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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um ein schnelles und zerstörungsfreies System zur Messung der Zell- oder Kernkompressibilität basierend auf akustofluidischen Mikrogeräten aufzubauen. Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen nach epithelial-mesenchymalem Übergang oder ionisierender Strahlung wurden untersucht, was die Anwendungsperspektive dieser Methode in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis aufzeigt.

Abstract

Die Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit. Während dieser Prozesse ist die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Zellen oft eine Herausforderung. Konventionelle Messmethoden, die auf Kontakt basieren, wie Kompression oder Dehnung, neigen dazu, Zellschäden zu verursachen, was die Messgenauigkeit und die anschließende Zellkultur beeinträchtigt. Messungen im adhärenten Zustand können auch die Genauigkeit beeinträchtigen, insbesondere nach der Bestrahlung, da ionisierende Strahlung Zellen abflacht und die Adhäsion verbessert. Hier wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf einer akustofluidischen Methode basiert. Die Zellkompressibilität kann durch Aufzeichnung der Zellbewegungsbahn unter Einwirkung der akustischen Kraft erreicht werden, wodurch eine schnelle und zerstörungsfreie Messung im suspendierten Zustand realisiert werden kann. In diesem Artikel werden die Protokolle für Chipdesign, Probenvorbereitung, Trajektorienaufzeichnung, Parameterextraktion und -analyse ausführlich beschrieben. Anhand dieser Methode wurde die Kompressibilität verschiedener Tumorzelltypen gemessen. Die Messung der Kompressibilität des Kerns wurde ebenfalls durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals erreicht. In Kombination mit der molekularen Verifikation von Immunfluoreszenzexperimenten wurde die Zellkompressibilität vor und nach dem medikamenteninduzierten epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) verglichen. Weiterhin wurde die Veränderung der Zellkompressibilität nach Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen aufgedeckt. Die in dieser Arbeit vorgeschlagene zellmechanische Messmethode ist universell und flexibel und hat breite Anwendungsperspektiven in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis.

Introduction

Zellmechanische Eigenschaften spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit 1,2. Um ein tiefes Verständnis der Rolle der zellmechanischen Eigenschaften in dem oben genannten Prozess zu erlangen, ist eine genaue Messung der Zellmechanik von entscheidender Bedeutung, und die Messung sollte keine Schäden an den Zellen für die anschließende Kultur und Analyse verursachen. Der Messprozess sollte so schnell wie möglich sein, da sonst die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt werden kann, wenn Zellen für längere Zeit aus der Kultivierungsumgebung entfernt werden.

Bestehende zellmechanische Messmethoden stoßen auf einige Einschränkungen. Einige Methoden, wie die magnetische Drehzytometrie, die Magnetpinzette und die Partikelverfolgungsmikrorheologie, verursachen Zellschäden durch die Einführung von Partikeln in Zellen 3,4,5. Methoden, die durch Kontakt mit Zellen messen, wie Rasterkraftmikroskop (AFM), Mikropipettenaspiration, Mikrokonstriktion und Parallelplattentechnik, sind ebenfalls anfällig für Zellschäden und der Durchsatz ist schwer zu erhöhen 6,7,8. Darüber hinaus wird ionisierende Strahlung Zellen abflachen und ihre Adhäsion erhöhen9; Es ist daher notwendig, die Ganzzellmechanik in Suspension zu messen.

Als Antwort auf die oben genannten Herausforderungen wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf der akustofluidischen Methode 10,11,12,13,14 basiert. Die Kanalbreite ist auf die akustische Halbwellenlänge abgestimmt, wodurch ein stehender Wellenknoten an der Mittellinie des Mikrokanals entsteht. Unter Einwirkung der akustischen Strahlungskraft können sich die Zellen oder Standardperlen zum akustischen Druckknoten bewegen. Da die physikalischen Eigenschaften der Standardkügelchen (Größe, Dichte und Kompressibilität) bekannt sind, kann die akustische Energiedichte bestimmt werden. Dann kann die Zellkompressibilität durch Aufzeichnung der Bewegungsbahnen von Zellen im akustischen Feld erhalten werden. Eine zerstörungsfreie Hochdurchsatzmessung von Zellen im Suspensionszustand kann erreicht werden. In diesem Beitrag werden das Design des mikrofluidischen Chips, der Aufbau des Systems und die Messschritte vorgestellt. Es wurden verschiedene Arten von Tumorzellen gemessen, um die Genauigkeit der Methode zu überprüfen. Der Anwendungsbereich dieser Methode wurde durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals auf subzelluläre Strukturen (z.B. Kern) erweitert. Darüber hinaus wurden die Veränderungen der Zellkompressibilität nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen untersucht. Die Ergebnisse zeigen die breite Anwendbarkeit dieser Methode als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Korrelation zwischen biochemischen Veränderungen und zellulären mechanischen Eigenschaften.

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Protocol

1. Herstellung und Montage des akustofluidischen Mikrogeräts

  1. Herstellung des mikrofluidischen Chips.
    1. Entwerfen Sie einen Einkanalchip mit nur einem Ein- und Auslass, wie in Abbildung 1 dargestellt. Für Messzellen ist der rechteckige Querschnitt des Mikrokanals bei 740 μm Breite und 100 μm Tiefe zu halten. Um den Zellkern zu messen, ändern Sie die Breite und Tiefe des Mikrokanals auf 250 μm bzw. 100 μm.
    2. Bereiten Sie den Mikrokanal auf Siliziumwafern durch reaktives Ionenätzen vor. Versiegeln Sie die Oberseite des Mikrokanals mit einem Stück transparentem hitzebeständigem Glas durch anodische Verklebung15. Waschen Sie die Chips mit einem Ultraschallreiniger für 10 min. Trocknen Sie sie im Trockenofen bei 50 °C für den späteren Gebrauch.
  2. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) -Blöcken.
    1. Fügen Sie 30 ml Prepolymer in eine Glasschale mit 100 mm (Durchmesser) hinzu. Mit einer Spritze 3 ml Härter in das Prepolymer geben.
      HINWEIS: Das Volumenverhältnis von Härter und Vorpolymer beträgt 1:10.
    2. PDMS-Prepolymer und Härter mit einem Glasstab ca. 10 min kräftig mischen. Achten Sie auf kleine und gleichmäßig getrennte Luftblasen in der Lösung, die darauf hinweisen, dass PDMS-Prepolymer und Härter gut gemischt sind.
    3. Legen Sie die Glasschale in einen Vakuum-Exsikkator und evakuieren Sie für 15-25 s. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine Luftblasen mehr in der Mischung vorhanden sind.
    4. Die Glasschale für 1 h in einen Trockenofen bei 50 °C stellen, damit die Mischung aushärten kann. Nach der Inkubation schneiden Sie das PDMS mit einem Skalpell in Blöcke geeigneter Größe von etwa 1,2 cm Länge und 1 cm Breite.
      HINWEIS: Die Länge des PDMS-Blocks stimmt mit der Breite des Chips überein, und die Breite wird ausgewählt, um sicherzustellen, dass in der Mitte genügend Platz für die piezoelektrische Keramik vorhanden ist, wenn zwei PDMS-Blöcke auf dem Chip aufgeklebt sind.
  3. Binden Sie den PDMS-Block an den Chip.
    1. Stanzlöcher im PDMS-Block für Ein- und Auslassanschlüsse mit einer Hohlnadel mit 1 mm Durchmesser. Legen Sie die PDMS-Blöcke und den Chip (Rückseite nach oben) für 1 min in einen Plasmareiniger.
    2. Richten Sie die Löcher an den PDMS-Blöcken am Chipeinlass und -auslass aus. Drücken Sie die PDMS-Blöcke 15 s lang vorsichtig auf den Chip. Dies sollte zu einer Bindung zwischen den PDMS-Blöcken und der Oberfläche des Chips führen.
  4. Verbinden Sie den Polytetrafluorethylen (PTFE)-Katheter mit dem Chip (Abbildung 2B).
    1. Schneiden Sie zwei Stück PTFE-Katheter mit einem Innendurchmesser von 0,8 mm und einer Länge von 10 cm. Biegen Sie eine Edelstahlnadel mit einem Innendurchmesser von 0,7 mm und einer Länge von 1,5 cm mal 90° in eine L-Form. Verbinden Sie es mit einem Ende des Katheters. Bereiten Sie zwei solcher Katheter mit Nadeln vor.
    2. Führen Sie die Edelstahlnadeln in die Löcher der PDMS-Blöcke ein. Schließen Sie für den Einlass eine 19 G Dosiernadel als Anschluss für eine Spritze an das andere Ende des Katheters an.
    3. Nach Abschluss der obigen Schritte injizieren Sie entionisiertes Wasser, um die Dichtheit des Gesamtkanals zu testen. Wasserundurchlässig bedeutet eine gute Abdichtung.
  5. Piezokeramische Baugruppe (Abbildung 2C)
    1. Mit einem Diamantdrahtschneider schneiden Sie piezoelektrische Keramikplatten mit einem Durchmesser von 2 cm in vier Streifen mit einer Breite von 5 mm.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik mit der Breite des Chip-Mikrokanals übereinstimmt. Verwenden Sie für den 740 μm und 250 μm breiten Mikrokanal piezoelektrische Keramik mit Resonanzfrequenzen von 1 MHz bzw. 3 MHz.
    3. Schweißdrähte auf beiden Seiten der piezoelektrischen Keramik an einem Ende.
    4. Kleben Sie die piezoelektrische Keramik mit Cyanacrylatkleber auf die Mitte der Rückseite des Chips.
    5. Um den Kleber gleichmäßig zu verteilen, legen Sie einen Tropfen Klebstoff auf die piezoelektrische Keramik, glätten Sie den Kleber mit einem Zahnstocher und entfernen Sie den überschüssigen Kleber. Dann drücken Sie es schnell auf den Chip und drücken Sie es für ca. 1 Minute. Stellen Sie sicher, dass die piezoelektrische Keramik und der Chip fest verbunden und gleichmäßig miteinander verbunden sind.
  6. Montieren Sie das Mikrogerät (Abbildung 2D).
    1. Schneiden Sie ein Stück PDMS (ca. 1,5 cm lang und 1 cm breit) als Basis des Mikrogeräts ab. Kleben Sie mit doppelseitigem Klebeband eine Seite der Basis an die Ein- und Auslass-PDMS-Blöcke und die andere Seite an einen transparenten Glasschieber. Befestigen Sie das gesamte Mikrogerät am Mikroskoptisch, um den Chip in einer Fokusebene zu halten.

2. Probenvorbereitung

  1. Herstellung von Polystyrol-Standardpartikellösungen.
    1. 0,05 ml Polystyrolpartikellösung (6 μm Durchmesser) (2,1 x 108 Partikel/ml) zu 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geben und gut mischen.
      HINWEIS: Um den Messfehler durch die Änderung der akustischen Energiedichte zu reduzieren, wurde die Polystyrol-Partikellösung in jedem Experiment als Kalibrierung mit der Probenlösung gemischt.
  2. Herstellung von Zellsuspensionen.
    1. Waschen Sie die adhärenten Zellen (z. B. MCF7, MDA-MB-231, HCT116) bei 90% Konfluenz (~ 5 x 105 Zellen) mit PBS. 500 μL 0,25% Trypsin (1x) für 1-2 min bei Raumtemperatur (25 °C) zugeben. Entfernen Sie das Trypsin, fügen Sie 1 ml komplettes Medium hinzu und formen Sie durch Pipettieren eine Zellsuspension.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 0,5-1 ml PBS, um eine Zellsuspension zu erhalten. Die Zellen wurden mit einem Hämozytometer gezählt und die Konzentration betrug etwa 3-5 x 105 Zellen/ml.
  3. Herstellung der Zellkernsuspension
    1. Führen Sie Schritt 2.2 durch. Dann entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μL zytoplasmatisches Proteinextraktionsreagenz A (ergänzt mit 1% PMSF) pro 20 μL Zellpellet (ca. 5 Millionen Zellen) hinzu und mischen Sie gut.
    2. Wirbeln Sie die obige Mischung bei 220 x g für 5 s an und legen Sie sie dann für 10 min auf Eisbad. Nach der Inkubation 10 μL zytoplasmatisches Proteinextraktionsreagenz B in die Lösung geben.
    3. Wirbel bei 220 x g für 5 s. Für 1 min auf das Eisbad legen und erneut bei 220 x g für 5 s vorstruken. Dann schließlich bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
      HINWEIS: Das Volumenverhältnis der zytoplasmatischen Proteinextraktionsreagenzien A und B beträgt 20:1.
    4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS. Dann bei 1.000 x g bei 4 °C für 4 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 100 μL PBS als Zellkernsuspension.
    5. Trypanblau in die obige Zellkernsuspension geben und bei Raumtemperatur (25 °C) 4 min anfärben. Das Volumenverhältnis von Trypanblaulösung zu Kernsuspension beträgt 1:1. Zählen Sie die Anzahl der Kerne unter dem inversen Mikroskop mit einem 10x-Objektiv.
      HINWEIS: Um die Zellkerne unter dem Mikroskop eindeutig zu identifizieren, ist eine Trypanblau-Färbung erforderlich. Die Trypanblaulösung muss vor der Anwendung 10 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad sein, um eine effektive Färbung zu erzielen.
    6. Die obige Zellkernsuspension wird mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 2-3 x 105 Kern/ml verdünnt. Filtern Sie die Zellkernsuspension durch ein 70 μm Sieb.

3. Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern

  1. Einrichten des Messsystems (Abbildung 3)
    1. Schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops ein und öffnen Sie die Kamerasoftware. Verwenden Sie das 4x-Objektiv, um die mittlere Position des Mikrokanals zu finden, d.h. die Position der piezoelektrischen Keramik.
    2. Verbinden Sie die Drähte und schweißen Sie sie mit den Plus- und Minuspolen des Signalgeneratorausgangs an der piezoelektrischen Keramik.
    3. Setzen Sie die Spritze auf die Mikroinjektionspumpe und verbinden Sie sie mit dem Einlasskatheter. Platzieren Sie einen kleinen Behälter am Ende des Auslasskatheters, um die Flüssigkeit zu halten, die aus dem Mikrokanal fließt.
  2. Messparameter ermitteln
    1. Die Polystyrolpartikellösung mit der Spritze absaugen und in den Chip-Mikrokanal injizieren. Vermeiden Sie Luftblasen im Chip-Mikrokanal, um eine genaue Messung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Partikel gleichmäßig im Mikrokanal des Chips verteilt sind.
      HINWEIS: Die Messung kann ohne Durchfluss oder Spritzenpumpe durchgeführt werden. Falls erforderlich, sollte der Durchfluss der Mikroinjektionspumpe auf einen geeigneten Wert eingestellt werden. Hier liegt der Durchflussbereich bei 0-20 μL/h.
    2. Stellen Sie den Ausgang des Signalgenerators auf ein Sinussignal mit einer Frequenz von 1 MHz (3 MHz für die Zellkernmessung) und einer Spitze-Spitze-Spannung (Vpp) von 10 V ein.
    3. Passen Sie die Frequenz des Signals genau an, bis beobachtet wird, dass sich die Partikel in Richtung der Mittellinie des Mikrokanals bewegen und nach Erreichen der Mittellinie in Vorwärtsbewegung entlang der Mittellinie bleiben (Abbildung 4).
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Partikel, die sich in Richtung der Mittellinie bewegen, wird durch die Spannungsamplitude bestimmt, die zwischen 5 Vpp und 20 Vpp eingestellt werden kann.
  3. Zellen und Zellkerne messen
    1. Mischen Sie 1 ml Zell- oder Kernsuspension mit der Standardpartikellösung im Verhältnis 1:1 und injizieren Sie sie mit einer Spritze in den Mikrokanal.
    2. Starten Sie die Aufnahme mit der CCD-Kamera, wenn die Zellen oder Kerne in das Sichtfeld gelangen. Schalten Sie dann den Signalgenerator ein. Stoppen Sie die Aufnahme, wenn die Zellen oder Kerne die Mittellinie erreichen.
    3. Spülen Sie den Mikrokanal nacheinander mit entionisiertem Wasser, 75% Alkohol und entionisiertem Wasser für die spätere Verwendung ab.

4. Datenverarbeitung

  1. Bilden Sie Partikel- oder Zellbahnen ab.
    1. Importieren Sie das aufgenommene Video in die ImageJ-Software: Datei > öffnen> Ordner auswählen. Klicken Sie auf die Ellipsenform in der Symbolleiste der ImageJ-Software, um eine gewünschte Zelle und das angrenzende Partikel auszuwählen (Abbildung 5).
    2. Wie in Abbildung 5 dargestellt, stellen Sie die Messparameter in der ImageJ-Software wie Analysieren→ Messung festlegen →Fläche, Schwerpunkt, Anzeigebeschriftung ein.
    3. Nehmen Sie den Rahmen, in dem die Zielzelle oder das Zielpartikel eine Längsverschiebung erfährt, als Startrahmen; Zeichnen Sie die Pixelposition und -größe der Zelle oder des Partikels in jedem Frame auf, bis sie die Mittellinie des Mikrokanals erreichen. Exportieren Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei und wiederholen Sie den Schritt, bis Trajektorien für alle interessierenden Zellen erhalten sind.
  2. Koordinatentransformation und -korrektur.
    1. Notieren Sie die Pixelkoordinaten der vier Ecken des Mikrokanals in diesem Sichtfeld als (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Hier x3 = x4.
    2. Berechnen Sie für jeden Messpunkt (xi, yi) die neue Koordinate (xi', yi') nach der Drehungskorrektur mit den folgenden Formeln:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. Konvertieren Sie Pixelkoordinaten in Koordinaten in echter Größe. Die tatsächlichen Koordinaten können durch Multiplikation der Pixelkoordinaten mit dem Verhältnis erhalten werden. Das Verhältnis war die tatsächliche Breite des Mikrokanals geteilt durch die Pixelbreite (H) des Mikrokanals.
    4. Transformieren und korrigieren Sie die Pixelkoordinaten der in Schritt 4.1 erhaltenen Zellen und Partikel in die endgültigen Bewegungsbahndaten. Alle Koordinaten abzüglich der Koordinaten der linken unteren Ecke, d.h. (0, y2). Die Bildrate des Videos beträgt 40 Bilder pro Sekunde, also multiplizieren Sie die Anzahl der Bilder, die jeder Koordinate entsprechen, mit 0,025 s, um die Zeit der Partikelbewegung zu erhalten, wodurch die Änderung der Position in y-Richtung mit der Zeit erhalten wird.
  3. Berechnen Sie die akustische Energiedichte (Abbildung 6A,B).
    1. Die Bewegung der Zelle oder des Partikels in Y-Richtung wird durch die Schallkraft F ac und die hydrodynamische Kraft FD angetrieben. Berechnen Sie die Bewegungstrajektorie mit den folgenden Formeln:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      wobei r und D der Radius und der Durchmesser der Zelle oder des Teilchens sind, ρ und β die Dichte und Kompressibilität sind, ν der Geschwindigkeitsvektor ist. Die Indizes c und f bezeichnen die Zelle bzw. die Flüssigkeit. d ist der Abstand vom nächsten akustischen Druckknoten, μ die dynamische Viskosität des Fluids, k die Wellenzahl und E die akustische Energiedichte.
      ANMERKUNG: Die Dichte von MCF7, HCT116, A549 und Zellkernen betrug 1068 kg/m 3, 1077 kg/m 3, 1073 kg/m 3 bzw. 1155 kg/m 3 bzw. 12,16,17.
    2. Verwenden Sie gemäß den in Schritt 4.3.1 beschriebenen Formeln die MATLAB-Software, um die numerische Lösung für die Standard-Partikeltrajektorie unter der akustischen Feldmethode mit Finite-Differenzen-Methode zu erhalten.
    3. Ändern Sie innerhalb des voreingestellten akustischen Feldbereichs die akustische Energiedichte und passen Sie die numerische Lösung (erhalten in Schritt 4.3.2) und die gemessene Bewegungstrajektorie (erhalten in Schritt 4.2) für das Standardpartikel an. Wählen Sie das beste Anpassungsergebnis entsprechend dem mittleren quadratischen Fehler der Anpassung aus. Die hier erhaltene akustische Energiedichte dient als Parameter für die anschließende Berechnung der Zellkompressibilität.
  4. Berechnen Sie die Zellkompressibilität (Abbildung 6C,D).
    1. Stellen Sie die akustische Energiedichte auf den in Schritt 4.3.3 ermittelten Wert ein.
    2. Verwenden Sie gemäß den in Schritt 4.3.1 beschriebenen Formeln die MATLAB-Software, um die numerische Lösung für die Zelltrajektorie unter dem akustischen Feld mit der Finite-Differenzen-Methode zu erhalten.
    3. Ähnlich wie in Schritt 4.3.3 ändern Sie innerhalb des voreingestellten Kompressibilitätsbereichs die Kompressibilität und passen Sie die numerische Lösung (erhalten in Schritt 4.4.2) und die gemessene Bewegungstrajektorie für die Zelle (erhalten in Schritt 4.2) an. Verwenden Sie den Kompressibilitätskoeffizienten, der dem am besten passenden Ergebnis entspricht, als gemessene Zellkompressibilität.

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Representative Results

Hier stellte die Arbeit ein Protokoll für den Aufbau eines schnellen und zerstörungsfreien Zellkompressibilitätsmesssystems auf Basis eines akustofluidischen Mikrogeräts vor und demonstrierte dessen Vorteile für die Messung von Zelle und Kern unter verschiedenen Situationen. Abbildung 1 zeigt das Schema des mikrofluidischen Kanals. Die Komponenten und der Aufbau des akustofluidischen Mikrogeräts sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 3 zeigt den Aufbau des Messsystems. Unter der Wirkung der akustischen Feldkraft bewegen sich Zellen und Partikel in Richtung der Mittellinie des Mikrokanals, wie in Abbildung 4A gezeigt. Die Messung der Größe und Position von Zellen oder Partikeln ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Berechnung der Energiedichte und der Zellkompressibilität durch Anpassung ist in Abbildung 6 dargestellt. Um den Anwendungsbereich dieses Geräts auf zelluläre Organellen, insbesondere den Zellkern, auszudehnen, wurden hochreine und intakte Kerne aus Zellen isoliert (Abbildung 7A). Durch entsprechende Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals wurde die Bewegungsbahn des Kerns erhalten (Abbildung 4B) und die Messung der Kernkompressibilität erreicht (Abbildung 7B).

Basierend auf diesem System wurde die Kompressibilität verschiedener Krebszelltypen gemessen und verglichen (Abbildung 8A). Zusätzlich wurden die Veränderungen der Zellkompressibilität nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen untersucht (Abbildung 8B,C). Für die EMT-Induktion wurden Wachstumsfaktoren wie transformierender Wachstumsfaktor beta (TGFβ), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) verwendet. Für die Bestrahlung betrug die Dosisleistung 153 mU/min und die verwendeten Dosen 1, 2, 4 und 8 Gy. Diese Ergebnisse zeigen die breite Anwendbarkeit dieser Methode als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Korrelation zwischen biochemischen Veränderungen und zellulären mechanischen Eigenschaften. Am wichtigsten war, dass diese Methode eine zerstörungsfreie Messung war. Die gemessenen Zellen wurden gesammelt und in einer Zellkulturschale ausgesät, und es wurde festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Zellproliferation und Lebensfähigkeit im Vergleich zur unbehandelten Gruppe nach 48 Stunden Kultur gab, wie in Abbildung 9 gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Messung keinen Einfluss auf die Zellproliferation und das Überleben hat.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Chip-Mikrokanals. Dieses Bild zeigt die Struktur und Abmessungen des Chip-Mikrokanals mit einem einzigen Ein- und Auslass. Die Einheit ist mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Montagefoto für das akustofluidische Mikrogerät . (A) Fotos der Vorder- und Rückseite des Chips. (B) Dieses Bild zeigt den PTFE-Einlasskatheter mit aufgesetzter 19 G Dosiernadel und Edelstahlnadel. (C) Dieses Bild zeigt die piezoelektrische Keramik mit geschweißten Drähten. (D) Dieses Bild zeigt den Aufbau des akustofluidischen Mikrogeräts mit Basis zur Befestigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Aufbau des Zellkompressibilitätsmesssystems. Dieses Bild zeigt den Aufbau des Messsystems bestehend aus Signalgenerator, Spritzenpumper, akustofluidischem Mikrogerät, Mikroskop und CCD-Kamera. Diese Zahl wurde von10 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Die Bewegung von Zellen und Kernen. Diese Abbildung zeigt die Bewegung von Zellen (A) und Zellkernen (B) zur Mittellinie des Mikrokanals unter Einwirkung der akustischen Feldkraft. Maßstabsbalken = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Messung der Größe und Position einer Zelle oder eines Partikels mit der ImageJ-Software. Diese Abbildung zeigt den Klick auf die Schaltfläche zum Abrufen von Parametern wie Fläche und Schwerpunkt in der ImageJ-Software. Die Pixelkoordinaten der vier Ecken des Mikrokanals wurden als (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4) aufgezeichnet. Die Pixelbreite wurde als H dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Die Berechnung der Energiedichte und der Zellkompressibilität durch Anpassung. (A) Mittlere quadratische Fehlerwerte (LS) bei unterschiedlichen Energiedichten. Die akustische Energiedichte wurde aus dem besten Passergebnis gewonnen. Die Einheit der Energiedichte ist J/m3. (B) Diese Abbildung zeigt die Anpassung der numerischen Lösung und die gemessene Bewegungsbahn für das Teilchen. (C) Mittlere quadratische Fehlerwerte (LS) bei unterschiedlicher Zellkompressibilität. Die Zellkompressibilität wurde aus dem am besten passenden Ergebnis erhalten. (D) Diese Abbildung zeigt die Anpassung der numerischen Lösung und die gemessene Bewegungsbahn für die Zelle. Die Einheit der Zellkompressibilität ist 10-10 Pa-1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Kernextraktion und Kompressibilitätsmessung. (A) Dieses Bild zeigt die Zellkerne, die aus A549-Zellen extrahiert wurden, betrachtet mit einem 40-fachen Objektiv. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Dieses Bild zeigt den gemessenen Kompressibilitätsvergleich von A549-Zellen (N = 38) und ihren Kernen (N = 45). Die Einheit der Zellkompressibilität ist 10-10 Pa-1. Die Länge des Feldes stellt die Standardabweichung dar. Der t-Test des Schülers und die Chi-Quadrat-Analyse wurden verwendet, um die Signifikanz zu bewerten. **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Die Kompressibilität verschiedener Arten von Krebszellen und Zellen nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung. (A) Die Zellkompressibilität verschiedener Arten von Krebszellen. HCT116 (N = 36), A549 (N = 68) und MDA-MB-231 (N = 32) waren die Zelllinien des kolorektalen Karzinoms, des Lungenadenokarzinoms und des Brustadenokarzinoms. (B) Die Zellkompressibilität von MCF7 und A549 vor und nach Induktion von EMT. (C) Zellkompressibilität, gemessen nach 3 h nach Bestrahlung mit verschiedenen Dosen. Die Einheit der Zellkompressibilität ist 10-10 Pa-1. Die Endbalken des Boxplots stellen die Werte 10 % bzw. 90 % dar. Die Länge des Feldes stellt die Standardabweichung dar. Die mittlere horizontale Linie stellt den Medianwert dar. ns bedeutet keine statistische Signifikanz. Der t-Test des Schülers und die Chi-Quadrat-Analyse wurden verwendet, um die Signifikanz zu bewerten. *P < 0,05, **P < 0,01. Ein Teil dieser Zahl wurde von18,19 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Zellproliferation und Lebensfähigkeit nach Kompressibilitätsmessung. Diese Abbildung zeigt die A549-Zellproliferation (A) und Lebensfähigkeit (B) nach der Kompressibilitätsmessung. Kontrollgruppen sind unbehandelte Zellen. Testgruppen sind die Zellen, die für 48 h nach der Kompressibilitätsmessung gezüchtet werden. Jedes Experiment hat mindestens drei Replikate. Für die Zelllebensfähigkeit wurden mindestens 300 Zellen gezählt. Der t-Test des Schülers und die Chi-Quadrat-Analyse wurden verwendet, um die Signifikanz zu bewerten. ns bedeutet nicht statistisch signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Häufig verwendete zellmechanische Messmethoden sind AFM, Mikropipettenaspiration, mikrofluidische Methoden, Parallelplattentechnik, optische Pinzette, optische Trage und akustische Methoden20. Mikrofluidik-Methoden können mit drei Ansätzen arbeiten: Mikroverengung, Dehnströmung und Scherströmung. Unter ihnen sind optische Stretcher, optische Pinzetten, akustische Methoden, Dehnströmung und Scherströmungsansätze berührungslose Messungen. Im Gegensatz zu Kontaktmessungen können berührungslose Messungen das Problem der Zellschädigung durch Kontakt oder lokale Verformung effektiv vermeiden. Optische Pinzetten sind sehr empfindlich gegenüber der Messumgebung21. Störungen unter optischen Bedingungen können zu erheblichen Unterschieden in den Messergebnissen führen, und eine hohe Laserleistung während der Messung kann ebenfalls Zellschäden verursachen. Außerdem haben optische Stretcher und optische Pinzetten im Allgemeinen einen niedrigen Durchsatz20,22. Mikrofluidische Methoden wie Extensional Flow und Shear Flow können die Mikromechanik von Tumorzellen nicht direkt messen23. Im Vergleich zu anderen Methoden haben akustische Verfahren die Vorteile der zerstörungsfreien Belastbarkeit, des hohen Durchsatzes und der breiten Anwendbarkeit bei der Messung der Zellmechanik.

Die in diesem Artikel entwickelte Messmethode, die auf einem akustofluidischen Mikrogerät basiert, verwendet berührungslose akustische Strahlungskraft, und der größte Vorteil besteht darin, dass sie die Zellen nicht schädigt, was durch die hier gezeigten experimentellen Ergebnisse bestätigt wurde (Abbildung 9). Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist der hohe Durchsatz, der durch Veränderung der Zellkonzentration eingestellt werden kann. Derzeit kann eine Messgeschwindigkeit von ca. 50-70 Zellen/min erreicht werden, um die Genauigkeit der nachfolgenden Datenanalyse zu gewährleisten. Da die Zellen in Suspension gemessen werden, kann auch die Messung von nicht-adhärenten Zellen erreicht werden, was ihren Anwendungsbereich erweitert. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit eine Messung der Zellkompressibilität nach Bestrahlung durchgeführt, und die Beziehung zwischen Zellkompressibilität und Bestrahlungsdosis wurde aufgezeigt (Abbildung 8). Darüber hinaus kann auch die Messung von Zellen oder Kernen mit unterschiedlicher Steifigkeit angepasst werden, indem die Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und die Breite des Mikrokanals angepasst werden. Wie in Abbildung 7 gezeigt, wurde die Kompressibilität des Kerns gemessen.

Dabei wurde nur die Bewegung der Zellen entlang der Länge und Breite des mikrofluidischen Kanals betrachtet. Die Zellen wurden als in Suspension gehalten, da die Dichte der Zellen nahe an der der Flüssigkeit liegt. Wenn es zu Zellsetzungen oder Reibung mit dem Boden kam, würde dies im anschließenden Trajektorienanpassungsprozess gefunden werden. Solche Daten werden gelöscht. Um die vorgeschlagene Methode zu validieren, wurden zwei Arten von Polystyrolperlen mit unterschiedlichem Durchmesser (6 μm und 10 μm) getestet. Als Kontrolle dienten die Perlen mit 6 μm Durchmesser. Die Kompressibilität von Perlen mit 10 μm Durchmesser wurde als 2,37 ± 0,11 x 10-10 Pa-1 erhalten, was mit dem Wert (2,1-2,4 x 10-10 Pa-1) übereinstimmt, der in einer anderen Forschung15,24 berichtet wurde.

Basierend auf dieser Methode wurde die Kompressibilität von Zellen und Kernen gemessen. Da der Kern eine wichtige Rolle bei der Mechanosensorik und Mechanotransduktion spielt, kann die Messung der mechanischen Eigenschaften des Kerns helfen, besser zu verstehen, wie er auf äußere Reize wie ionisierende Strahlungsinduzierte DNA-Schäden reagiert (Abbildung 8). Darüber hinaus zeigten Experimente, dass die Zellkompressibilität als neuer Indikator für die Überwachung des EMT-Prozesses dienen kann (Abbildung 8), was seine Anwendungsaussichten in der Krebsdiagnose aufzeigt. Da die akustische Strahlungskraft mit Zellgröße, Zelldichte und Kompressibilität zusammenhängt, kann diese Methode auch zur Zellisolierung wie der Trennung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) oder deren Clustern aus der Blutprobe eingesetzt werden. CTCs und ihre Cluster spielen eine wichtige Rolle bei der Früherkennung metastasierender Tumoren und der Überwachung der Wirksamkeit der Strahlentherapie25,26. Daher hat diese Methode große klinische Anwendungsaussichten in der Krebsfrüherkennung und Wirksamkeitsbewertung.

Es ist erwähnenswert, dass der Schlüsselfaktor, der die Messung dieser Methode beeinflusst, die Anpassung der Resonanzfrequenz an die Breite des Mikrokanals ist, was zum Auftreten eines stehenden Wellenknotens an der Mittellinie des Mikrokanals führt. Gleichzeitig sollte auf das Kleben von piezoelektrischer Keramik geachtet werden. Um die Flugbahn von Zellen oder Partikeln genau zu identifizieren und zu verfolgen und das Problem der Zellaggregation aufgrund von Adhäsion zu vermeiden, sollte der Durchsatz nicht zu hoch sein. Wie sich Änderungen anderer Parameter (wie Zellgröße, Zelldichte usw.) auf die Messung der Kompressibilität auswirken, wurde in früheren Arbeitenuntersucht 18. Darüber hinaus ist bei der Messung von Zellkernen aufgrund ihrer Weichheit eine große akustische Strahlungstreibkraft erforderlich, damit sie sich reibungslos zur Mittellinie des Mikrokanals bewegen, so dass eine schnelle Kamera erforderlich ist, um die Flugbahnen genau zu erfassen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen 12075330 und U1932165) und der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Förderkennzeichen 2020A1515010270) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

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References

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Krebsforschung Ausgabe 185
Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät
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Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

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