ao redor dos órgãos da cavidade abdominal). Dado o seu grande volume, os adipócitos ou células adiposas são o tipo celular mais abundante no tecido adiposo. Essas células adiposas podem ser marrons/beges (termogênicas), róseas (na glândula mamária) ebrancas 8,9. Os adipócitos brancos mantêm as principais reservas energéticas do organismo na forma de triglicerídeos, um processo insulino-dependente. A insulina promove o transporte de glicose e a lipogênese, ao mesmo tempo em que inibe a lipólise ou a degradação lipídica 7,10. Também facilita a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos — as células maduras que armazenam gordura11.

A resistência à insulina ocorre quando um nível normal de insulina produz uma resposta biológica atenuada, resultando em hiperinsulinemia compensatória12. A resistência à insulina é uma condição associada ao sobrepeso e àobesidade5, que quando combinada leva ao diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças metabólicas13. A hiperinsulinemia compensa a resistência à insulina nos tecidos periféricos para manter os níveis glicêmicos normais14. No entanto, eventual perda ou exaustão de células β, juntamente com resistência insulínica exacerbada, leva a níveis elevados de glicose no sangue consistentes com DT25. Portanto, a resistência insulínica e a hiperinsulinemia podem contribuir para o desenvolvimento de doenças metabólicas derivadas da obesidade15. Além disso, a obesidade pode causar inflamação local crônica de baixo grau, promovendo resistência à insulina no tecido adiposo15,16,17. Além disso, alterações no tecido adiposo derivadas da obesidade, como fibrose, inflamação e redução da angiogênese e adipogênese, levam a níveis séricos mais baixos de adiponectina (um sensibilizador de insulina) e aumento da secreção de fatores como inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), ácidos graxos livres e exossomos na corrente sanguínea, exacerbando a resistência à insulina17.

Muitos aspectos subjacentes à resistência à insulina permanecem desconhecidos. Modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina nos principais tecidos-alvo, incluindo o tecido adiposo. A vantagem dos modelos in vitro é que os pesquisadores têm maior controle das condições ambientais e podem avaliar a resistência à insulina em tipos celulares específicos. Particularmente, as células precursoras de adipócitos (APCs) têm o fenótipo individual do tecido doador, o que pode refletir melhor a fisiologia do que as linhagens celulares de adipócitos. Um dos principais fatores indutores de resistência à insulina in vitro é o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória secretada por adipócitos e macrófagos no tecido adiposo18. Embora seja necessária para o adequado remodelamento e expansão do tecido adiposo19, a exposição prolongada ao TNF-α induz resistência à insulina no tecido adiposo in vivo e nos adipócitos in vitro20. O tratamento crônico com TNF-α de vários tipos celulares leva ao aumento da fosforilação da serina, tanto do IR quanto do IRS-1, promovendo assim a diminuição da fosforilação da tirosina21. O aumento da fosforilação da IRS-1 sobre resíduos de serina inibe a atividade da tirosina quinase IR e pode ser um dos principais mecanismos pelos quais o tratamento crônico do TNF-α prejudica a ação da insulina22,23. O TNF-α ativa vias envolvendo o inibidor de serina/treonina quinase do fator nuclear ĸB quinase β (IKKβ) e c-Jun N quinase terminal (JNK)24. JNK induz um complexo programa transcricional pró-inflamatório, mas também fosforila diretamente IRS-16.

A compreensão da patogênese da resistência à insulina tem se tornado cada vez mais importante para orientar o desenvolvimento de futuras terapias contra a DM2. As VPAs têm se mostrado um excelente modelo para o estudo da biologia das células adiposas, incluindo a sensibilidade e resistência à insulina, e para a identificação das propriedades intrínsecas dos adipócitos independente do ambiente sistêmico. As APCs podem ser facilmente obtidas de diferentes depósitos adiposos e, sob condições apropriadas, diferenciadas em adipócitos maduros. Com esse método, efeitos diretos sobre a resistência/sensibilidade à insulina podem ser avaliados em adipócitos.

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Protocol

Todos os experimentos com roedores foram aprovados pelo Comitê de Bioética do Instituto de Neurobiologia da UNAM, protocolo número 075.

1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongos

  1. Eutanásia de camundongos C57BL/6 machos de 8-10 semanas de idade (por exemplo, por inalação de CO2 e subsequente deslocamento cervical) (quatro animais por isolamento). Desinfetar os camundongos esfregando com etanol 70% e obter o tecido adiposo imediatamente após o sacrifício.
    NOTA: Após a eutanásia dos roedores, isolar o tecido adiposo imediatamente e realizar todas as etapas dentro de uma capela de fluxo laminar estéril. Os ratos são mantidos sob ciclos claro/escuro de 12 h com livre acesso a comida e água.
  2. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo inguinal de cada camundongo. Retirar apenas o tecido adiposo, evitando a remoção de músculo, pele ou qualquer outro tecido, e coletá-lo em um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de solução de colagenase tipo 1 (1,5 mg/mL) sobre gelo. Dissolver a colagenase tipo 1 no meio Modified Eagle Medium (DMEM) de alta glicose e albumina de soro bovino (BSA) de Dulbecco e filtrar através de filtros de seringa de 0,2 μm.
  3. Cortar o tecido adiposo em pequenos pedaços com tesoura cirúrgica estéril e digerir as amostras por incubação com solução de colagenase tipo 1 a 37 °C em agitador orbital (150 rpm) por 30 min (colocar o tubo contendo gordura e colagenase em posição horizontal para uma maior superfície de agitação). Verifique a digestão a cada 10 min para se certificar de que funciona (a degradação do tecido é visível) e para evitar a sobredigestão (ver Figura Suplementar S1).
  4. Filtrar com uma seringa de tela de 200 μm (previamente autoclavada) para eliminar o tecido não digerido com colagenase. Passe o filtro sobre a borda do tubo para drenar o maior número possível de células para a solução. Adicionar 15 ml de DMEM-1% BSA frio para interromper a digestão e centrifugar a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C.
  5. Aspirar a camada superior contendo adipócitos maduros e a maior parte da camada líquida; Evite tocar ou perturbar o pellet. Adicionar 20 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS)-2% de soro fetal bovino (SFB) e ressuspender o pellet. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  6. Retire o sobrenadante, aspirando primeiro a camada superior para eliminar os adipócitos e gordura remanescentes. Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão lisante cloreto de amônio potássio (ACK) (para lisar hemácias) e incubar em gelo por 5 min. Adicionar 10 mL de PBS-2% FBS, misturar e centrifugar a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de solução anti-Fc (purificada de rato anti-camundongo CD16/CD32 diluída em PBS-2% FBS [1:150]) para reduzir a ligação mediada pelo receptor Fc por anticorpos de interesse. Incubar no gelo por 5 min. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 5 mL que se encaixe nos racks pré-resfriados de um separador magnético de células e centrífuga a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  8. Elimine o sobrenadante, adicione 200 μL da mistura de CD31(PECAM-1) anticorpo monoclonal (390)-biotina (1:100) e CD45 anticorpo monoclonal (30-F11)-biotina (1:100), misture bem e incube no gelo por 15 min (prepare diluições de anticorpos em solução anti-Fc; ver Tabela 1). Adicionar 400 μL de PBS-2% FBS e centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
    OBS: CD31 e CD45 são marcadores de células endoteliais e hematopoiéticas, respectivamente.
  9. Aspirar o sobrenadante e incubar em 100 μL de microesferas anti-biotina (1:5) durante 15 minutos em gelo (preparar diluições de anticorpos em solução anti-Fc, ver Tabela 1). Adicionar 400 μL de PBS-2% FBS e centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 350 μL de PBS-2% FBS. Remova agregados celulares ou partículas grandes das suspensões unicelulares com um filtro de pré-separação (70 μm). Primeiro, ative o filtro com 100 μL de PBS-2% FBS, passe a suspensão celular através do filtro (colete em um tubo limpo) e, finalmente, lave o filtro com 100 μL de PBS-2% FBS.
  11. Realizar a separação magnética de células usando a estratégia de separação negativa com um separador magnético de células.
    1. Coloque a amostra na posição A do rack de frio (certifique-se de que o rack esteja pré-resfriado) e dois tubos vazios na posição B e C para recuperar as células não marcadas e marcadas, respectivamente.
    2. Coloque o tampão de lavagem e o tampão de lavagem nos frascos correspondentes antes de ligar o equipamento. Programar o equipamento para realizar a separação magnética das células com o protocolo DEPLETE .
      NOTA: Este protocolo é para depleção no modo padrão para a remoção de células com expressão normal de antígeno (neste caso, células marcadas com anti-CD31 e anti-CD45), se a recuperação for a prioridade mais alta.
    3. Na seção de separação , selecione o número de amostras a serem separadas e selecione o protocolo DEPLETE . Pressione Executar e inicie a separação. Ao final do programa, recuperar as células não marcadas e centrifugar a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  12. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de meio de cultura (Tabela 1).
  13. Semeando as APCs em um poço de uma placa de 12 poços previamente revestida com 2,5% de matriz de membrana basal (aproximadamente 50.000-75.000 células são obtidas). Adicionar 400 μL de 2,5% de matriz de membrana basal para cobrir toda a superfície de cada poço. Imediatamente após retirar o excesso de solução e deixar apenas uma pequena camada, deixe a placa secar (sem tampa) dentro da capela de fluxo laminar por pelo menos 1 h. Incubar a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2 . Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência.
  14. A 80% de confluência, remova completamente o meio e lave com 350 μL de PBS-2% FBS. Colher as células com 350 μL de tripsina-EDTA a 0,05% por 2 min a 37 °C. Adicionar 2 mL de meio de cultura e coletar as células em um novo tubo cônico de 50 mL e, em seguida, centrifugar a 400 × g por 5 min.
  15. Passagem das APCs para placas de 12 poços (10.000-20.000 células por poço) previamente revestidas com 2,5% de matriz de membrana basal. Incubar a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência.
    NOTA: APCs podem ser passados uma vez. Posteriormente, perdem a capacidade de proliferar e se diferenciar. Consulte o fluxo de trabalho para o processo de isolamento de APCs na Figura Suplementar S2.

2. Diferenciação dos adipócitos e indução da resistência à insulina

NOTA: Manter as células a 37 °C em CO2 a 5% e realizar etapas que envolvem troca de meio e tratamentos com TNF-α e insulina dentro de uma capa estéril.

  1. A 80% de confluência, inicia-se o processo de diferenciação; aspirar qualquer meio de crescimento e substituí-lo por 500 μL de meio de diferenciação (Tabela 1) contendo 3,3 nM de proteína morfogenética óssea (BMP4) em cada poço.
  2. Após 48 h, substituir o meio pelo meio de diferenciação (500 μL por poço) e pelo coquetel de diferenciação (Tabela 1).
  3. Retirar o meio 72 h depois e adicionar 100 nM de insulina em 500 μL de meio de diferenciação fresco.
    NOTA: As células começam a mostrar uma aparência redonda com pequenas gotículas lipídicas dentro.
  4. Aspirar qualquer meio de diferenciação e substituí-lo por 500 μL de SFB médio simples a 2% (Tabela 1) 48 h mais tarde. Induzir resistência à insulina com 4 ng/mL de TNF-α. Incluir poços de controle sem tratamento com TNF-α.
  5. Após 24 h de incubação, adicionar 4 ng/mL de TNF-α em SFB simples de 0% (Tabela 1). Manter poços de controle sem tratamento com TNF-α.
  6. Ativar a via de sinalização da insulina 24 h mais tarde adicionando insulina 100 nM e incubar por 15 min a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 . Retire o meio e lave com 500 μL de PBS. Incluir poços de controle sem tratamento com insulina.

3. Avaliação da via de sinalização da insulina por western blot

  1. Extração e quantificação de proteínas
    1. Lavar cada poço de células com 500 μL de PBS e manter no gelo para lisar as células em 50 μL de tampão RIPA (Tabela 1) contendo 1% de coquetel inibidor de protease adicionado imediatamente antes do isolamento da amostra. Raspar toda a superfície do poço com uma ponta e transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL (manter no gelo).
    2. Incubar durante 1 h a 4 °C num agitador rotativo, misturar por vórtice e centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C e recuperar o sobrenadante (manter no gelo).
    3. Determinar a concentração de proteínas utilizando o ensaio de Bradford (não diluir a amostra para quantificar).
    4. Tomar o volume necessário correspondente a 40-60 μg e desnaturar com tampão Laemmli 6x (Tabela 1) incubando a 97 °C por 15 min enquanto agita a 550 rpm. Congelar até usar.
  2. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS
    1. Realizar eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) com gel de poliacrilamida a 7,5% de 1,5 mm de espessura. Inserir o gel no tanque e encher com tampão de corrida (Tabela 1).
    2. Adicionar 3 μL de proteína padrão pré-configurada ao primeiro poço do gel e carregar cada amostra em poços subsequentes.
    3. Passe o gel a 80 V por aproximadamente 15 min para garantir que a amostra entre na matriz de gel concentrador de poliacrilamida. Depois disso, aumente a tensão para 90 V por 2,5 h ou até que o marcador de peso molecular de 37 kDa possa ser visto na borda inferior do gel.
    4. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose em uma câmara semi-seca por 35 min a 25 V. Antes, submergir o gel, a membrana e os filtros em tampão de transferência (Tabela 1) por alguns minutos.
  3. Mancha ocidental
    1. Após a transferência, lavar a membrana com solução salina tamponada Tris (TBS) contendo Tween 20 a 0,1% (TBS-T 0,1%) (Tabela 1) por 3 min com agitação a 30 rpm.
    2. Bloquear a membrana com solução de bloqueio (Tabela 1) a 4 °C durante 1 h em rotação constante.
    3. Cortar a membrana em três partes de acordo com o marcador de peso molecular para incubar durante a noite com diferentes anticorpos primários (diluídos em solução de bloqueio) a 4 °C em rotação constante: anticorpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda esperada em 180 kDa; Anticorpo do receptor fosfo-insulina β (Tyr1150/1151) (1:1.000), banda esperada em 95 kDa; Anticorpo fosfo-Akt (Ser473) (1:1.000), banda esperada em 60 kDa.
    4. Lavar as membranas 5x por 5 min cada com TBS-T 0,1%.
    5. Incubar as membranas com o anticorpo secundário acoplado à peroxidase correspondente (diluído em solução de bloqueio) durante 2 h à temperatura ambiente em rotação constante: peroxidase affiniPure burro anti-coelho IgG (H+L) (1:5.000).
    6. Lavar as membranas 5x por 5 min cada com TBS-T 0,1%.
    7. Detectar as proteínas usando o sistema de detecção por quimioluminescência. Prepare o substrato de acordo com as instruções do fabricante.
    8. Coloque a mancha em um saco plástico e adicione 200 μL de substrato quimioluminescente para cobrir completamente a membrana. Escorra o excesso de substrato e remova as bolhas de ar.
    9. Exponha cada blot por 30-60 s em um sistema de imagem de alto desempenho compatível com quimioluminescência.
    10. Retirar as membranas (passos 10-13 da seção western blot) para quebrar as interações anticorpo-antígeno e, assim, permitir que as membranas de nitrocelulose sejam re-blotted. Recupere as membranas e lave 3x por 5 min cada com TBS-T 1% a 50 rpm.
    11. Incubar por 7 min com 10 mL de NaOH 0,2 M a 50 rpm.
    12. Lave 3x por 5 min cada com água da torneira a 50 rpm.
    13. Lave por 10 min com TBS-T 1% a 50 rpm.
    14. Repita os passos 2-9 da seção do western blot para incubar a membrana com tubulina antibeta (55 kDa) como controle de carga usando diluição 1:1.000.
    15. Realizar análise densitométrica25 para cada proteína utilizando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

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Representative Results

Nos últimos anos, o aumento da prevalência de obesidade e DM2 tem motivado uma intensa busca pelos mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo. Com o protocolo aqui descrito, as VPAs podem ser diferenciadas em adipócitos maduros para avaliar a resistência e a sensibilidade à insulina. Uma vez que as VPAs atingem a confluência, são necessários 10 dias para completar sua diferenciação em adipócitos maduros e sua indução de resistência à insulina mediada pelo TNF-α (Figura 1).

As VPAs apresentam morfologia fibroblástica, caracterizada por sua forma plana e alongada e sua adesão à placa completada 48 h após a semeadura (Figura 2A). As APCs levam de 2 a 5 dias para atingir 80% de confluência (dependendo do número de células semeadas), momento em que o processo de diferenciação é iniciado pela exposição ao coquetel diferenciador (Figura 2A). Os adipócitos maduros começam a aparecer nos 6-8 dias seguintes. Os adipócitos diferenciados são caracterizados por uma morfologia arredondada e acúmulo intracelular de gotículas lipídicas. Até 80% das células são diferenciadas ao final do processo de diferenciação (Figura 2B).

A resistência à insulina é induzida nos adipócitos primários pelo tratamento com TNF-α (4 ng/mL) por 48 h; essa concentração de TNF-α não altera a viabilidade celular (Figura Suplementar S3). Posteriormente, a via de sinalização da insulina é ativada pela adição de insulina 100 nM por 15 min, e a fosforilação das principais moléculas sinalizadoras (IR, IRS-1 e AKT) é medida por western blot. A insulina estimula a fosforilação dessas três moléculas (Figura 3) em relação aos adipócitos diferenciados controle, não tratados. O TNF-α reduz a fosforilação induzida por insulina da RI (30%), IRS-1 (20%) e AKT (45%) (Figura 3). As células resistentes à insulina apresentam menor ativação da via de sinalização da insulina em comparação com as células sensíveis à insulina. Além disso, o tratamento com TNF-α diminui a expressão de RNAm de marcadores conhecidos de sensibilidade à insulina: Insr, Irs2, Glut4 e Adipoq (Figura Suplementar S4). Esses achados confirmam que o TNF-α reduz a ação da insulina nos adipócitos primários e, assim, induz resistência à insulina.

Figure 1
Figura 1: Linha do tempo esquemática representando o processo de diferenciação das células precursoras dos adipócitos e a indução da resistência à insulina. As APCs são isoladas do tecido adiposo subcutâneo usando tratamento com colagenase e tecnologia de separação magnética de células. Em seguida, passam por um processo de diferenciação de 7 dias para obtenção de adipócitos primários. Posteriormente, a resistência à insulina é induzida com TNF-α por 48 h, as primeiras 24 h em meio contendo SFB a 2% e as 24 h seguintes com meio livre de soro para impedir a ativação da via de sinalização da insulina. A cascata de sinalização é ativada com insulina e a proteína é extraída para análise de western blot 10 dias após o início do processo de diferenciação para avaliar a fosforilação/ativação de IR, IRS-1 e AKT. Abreviações: APCs = células precursoras de adipócitos; BMP4 = Proteína morfogenética óssea; IBMX = 3-isobutil-1-metilxantina; TNF-α = fator de necrose tumoral-α; SFB = soro fetal bovino; RI = receptor de insulina; IRS = substrato do receptor de insulina; AKT = proteína quinase B; Tx = tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfologia das células precursoras dos adipócitos e adipócitos maduros . (A) APCs subcutâneos em 80% de confluência antes de induzir a diferenciação em placas de cultura de 12 poços. (B) Adpócitos primários subcutâneos após 7 dias da indução da diferenciação em placas de cultura de 12 poços. As imagens foram obtidas em aumento de 10x. Barras de escala = 100 μm. Abreviação: APCs = células precursoras de adipócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resistência à insulina induzida pelo TNF-α em adipócitos primários subcutâneos demonstrada pela diminuição da fosforilação induzida por insulina da RI, IRS-1 e AKT. Os adipócitos subcutâneos foram tratados com TNF-α (4 ng/mL) por 48 h e sem soro nas últimas 24 horas. Após a estimulação com insulina (100 nM) por 15 min, 40 μg de proteína total foram carregados em géis a 7,5% e submetidos a SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e bloqueados em leite desnatado a 4% em TBS-T 0,1%. A membrana foi sondada com IR antifosforilada (pIR), IRS-1 fosforilada (pIRS-1) e AKT fosforilada (pAKT), bem como um anticorpo secundário anti-HRP de coelho. O sinal foi visualizado com detecção por quimioluminescência e a tubulina anti-β foi utilizada como controle de carga. (A) Manchas representativas e (B) quantificação a partir de três experimentos independentes. Os dados são médios ± MEV; *, p < 0,05 versus controle. Abreviações: TNF-α = fator de necrose tumoral-α; RI = receptor de insulina; IRS = substrato do receptor de insulina; pX = forma fosforilada de X; b-Tub = beta-tubulina; HRP = peroxidase de raiz forte; Ctrl = controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução Anti-Fc rato purificado anti-rato CD16 / CD32 diluído em PBS–2% FBS [1:150]
TBS-T 0,1% Tris-HCl 0,01 M (pH 8), NaCl 0,15 M, 0,1% Tween 20
Solução de bloqueio 4% de leite em pó desnatado diluído em TBS-T 0,1%
Meio de crescimento 60% DMEM baixa glicose, 40% meio MCDB 201, 1x penicilina-estreptomicina, 1 nM dexametasona, 0,1 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 1x insulina, transferrina, sódio, selenito (ITS) suplemento em meio líquido, 1x ácido linoleico-albumina da BSA, 10% FBS, 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), 10 ng/mL fator inibidor de leucemia (LIF), 10 ng/mL fator de crescimento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB), 5 ng/mL fator de crescimento de fibroblastos-básico (bFGF) e 50 μg/mL normocina
Meio de diferenciação 60% DMEM baixa glicose, 40% meio MCDB 201, 1x penicilina-estreptomicina, 1 nM dexametasona, 0,1 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 1x suplemento de meio líquido ITS, 1x ácido linoleico-albumina da BSA e 2% FBS
Coquetel diferenciado 0,5 μM de 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 1 μM de dexametasona, 10 μM de rosiglitazona e 100 nM de insulina
Médio simples-2% FBS 60% DMEM baixa glicose, 40% meio MCDB 201, 1x penicilina-estreptomicina e 2% SFB
Meio simples – 0% FBS 60% DMEM baixa glicose, 40% meio MCDB 201, 1x penicilina-estreptomicina
Buffer RIPA 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol, 1 mM Na3VO 4, 48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4 P2O7 e 0,26 M sacarose
6x buffer Laemmli 1,2 g SDS, 6 mg de azul de bromofenol, 4,7 mL de glicerol, 1,2 mL de Tris base 0,5 M pH 6,8, 845 μL 2-mercaptoetanol e 2,1 mL H2O
Buffer em execução Tris base 25 mM, glicina 192 mM, SDS 1%
Buffer de transferência Tris-base 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%

Tabela 1: Soluções utilizadas neste protocolo.

Figura Suplementar S1: Tecido adiposo subcutâneo digerido com colagenase. Uma vez removido o tecido adiposo, este é cortado em pequenos pedaços com tesoura para iniciar o processo de digestão (A), em seguida é incubado por 30 min com colagenase tipo 1 a 37 °C, 150 rpm (B). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Esquema do processo de isolamento de células precursoras de adipócitos. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo inguinal e digerir as amostras com colagenase. Elimine os adipócitos maduros por centrifugação e lave o pellet para remover o excesso de gordura. Lise os glóbulos vermelhos e bloqueie para reduzir a ligação inespecífica. Marcar as células endoteliais e macrófagos com anticorpos acoplados a partículas magnéticas. Realizar a separação magnética de células utilizando a estratégia de separação negativa com um separador magnético de células. Sementes de APCs (células não marcadas) em placas cobertas com matriz de membrana basal. Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência. Abreviações: APCs = células precursoras de adipócitos; BSA = albumina de soro bovino; SFB = soro fetal bovino. Criado com Biorender.com. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S3: O tratamento com TNF-α para indução de resistência insulínica não altera a viabilidade dos adipócitos. A viabilidade de adipócitos maduros foi medida pelo teste de MTT após tratamento com 4 ng/mL de TNF-α por 48 h. Os dados são médios ± MEV. Abreviações: TNF-α = fator de necrose tumoral-α; Ctrl = controle. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S4: O tratamento com TNF-α em adipócitos diminui a expressão de marcadores de sensibilidade à insulina. A expressão de RNAm de Insr, Irs, Glut4 e Adipoq foi medida por PCR em tempo real após tratamento com 4 ng/mL de TNF-α por 48 h. Os dados são médios ± MEV; *, p < 0,05 versus controle. Abreviações: TNF-α = fator de necrose tumoral-α; Ctrl = controle. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este trabalho fornece um método para estudar a resistência à insulina que utiliza adipócitos primários em cultura tratada com TNF-α. Esse modelo tem a vantagem de que adipócitos primários podem ser cultivados em condições definidas por longos períodos de tempo com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares26. A duração do ensaio é de 15-20 dias, embora variações na porcentagem de adipócitos diferenciados possam ocorrer entre os experimentos. Os adipócitos primários apresentam vantagens sobre as linhagens celulares, uma vez que não foram expandidos continuamente em cultura e capturam mais de perto a diversidade do tecido do qual sãoderivados27. Além disso, adipócitos primários permitem estudar doadores em diferentes contextos fisiopatológicos, como magros versus obesos, homens versus mulheres, jovens versus idosos e células de diferentes depósitos de gordura. Outra vantagem deste método é que linhagens celulares de camundongos CRE e knockout podem ser geradas após o isolamento de APCs.

Um possível problema durante o isolamento e diferenciação das APCs é que essas células podem perder a capacidade de diferenciação, o que provavelmente ocorreria quando 80% da confluência é excedida no início do processo de diferenciação. O meio também deve ser trocado com muita delicadeza, principalmente após o acúmulo de lipídios, uma vez que adipócitos diferenciados se desprendem facilmente da placa de cultura. Além disso, cada lote de colagenase deve ser testado quanto à eficiência da digestão, rendimento celular e citotoxicidade26. Técnicas têm sido desenvolvidas para identificar e isolar as VPAs da fração estromovascular do tecido adiposo branco, utilizando marcadores negativos como CD31 e CD45, bem como marcadores populacionais de células-tronco positivos como CD34 e Sca128,29. Nesse protocolo, realizamos apenas uma separação negativa, eliminando células endoteliais e macrófagos da fração estromovvascular, evitando assim a perda de pré-adipócitos na separação positiva.

Embora as culturas primárias permitam o estudo da variabilidade e complexidade dos doadores27,30, a definição do modelo experimental introduz limitações. Por exemplo, adipócitos isolados de animais velhos terão menor capacidade de diferenciação e maior taxa de lipotoxicidade quando comparados aos de animais jovens31,32. O protocolo também pode ser adaptado para usar diferentes técnicas de separação celular. Se um separador automático de células magnéticas não estiver disponível, a separação manual das células pode ser obtida com colunas ou classificação FACS. O método aqui descrito para o isolamento de APCs usando um separador magnético de células é uma versão adaptada e simplificada do protocolo de classificação FACS descrito por Macotela et al.28.

Várias citocinas inflamatórias têm sido utilizadas para induzir resistência insulínica em células adiposas, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6 18,33,34,35,36. Os adipócitos 3T3-L1 cultivados expostos ao TNF-α tornam-se resistentes à insulina em vários dias, como avaliado pela capacidade reduzida da insulina em estimular a captação de glicose37. Esses resultados mostram que o TNF-α diminui a fosforilação induzida pela insulina de IR, IRS-1 e AKT21,23, medida pela detecção por western blot da proteína total extraída de adipócitos primários. No entanto, proteases e fosfatases liberadas durante a lise celular podem influenciar a detecção de western blots. O estado ativo das proteínas deve ser preservado pela adição de proteases e inibidores de fosfatase ao tampão de lise e após a quantificação das proteínas, misturando-se a amostra com tampão Laemmli. Em conclusão, este método fornece uma ferramenta útil para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina em adipócitos diferenciados de VPAs de camundongos.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos a Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo pela assistência técnica e Jessica Gonzalez Norris pela edição crítica do manuscrito. Este protocolo foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer  LONZA 10-548E
Anti-Biotin Microbeads  Miltenyi 130-090-485
Anti-CD31 eBioscience 13-0311-85
AutoMACS Pro Separator Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel) Corning 354234
bFGF Sigma F0291 Growth factor
BSA Equitech-Bio, Inc. BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin  eBioscience 13-0451-85
Collagenase, Type 1 Worthington Biochem LS004197
Dexamethasone Sigma D1756
DMEM GIBCO 12800017
DMEM low glucose GIBCO 31600-034
EGF Peprotech 315-09 Growth factor
FBS GIBCO 26140-079
ITS mix Sigma I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
LIF Millipore ESG1107 Growth factor
Linoleic acid-albumin Sigma L9530
MCDB 201 medium Sigma M6770
Normocin InvivoGen ant-nr-2
PDGF-BB  Peprotech 315-18 Growth factor
Peniciline-Streptomycine BioWest L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm) Miltenyi 130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32  BD Pharmingen 553142
Trypsin-EDTA  GIBCO 25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] Sigma I5879 Differentiation cocktail
BMP4 R&D Systems 5020-BP-010 Differentiation cocktail
Dexamethasone Sigma D1756 Differentiation cocktail
Insulin Sigma I9278
Rosiglitazone Cayman 71742 Differentiation cocktail
TNFα R&D Systems 210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody Abcam ab6046
Bromophenol blue BioRad 161-0404 Laemmli buffer
EDTA Sigma E5134 RIPA buffer
EGTA Sigma E4378 RIPA buffer
FluorChem E system ProteinSimple
Glycerol Sigma G6279 Laemmli buffer
Glycine Sigma G7126 Running and Transfer buffer
Igepal Sigma I3021 RIPA buffer
2- mercaptoethanol Sigma M3148 Laemmli buffer
Methanol JT Baker 907007 Transfer buffer
NaCl JT Baker 3624-05 TBS-T
NaF Sigma 77F-0379 RIPA buffer
NaOH  JT Baker 3722-19
Na4P2O7 Sigma 114F-0762 RIPA buffer
Na3VO4 Sigma S6508 RIPA buffer
Nitrocellulose membrane  BioRad 1620112
Nonfat dry milk BioRad 1706404 Blocking solution
Prestained protein standard  BioRad 1610395
Protease inhibitor cocktail  Sigma P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch 711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β  Cell signaling 3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody Cell signaling 9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody Millipore 9432
Saccharose  JT Baker 407205 RIPA buffer
SDS BioRad 1610302 Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
Tris-base Promega H5135 Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl JT Baker 4103-02 RIPA buffer - TBS
Tween 20 Sigma P1379 TBS-T

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