Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация белков, секретируемых бактериями, со сверхвысоким разрешением с использованием расширения генетического кода

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

В этой статье представлен простой и понятный протокол для маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием расширения генетического кода (GCE) и визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструкционной микроскопии (dSTORM)

Abstract

Системы секреции третьего типа (T3SS) позволяют грамотрицательным бактериям вводить батарею эффекторных белков непосредственно в цитозоль эукариотических клеток-хозяев. При входе введенные эффекторные белки совместно модулируют эукариотические сигнальные пути и перепрограммируют клеточные функции, обеспечивая проникновение и выживание бактерий. Мониторинг и локализация этих секретируемых эффекторных белков в контексте инфекций обеспечивает след для определения динамического интерфейса взаимодействий хозяина и патогена. Однако маркировка и визуализация бактериальных белков в клетках-хозяевах без нарушения их структуры/функции технически сложны.

Построение флуоресцентных слитых белков не решает эту проблему, потому что слитые белки заклинивают секреторный аппарат и, таким образом, не секретируются. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы недавно применили метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки эффекторов, секретируемых бактериями, а также других трудно маркируемых белков с использованием расширения генетического кода (GCE). В этой статье представлен полный пошаговый протокол маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием сайта GCE, за которым следуют указания по визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструирующей микроскопии (dSTORM)

Недавние результаты свидетельствуют о том, что включение неканонических аминокислот (ncAA) через GCE с последующей биоортогональной маркировкой тетразинсодержащими красителями является жизнеспособным методом селективного мечения и визуализации бактериальных секретируемых белков и последующего анализа изображений в организме хозяина. Цель этой статьи — предоставить простой и понятный протокол, который может быть использован исследователями, заинтересованными в проведении визуализации сверхвысокого разрешения с использованием GCE для изучения различных биологических процессов в бактериях и вирусах, а также взаимодействия хозяина и патогена.

Introduction

Бактериальные инфекции долгое время считались серьезной опасностью для здоровья человека. Патогены используют высокоразвитые, чрезвычайно мощные и сложные защитные системы, а также различные факторы бактериальной вирулентности (называемые эффекторными белками) для уклонения от иммунных реакций хозяина и установления инфекций 1,2. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих систем, и роль отдельных эффекторных белков до сих пор в значительной степени неизвестны из-за отсутствия подходящих подходов для непосредственного отслеживания важнейших белковых компонентов и эффекторов в клетках-хозяевах во время патогенеза.

Одним из типичных примеров является Salmonella enterica serovar Typhimurium, который вызывает острый гастроэнтерит. Сальмонелла Typhimurium использует системы секреции третьего типа (T3SS) для инъекции различных эффекторных белков непосредственно в клетки-хозяева. Как только сальмонелла попадает в клетку-хозяина, она находится в кислом мембраносвязанном компартменте, называемом сальмонеллосодержащей вакуолью (SCV)3,4. Кислотный рН SCV активирует T3SS, кодируемый островком патогенности сальмонеллы 2 (SPI-2), и перемещает залп из 20 или более эффекторных белков через вакуолярную мембрану в цитозоль хозяина 5,6,7,8. Внутри хозяина эти сложные коктейли эффекторных белков координируют сигнальные пути клетки-хозяина, что приводит к образованию высокодинамичных, сложных трубчатых мембранных структур, простирающихся от SCV вдоль микротрубочек, называемых сальмонелла-индуцированными филаментами (SIF), которые позволяют сальмонеллам выживать и реплицироваться в клетках-хозяевах9,10,11.

Методы визуализации, отслеживания и мониторинга локализации бактериальных эффекторов, а также изучения их трафика и взаимодействия внутри клеток-хозяев дают критическое представление о механизмах, лежащих в основе бактериального патогенеза. Маркировка и локализация секретируемых сальмонеллой эффекторных белков T3SS внутри клеток-хозяев оказалась технологической проблемой12,13; Тем не менее, разработка генетически кодируемых флуоресцентных белков изменила нашу способность изучать и визуализировать белки в живых системах. Однако размер флуоресцентных белков (~25-30 кДа)15 часто сопоставим или даже больше, чем размер интересующего белка (POI; например, 13,65 кДа для SsaP, 37,4 кДа для SifA). Фактически, флуоресцентная белковая маркировка эффекторов часто блокирует секрецию меченого эффектора и заклинивает T3SS14.

Кроме того, флуоресцентные белки менее стабильны и испускают небольшое количество фотонов перед фотообесцвечиванием, что ограничивает их использование в микроскопических методах сверхвысокого разрешения16,17,18, особенно в фотоактивационной локализационной микроскопии (PALM), STORM и микроскопии с истощением стимулированного излучения (STED). В то время как фотофизические свойства органических флуоресцентных красителей превосходят свойства флуоресцентных белков, методы/методы, такие как CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 и HA-Tags24,25, требуют дополнительного белкового или пептидного придатка, который может нарушить структурно-функциональную функцию интересующего эффекторного белка, препятствуя посттрансляционной модификации или транспортировке. Альтернативный метод, который сводит к минимуму необходимую модификацию белка, включает включение ncAA в POI во время трансляции через GCE. ncAA либо флуоресцентны, либо могут быть сделаны флуоресцентными с помощью клик-химии 12,13,26,27,28.

Используя GCE, ncAA с крошечными функциональными биоортогональными группами (такими как азид, циклопропен или циклооктинная группа) могут быть введены практически в любое место в целевом белке. В этой стратегии нативный кодон заменяется редким кодоном, таким как янтарный (TAG) стоп-кодон в определенной позиции в гене POI. Модифицированный белок впоследствии экспрессируется в клетках вместе с ортогональной парой аминоацил-тРНК-синтетаза/тРНК. Активный сайт тРНК-синтетазы предназначен для получения только одного конкретного ncAA, который затем ковалентно присоединяется к 3'-концу тРНК, распознающему янтарный кодон. ncAA просто вводится в питательную среду, но он должен быть поглощен клеткой и достичь цитозоля, где аминоацил-тРНК-синтетаза (aaRS) может связать его с ортогональной тРНК; затем он включается в POI в указанном месте (см. рис. 1)12. Таким образом, GCE позволяет сайт-специфическое включение множества биоортогональных реакционноспособных групп, таких как кетон, азид, алкин, циклооктин, трансциклоктен, тетразин, норбонен, α, β-ненасыщенный амид и бицикло [6.1.0]-нонин в POI, потенциально преодолевая ограничения традиционных методов маркировки белков 12,26,27,28.

Последние тенденции в методах визуализации сверхвысокого разрешения открыли новые возможности для исследования биологических структур на молекулярном уровне. В частности, STORM, одномолекулярный метод сверхвысокого разрешения, основанный на локализации, стал бесценным инструментом для визуализации клеточных структур с длиной волны до ~ 20-30 нм и способен исследовать биологические процессы по одной молекуле за раз, тем самым открывая роли внутриклеточных молекул, которые еще неизвестны в традиционных исследованиях, усредненных по ансамблю13 . Для одномолекулярных методов и методов сверхвысокого разрешения требуется небольшая метка с яркими, фотостабильными органическими флуорофорами для наилучшего разрешения. Недавно мы продемонстрировали, что GCE можно использовать для включения подходящих зондов для получения изображений сверхвысокого разрешения12.

Двумя лучшими вариантами мечения белков в клетках являются бицикло [6.1.0] нонинлизин (BCN) и транс-циклооктен-лизин (TCO; показан на рисунке 1), которые могут быть генетически кодированы с использованием варианта пары тРНК/синтетаза (здесь называемой тРНК Pyl/PylRS AF), гдеPyl представляет собой пирролизин, а AF представляет собой рационально разработанный двойной мутант (Y306A, Y384F), полученный из Methanosarcina mazei, который естественным образом кодирует пирролизин12. 29,30,31. В ходе реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера с обратным электронным спросом (SPIEDAC) эти аминокислоты хемоселективно реагируют с конъюгатами тетразина (рис. 1)12,30,31. Такие реакции циклоприсоединения исключительно быстры и совместимы с живыми клетками; Они также могут быть флюорогенными, если соответствующий флуорофор функционализирован с тетразиновым фрагментом12,26,32. В данной работе представлен оптимизированный протокол мониторинга динамики бактериальных эффекторов, доставляемых в клетки-хозяева с помощью GCE, с последующей субклеточной локализацией секретируемых белков в клетках HeLa с использованием dSTORM. Результаты показывают, что включение ncAA через GCE с последующей реакцией щелчка с флуорогенными тетразинсодержащими красителями представляет собой универсальный метод селективной маркировки, визуализации секретируемых белков и последующей субклеточной локализации в организме хозяина. Однако все компоненты и процедуры, описанные здесь, могут быть скорректированы или заменены таким образом, чтобы система GCE могла быть адаптирована для исследования других биологических вопросов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Плазмидная конструкция

  1. Клонируйте ген, экспрессирующий POI, в экспрессионную плазмиду (например, pET28a-sseJ 10TAG), которая экспрессирует POI в E. coli BL21 (DE3). Этот шаг облегчает определение того, что мутанты функциональны.
  2. Для визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой, в клетках-хозяевах сконструируют экспрессионную плазмиду (pWSK29-sseJ-HA), которая экспрессирует целевой POI SseJ под контролем своего нативного промотора, как описано в предыдущих отчетах 7,12,24. Используя сайт-направленный мутагенез, замените кодон фенилаланина-10 янтарным кодоном (TAG) в SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), обеспечив мотив AAT-TAG-ACT 33,34.
  3. В дополнение к вышеуказанным плазмидам для генетического включения транс-циклоокт-2-ен-L-лизина (TCO*A) в POI используют другую экспрессионную плазмиду (pEVOL-PylRS-AF)31 , которая содержит эволюционировавшую пару тРНК/синтетаза (тРНКPyl/PylRSAF ) гены, кодируемые в плазмиде pEVOL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание плазмиды и протоколов клонирования описано в предыдущем отчете30,31.
  4. Используйте коммерчески доступные наборы для подготовки плазмид для получения высококачественной плазмидной ДНК. Для очищенной ДНК оптимальное соотношение 260/280 составляет ~1,8. При необходимости проверьте чистоту ДНК с помощью 1% электрофореза в агарозном геле.

2. Подготовка бактериальной культуры

  1. Получение двойных трансформантов для проверки того, что мутант функционирует в E. coli
    1. Выньте компетентные клетки BL21 из -80 °C и разморозьте на льду примерно на 20–30 минут.
    2. Смешайте 1–5 мкл каждой плазмиды (~50 нг pEVOL-PylRS-AF и pET28a-sseJ 10TAG) с 200 мкл химически компетентных клеток BL21 в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Аккуратно смешайте компетентные клетки и плазмидную смесь; Инкубировать 30 мин на льду.
    3. Термический шок микроцентрифужной пробирки на водяной бане 42 °C в течение 45 с. Снова положите трубки на лед на 2 минуты.
    4. Добавьте 1 мл теплой среды LB в микроцентрифужную пробирку и быстро перелейте смесь в коническую пробирку объемом 15 мл. Инкубируют клетки при 37 °C в шейкере при 250 об/мин в течение 1 ч. Наложите некоторую часть или все трансформированные клетки на пластины с агаром LB, содержащие соответствующие антибиотики. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 35 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл канамицина использовали для выбора pEVOL-PylRS-AF и pET28a-sseJ 10TAG соответственно. На этапе преобразования оцените успешную трансформацию с помощью отрицательных и положительных элементов управления.
  2. Перенесите мутант в сальмонеллу для визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой, в клетках-хозяевах:
    1. Добавьте по 2–3 мкл pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG к 40–60 мкл электрокомпетентного штамма Salmonella Typhimurium 14028s в охлажденной микроцентрифужной пробирке. Аккуратно перемешайте смесь пипеткой.
    2. Перелейте электропорационную смесь в охлажденную (зазор между электродами 0,2 см) кювету; установите настройки электропорации на 2,5 кВ, 200 Ω, 25 мкФ. Поместите кювету внутрь электропорационной камеры. Убедитесь, что электрод камеры плотно соприкасается с кюветой микропульсатора.
    3. Нажмите и удерживайте кнопку импульса , пока не раздастся звуковой сигнал.
    4. Сразу же добавьте в кювету 1 мл теплой среды LB. Перенесите все содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл. Инкубируют клетки при 37 °C при встряхивании при 250 об/мин в течение 1 ч.
    5. Нанесите часть или всю электропорационную смесь сальмонеллы на агаровую пластину LB, содержащую соответствующие антибиотики. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 35 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина использовали для отбора pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG соответственно.
  3. Подготовка культуры
    1. Инокулируют одну колонию сальмонеллы или кишечной палочки в 5 мл среды LB, содержащей соответствующие антибиотики. Выращивают в течение ночи при 37 °C, встряхивая при 250 об/мин.

3. Экспрессия и флуоресцентная маркировка ncAA-содержащих белков

  1. Экспрессия ncAA-несущих белков в E. coli
    1. Перенос 100 мкл первичной культуры в 5 мл среды LB (разведение 1:50), содержащей 35 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл канамицина, с последующей инкубацией при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,4–0,6.
    2. Приготовьте 1 мМ исходного раствора TCO*A (10 мл; Таблица 1).
    3. Когда культуры достигнут OD600 = 0,4–0,6, замените среду LB свежей LB, содержащей 1 мМ TCO*A, 35 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл канамицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно приготовить исходный раствор TCO*A, как описано на этапе 5.4.2.
    4. Индуцируют экспрессию белка в присутствии 1 мМ IPTG, 0,2% арабинозы и взбалтывают в течение ночи при 34 ° C, 250 об/мин. Собирают бактериальные клетки центрифугированием в течение 5 мин при 11 000 × г. Удалите надосадочную жидкость и заморозьте гранулы при -20 °C до дальнейшего использования.
    5. Для контрольного эксперимента повторите тот же эксперимент, но экспрессируйте ncAA-несущие белки в отсутствие ncAA. Для флуоресцентной маркировки in vitro ncAA-содержащих белков в E. coli следуйте подробной процедуре, описанной на шаге 3.3.
  2. Экспрессия ncAA-содержащих белков в сальмонеллах
    1. Перенос 100 мкл первичной культуры в 5 мл среды LB (разведение 1:50), содержащей 35 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина, с последующей инкубацией при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,6.
    2. Приготовьте модифицированную среду с минимальным содержанием азота (MgM, рН 5,6), как описано в таблице 1.
    3. Заменить среду LB модифицированной N-минимальной средой (MgM) с добавлением 1 мМ TCO*A (таблица 1). Выращивайте бактерии при 34 ° C в течение 30 минут. Затем добавьте 0,2% арабинозы, 25 мг/мл хлорамфеникола и 100 мг/мл ампициллина и выращивайте клетки еще 6 часов, встряхивая при 250 об/мин.
    4. Через 6 ч бактерии промывают 4 раза с интервалом 30 мин свежими средами MgM (pH 5,6) (таблица 1) без ncAA. На этапах стирки используйте 972 × г в течение 15 минут при комнатной температуре.
    5. Центрифугируют бактерии, ресуспендируют в 1x буфере PBS и инкубируют в течение 1 ч при 4 ° C в темноте, чтобы удалить избыток ncAA. Через 1 ч бактерии центрифугируют при 3000 × г, 4 °C в течение 15 мин и хранят для дальнейшего использования.
    6. Для контрольного эксперимента повторите тот же эксперимент, экспрессируя ncAA-несущие белки в отсутствие ncAA.
  3. Флуоресцентное мечение in vitro ncAA-содержащих белков в Salmonella Typhimurium
    1. Ресуспендирование клеток сальмонеллы , экспрессирующих SseJ-F10TCO-HA в отсутствие или присутствии TCO*A (с шага 3.2) в 1x PBS. Отрегулируйте OD600 на 4 в PBS. Инкубируют клетки с 20 мкМ Janelia Fluor 646-тетразином (JF646-Tz) или 20 мкМ BDP-Fl-тетразином (5 мМ исходных растворов в ДМСО) при 37 ° C в темноте и встряхивают в течение 1–2 ч при 250 об/мин.
    2. Гранулируют клетки, промывают 3–4 раза PBS, содержащим 5% ДМСО и 0,2% Pluronic F-127, ресуспендируют в PBS, содержащем 5% ДМСО, и инкубируют в течение ночи при 4 ° C в темноте. Снова постирайте 2 раза с 1x PBS. На этапах стирки используйте 972 × г в течение 15 минут при комнатной температуре.
    3. Немедленно визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа или зафиксируйте их 1,5% параформальдегидом (PFA) в PBS в течение 30–45 минут при комнатной температуре в темноте.
    4. Промойте фиксированные ячейки 2 раза с помощью PBS и, наконец, в 50 мМ NH4Cl в PBS в течение 15 минут, чтобы удалить избыток PFA. Ресуспендируют клетки в PBS и хранят при температуре 4 °C не более 3–4 дней. Визуализируйте бактерии с помощью конфокальной микроскопии, как описано в разделе 6.

4. Биохимическая характеристика ncAA-содержащих белков

  1. Лизис клеток
    1. Ресуспендируют клетки из секции 3.1 в буфере лизиса (таблица 1) и инкубируют при комнатной температуре более 30 мин. Охладите смесь на льду в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение буфера лизиса к массе клетки должно составлять 1:10.
    2. Обработайте ресуспендированные клетки ультразвуком, пока они еще находятся на льду. Пульсируйте в течение 30 с при настройке 7 не менее 6x, с 1-минутными промежутками, используя ультразвуковой аппарат (см. Таблицу материалов).
    3. Отжимайте клеточный лизат при 20 500 × г, 4 ° C в течение 15 мин (поддержание 4 ° C имеет решающее значение). Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбросьте гранулы.
  2. Анализ SDS-PAGE
    1. Приготовьте 5-кратный загрузочный краситель SDS (таблица 1). Добавьте 5 мкл буфера загрузки геля SDS к 13 мкл клеточного лизата. Денатурируют белки с помощью буфера для образца додецилсульфата натрия (SDS) в пробирке объемом 2 мл при 95 ° C в течение 10 мин, центрифугируют смесь при 2000 × г в течение 50 с и загружают в 12% полиакриламидный гель SDS.
    2. Соберите гелевую кассету, поместите ее в аппарат для гель-электрофореза и подключите аппарат для электрофореза к источнику питания. Залейте проточный буфер, загрузите маркеры молекулярной массы и образцы белка и запустите гель при 100 В, пока бромфенол не достигнет дна рассасывающего геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приступайте к анализу, так как лизаты, хранящиеся при -20 °C, имеют тенденцию терять качество после каждого цикла замораживания-оттаивания.
    3. Испачкайте гель синим протеиновым пятном Coomassie.

5. Биоортогональная маркировка секретируемого сальмонеллой эффектора SseJ-F10TCO-HA в клетках HeLa

  1. Культивируйте и поддерживайте клетки HeLa при 37 °C, 5% CO2 и влажности 95% в модифицированной среде орла Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (4,5 г / л) с добавлением 10% (об. / об.) FBS в дополнение к пенициллину-стрептомицину (1x).
  2. Культивируют бактерии за 1 день до заражения. Инокулируют одну колонию Salmonella 14028s, содержащую pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG, в 5 мл стандартного бульона LB, содержащего антибиотики, на ночь при 37 ° C, встряхивая при 250 об/мин.
  3. Посев клеток HeLa за 1 день до заражения. Возьмите колбу для культивирования тканей (T-75), содержащую клетки HeLa при ~ 80% слиянии, что определяется микроскопическим исследованием плотности клеток. Промойте клетки теплым PBS. Отделите клетки 3 мл теплого 0,25% трипсина / ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° C, 5% CO2.
    1. Погасить трипсин с помощью 2 мл DMEM (+ 10% FBS). Перенесите все содержимое колбы в пробирку объемом 15 мл после ресуспендирования клеток. Раскручивайте клетки при дозе 1000 × г в течение 5 мин. Выньте надосадочную жидкость из трубки. Ресуспендируйте гранулы клеток HeLa в предварительно подогретой питательной среде.
    2. Используйте гемоцитометр для исследования суспензии и подсчета присутствующих клеток. Приготовьте разбавленный клеточный запас из расчета 1 × 105 клеток/мл. Затравка 0,5 × 105 клеток HeLa на лунку в 500 мкл ДМЕМ + 10% питательной среды FBS в восьмилуночном предметном стекле. Хранить предметное стекло в инкубаторе при температуре 37 °C, 5% CO2, влажности 95% в течение 24 часов.
  4. Бактериальная инфекция
    1. Субкультуру Salmonella 14028s, содержащую pEVOL-PylRS-AF и pWSK29-sseJ 10TAG, путем разбавления 100 мкл ночной бактериальной культуры (со стадии 5.2) в 3 мл среды LB (разведение 1:30), содержащей 35 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина, с последующей инкубацией при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин в течение 5–7 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой фазы культуры достигают поздней экспоненциальной фазы, и бактерии очень инвазивны.
    2. Приготовьте исходный раствор TCO*A емкостью 100 мМ и готовую среду (таблица 1).
    3. Чтобы инициировать инфекцию клеток HeLa, выньте клетки HeLa из инкубатора и промойте клетки предварительно подогретым DPBS перед добавлением 500 мкл свежего DMEM (+10% FBS) в каждую лунку. Поместите горку камеры обратно в инкубатор CO2 до тех пор, пока не начнется инфекция.
    4. После 5–7 ч инкубации разбавьте культуру сальмонеллы до OD600 = 0,2 в 1 мл питательной среды DMEM (~ 3 × 108 КОЕ / мл). Добавьте необходимое количество инокулята сальмонеллы в каждую лунку горного стекла камеры, чтобы кратность инфекции (MOI) равнялась 100.
    5. Инкубируйте инфицированные клетки в инкубаторе CO2 в течение 30 минут. Промойте клетки 3 раза предварительно подогретым DPBS, чтобы удалить внеклеточную сальмонеллу. Установите этот момент времени на 0 ч после заражения. Добавьте 500 мкл полной среды (таблица 1), содержащей 100 мкг/мл гентамицина в течение 1 ч. Через 1 ч промойте клетки 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 500 мкл готовой среды (начиная с этапа 5.4.2; Таблица 1) дополняется 0,2% арабинозой, 10 мкг/мл гентамицина в каждую лунку предметного стекла камеры.
    6. В контрольном эксперименте выполняли аналогичные инфекции клеток HeLa без TCO*A.
    7. Инкубируйте предметное стекло камеры в течение 10 ч в инкубаторе CO2 .
  5. Щелкните химическую маркировку в живых клетках
    1. Приступайте к маркировке зараженных бактериями клеток. Предварительно разогрейте всю среду без TCO*A (таблица 1).
    2. Через 10 ч после заражения замените полную среду свежей полной средой без TCO*A и промойте клетки HeLa 4 раза с интервалом 30 мин каждая предварительно подогретым DPBS, а затем свежей полной средой (без TCO*A).
    3. Приготовьте 0,5 мМ раствор красителя и тетразина в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой в клетках-хозяевах, представлены два протокола. Для протокола 1 приготовьте смесь красителей, разбавив сырье JF646-Tz в 1x PBS, содержащем 1% натриевой соли казеина из бычьего молока, чтобы конечный рабочий раствор составлял 2 мкМ. Для протокола 2 приготовьте теплую полную среду (без FBS и TCO*A) и добавьте 2 мкМ JF646-Tz. Освежайте эту смесь красителей для каждого сеанса маркировки. Работайте в темноте, если это возможно (приглушите свет в вытяжке и/или комнате).
    4. Через 12 ч после заражения аспирировать среду из клеток. Вымойте клетку предварительно разогретым DPBS 2x или 3x. В одну группу лунок добавляют 500 мкл смеси раствора красителя, описанной в протоколе 1, а в другую группу лунок того же предметного стекла камеры добавляют 500 мкл смеси раствора красителя, описанной в протоколе 2, упомянутой в шаге 5.5.3 и примечании после него. Поместите камеру обратно в инкубатор CO 2 на 1,5–2 часа.
    5. Через 13,5–14 ч после заражения промойте клетки HeLa 2 раза предварительно подогретым DPBS. Добавьте 500 мкл свежего DMEM (с добавлением FBS). Поместите горку камеры обратно в инкубатор на 30 минут. Промойте клетки предварительно подогретым DPBS, а затем свежим DMEM 4x с интервалом в 30 минут.
    6. Через 16 часов после заражения зафиксируйте клетки HeLa с помощью PFA, добавив 200 мкл 4% PFA в каждую лунку и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Аспирируйте PFA, промойте 3 раза PBS и храните ячейки в PBS при температуре 4 ° C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PFA является высокотоксичным химическим веществом. Избегайте вдыхания, а также контакта с кожей и глазами. При обращении надевайте защитное снаряжение. Чтобы меченый образец не подвергался воздействию света, выключите свет в вытяжке клеточной культуры.
  6. Иммуноокрашивание белков, меченных ГК
    1. Отспирируйте PBS и промойте один раз в блокирующем растворе (таблица 1).
    2. Инкубируют фиксированные клетки HeLa с раствором первичных антител на основе PBS (таблица 1) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Используйте первичное антитело кролика против HA для окрашивания секретируемого SseJ (разведение 1:500).
    3. Через 1 ч аккуратно промойте клетки 2 раза 0,5 мл 0,1% Tween-20/1x PBS. Во время промывания раствором Tween/PBS инкубируйте клетки 3x с 0,5 мл 0,1% Tween20/1x PBS в течение 5 мин.
    4. Вторичное антитело развести ослику антикролик 555 1:500 в растворе вторичных антител и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    5. Через 1 ч аккуратно промойте клетки 2 раза 0,5 мл 0,1% Tween-20/1x PBS и инкубируйте 2x с 0,5 мл 0,1% Tween20/1x PBS в течение 5 мин.
    6. Промойте клетки 3 раза 0,5 мл 1x PBS и храните их при температуре 4 ° C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные ячейки можно хранить в течение нескольких недель в PBS при температуре 4 °C. Иммуноокрашивание должно быть выполнено в последнюю минуту.

6. Конфокальная визуализация

  1. Используйте конфокальный микроскоп, такой как вращающийся диск (SD) или микроскоп STED.
    1. Отрегулируйте параметры получения изображений, такие как режим сканирования (XYZ), скорость сканирования (400 Гц), разрешение (512 x 512), увеличение (100x) и Z-стекирование.
    2. Используйте правильные фильтры возбуждения/излучения для тетразина DAPI, BDP-Tz и JF646.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола конфокальная визуализация была выполнена на системе микроскопа STED, оснащенной импульсным лазером белого света, позволяющим выбирать возбуждение в диапазоне 470–670 нм и УФ-диодным лазером 405 нм для возбуждения на длине волны 405 нм, 488 нм и 647 нм. Соответствующие диапазоны излучения были установлены с помощью встроенного акустооптического светоделителя в сочетании с перестраиваемым многополосным спектральным детектированием конфокальной системы на основе призмы.
    3. Получайте изображения с помощью объектива с масляным погружением 100×/1.4.

7. Визуализация сверхвысокого разрешения (dSTORM)

  1. Включите микроскоп за 3 часа до получения изображения, чтобы обеспечить тепловое равновесие (дрейф более вероятен, если визуализация начинается до этого). Охладите камеру до -70 °C.
  2. Тем временем подготовьте свежий буфер визуализации GLOX-BME (таблица 1).
  3. Поднесите клетки к микроскопу. Поместите камеру визуализации на столик микроскопа в держателе образца. В держателе убедитесь, что образец плоский и надежный. Замените среду в лунке на 0,4 мл свежеизготовленного буфера визуализации GLOX-BME.
  4. Установите правильную лазерную линию и наборы фильтров. Уменьшите мощность лазера до ~ 1 мВт, чтобы идентифицировать интересующую ячейку HeLa. Отрегулируйте фокальную плоскость и угол лазерного луча при освещении образца с низкой плотностью лазера 647 нм (в этом случае предлагается круто наклоненный угол [HILO], поскольку HILO повышает сигнал к фону [SBR]). Отрегулируйте угол освещения HILO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе изображение SseJ со сверхвысоким разрешением было получено в канале Alexa Fluor 647 с использованием инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов), оснащенного объективом TIRF (100-кратный масляный иммерсионный объектив Apo TIRF, NA 1.49). Флуоресценция была обнаружена с помощью камеры EMCCD, которая управлялась через μManager.
  5. Установите коэффициент усиления предусилителя на 3 и активируйте передачу кадров в μManager. Установите коэффициент усиления ЭМ на 200 для более высокой чувствительности при измерениях dSTORM, как описано в предыдущем отчете35.
  6. Перед визуализацией dSTORM сделайте контрольное изображение целевой структуры с ограниченной дифракцией. Переключите флуорофоры в темное состояние, включив лазер на максимальную мощность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные, быстро мигающие молекулы флуорофоров JF646 наблюдались, когда флуорофоры JF646 были преобразованы в преимущественно темное состояние при непрерывном освещении возбуждающим светом 647 нм, как описано ранее36.
  7. Отрегулируйте мощность лазера до подходящего уровня, при котором мигающие события разделены в пространстве и времени, установите время экспозиции на 30 мс и начните съемку. Приобретите 10 000–30 000 кадров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения мощности лазера должны быть сделаны для оптимизации мигания. Рассмотрите возможность увеличения интенсивности лазера, если обнаружено слишком много событий (мигающих частиц, которые перекрываются). Идеальная длина зависит от качества образца, но ~ 10 000 кадров должны показывать заметные особенности.

8. Реконструкция изображения dSTORM

  1. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ThunderSTORM, одна из многих доступных программ реконструкции изображений с открытым исходным кодом, кратко описана ниже.
  2. Откройте ImageJ и импортируйте необработанные данные. Откройте плагин ThunderSTORM и настройте параметры камеры, соответствующие устройству.
  3. Перейдите в раздел «Выполнить анализ » и установите соответствующие настройки, такие как фильтрация изображений (разница фильтров усреднения), методы локализации (локальный максимум) и субпиксельная локализация молекул (интегрированный гауссов PSF). Нажмите кнопку ОК , чтобы начать реконструкцию образа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости уже была описана подробная инструкция по настройке параметров в ThunderSTORM37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протокольном документе описывается основанный на GCE метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки и визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой , как показано на рисунке 1. Химическая структура несущей ncAA трансциклооктеновой биоортогональной группы (ТСО) и флуоресцентного красителя показана на рисунке 1А. Маркировка SseJ была достигнута путем генетического включения биоортогональных ncAA в янтарный стоп-кодон (см. рис. 1B) с использованием ортогональных пар аминоацил-тРНК-синтетаза/тРНК с помощью технологии GCE. Обработка эффекторов, меченных TCO, тетразином, содержащим флуорофор (JF646-Tz или BDP-Tz), обеспечила альтернативную стратегию маркировки белка, которая позволила наблюдать транслокированные эффекторы, секретируемые сальмонеллой , через много часов после инфицирования хозяина (рис. 1B, C). Мы начали с определения возможных аминокислотных остатков и выбрали позицию 10 SseJ для включения ncAA на основе доступности поверхности и существующих знаний о функциональных остатках SseJ. Предварительные структурные данные и прогнозы воздействия на поверхность могут помочь в выборе конкретных мест.

Размещение янтарного кодона в гене, кодирующем POI, влияет на эффективность включения TCO. В результате должна быть создана серия мутантов с янтарными кодонами в различных положениях гена POI и проанализирована для оптимальной эффективности интеграции. Выбор положения янтарного кодона является эмпирическим. Как правило, измененные остатки должны быть несущественными для функции POI, лишенными посттрансляционных модификаций и доступными для флуоресцентных зондов. Плазмида экспрессии должна иметь низкое число копий, чтобы она имитировала номер собственной копии POI. Контекст кодона влияет на то, насколько эффективно ncAA инкорпорируется ортогональной системой тРНК/аминоацил-тРНК-синтетазы. В то время как AAT-TAG-ACT является предпочтительным контекстом ортогональной тРНК, положение фенилаланина-10 sseJ было изменено на TAG, обеспечивая контекст AAT-TAG-ACT для обеспечения наиболее эффективного включения ncAA. Во-первых, мы проверили, функционируют ли мутанты в E. coli, используя плазмиду с высоким числом копий для экспрессии sseJ. Как свидетельствует SDS-PAGE, экспрессия мутантов SseJ-F10TCO-HA зависела от наличия TCO*A и соответствующей оптимальной тРНК/aaRS (рис. 2A). SseJ-F10FCO-HA был помечен JF646-Tz с использованием клик-химии SPIEDAC в E. coli. Селективная флуоресцентная маркировка SseJ-F10TCO-HA в E. coli in vitro была подтверждена анализом флуоресцентной микроскопии (рис. 2B). Таким образом, при использовании GCE TCO*A был включен в янтарный кодон в sseJ. Попытки напрямую идентифицировать геномное нецелевое включение ncAA с использованием системытРНК Pyl/PylRS AF не дали никаких доказательств их существования. Тем не менее, мы рекомендуем использовать флуоресценцию в геле, вестерн-блоттинг, флуоресцентный слитый белок, флуоресцентную маркировку in vitro и другие методы для оценки эффективности, специфичности, степени нецелевого включения и токсичности плазмиды pEVOL, как задокументировано в ранее опубликованных работах, цитируемых здесь12,29.

После того, как мы установили, что подавленный TAG в sseJ был функциональным, мы клонировали sseJ-F10TCO-HA вместе с его нативным промотором в плазмиду pWSK29 с низким числом копий, обеспечивая мотив AAT-TAG-ACT для флуоресцентной маркировки и визуализации. Селективная маркировка in vitro SseJ-F10TCO-HA в клетках сальмонеллы была подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 3). Затем мы инфицировали клетки HeLa штаммом сальмонеллы дикого типа, дополненным p sseJ-HA или p sseJ 10TAG-HA, в отсутствие или присутствии TCO*A, чтобы определить, может ли TCO-инкорпорированныйSseJ быть транслоцирован в клетки-хозяева. Инфицированные клетки HeLa фиксировали с помощью PFA и иммуноокрашивали антителами против HA через 16 часов после заражения, чтобы выделить SIF, украшенные SseJ. Как показано на рисунке 4C, SseJ-F10TCO-HA, очевидно, секретировался, образовывались SseJ-зависимые SIF, и они были похожи на те, которые наблюдались в инфицированных клетках дикого типа (рис. 4A). Однако SseJ-зависимые SIF не наблюдались в отсутствие TCO*A (рис. 4B). Эти наблюдения показали, что экспрессия sseJ-F10TCO-HA с использованием GCE спасла SseJ-зависимые SIF. Кроме того, результаты также показали, что SseJ-F10TCO-HA является полностью функциональным фактором вирулентности сальмонеллы.

После подтверждения того, что меченный GCE SseJ был функциональным и секретируемым, мы использовали реакцию SPIEDAC для маркировки SseJ-F10TCO-HA JF646-Tz в клетках HeLa. Для этого мы инфицировали клетки HeLa сальмонеллой дикого типа, дополненной p sseJ-F10TCO-HA, в присутствии TCO*A. После маркировки JF646-Tz с использованием двух альтернативных протоколов, описанных в разделе протокола 5, клетки тщательно промывали для удаления излишков красителя, фиксировали PFA и иммуноокрашивали антителом против HA для визуализации секретируемого SseJ-F10TCO-HA. SseJ-F10TCO-HA, секретируемый в цитоплазму клеток HeLa, был помечен JF646-Tz (рис. 5A, B, красный) и четко локализован совместно с HA-меткой (зеленый). Наблюдение за тем, что две метки перекрывались друг с другом (одна флуоресцентный краситель, другая помечена иммуноокрашиванием), еще раз подчеркивает специфичность маркировки GCE.

Чтобы убедиться, что сигнал флуоресценции, наблюдаемый в этих клетках HeLa, был специфичен только для секретируемого эффектора SseJ, мы инфицировали клетки сальмонеллой дикого типа (несущей psseJ-HA) в присутствии TCO*A и pEVOL-PylRS-AF. Щелкающий краситель использовался, чтобы наблюдать, есть ли какая-либо фоновая маркировка в клетках HeLa. SseJ высвобождался в цитоплазму клетки-хозяина без внутриклеточных или неспецифических флуоресцентных сигналов (рис. 5C), демонстрируя, что сигнал флуоресценции был специфичен для SseJ. После определения того, что ncAA были включены специфически в янтарный кодон и что секретируемый SseJ может быть визуализирован в клетке-хозяине с помощью реакции щелчка, следующей целью было создание изображения секретируемого SseJ в клетках HeLa со сверхвысоким разрешением (рис. 6). На рисунке 6 мы демонстрируем мощь GCE и использование красителя JF646 для создания сайт-специфических изображений сверхвысокого разрешения секретируемого эффектора сальмонеллы SseJ в клетках HeLa.

Figure 1
Рисунок 1: Схема сайт-специфической флуоресцентной маркировки эффекторов SPI-2. (А) TCO*A и JF-646-тетразин. (B) На схеме изображено включение ncAA в эффектор SPI-2. В бактериальную клетку вводят плазмиду, содержащую ген эффекторного POI (фиолетовый) и ортогональную супрессорную пару тРНК (красный)/аминоацилсинтетаза (зеленый). Нативный кодон заменяется желтым (TAG, красным) стоп-кодоном в последовательности эффекторных генов в разрешающем месте. ncAA (темно-красный круг) просто вводится в питательную среду. Затем он улавливается клеткой и достигает цитозоля, где связывается с ортогональной тРНК аминоацил-тРНК-синтетазой (aaRS). ncAA-ацилированная тРНК с антикодоном CUA входит в рибосомный механизм в результате комплементарного янтарного кодона на эффекторной мРНК (фиолетового), включая присоединенный ncAA в эффектор. ncAA переносится полноразмерной полипептидной цепью эффекторного сайта, которая затем сворачивается и собирается в функциональный эффекторный белок. Вновь продуцируемый эффектор транслоцируется в клетку-хозяина через T3SS. Флуорофор, поставляемый извне, может быть использован для маркировки секретируемого эффектора SPI-2, интегрированного с ncAA. (C) Схема клик-реакции без меди с флуорогенным тетразиновым красителем. В результате реакции щелчка SPIEDAC ncAA с напряженной алкеновой группой, включенной в POI (SseJ), реагирует с красителем, связанным с тетразином (JF646-Tz). Флуорогенный, связанный с тетразином краситель JF646-Tz становится флуоресцентным (красным) только после успешной маркировки. Сокращения: TCO*A = транс-циклоокт-2-ен-L-лизин; ncAA = неканоническая аминокислота; T3SS = система секреции третьего типа; SPI-2 = остров патогенности сальмонеллы 2; POI = интересующий белок; SPIEDAC = циклоприсоединение Дильса-Альдера с обратным электронным требованием, способствующее деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: TCO*A специфически включен в SseJ-F10TCO-HA, экспрессируемый в E. coli. (A) SDS-PAGE, окрашенный по Кумасси, подтверждает селективное включение TCO*A в SseJ-F10TCO-HA (обозначено красной стрелкой) in E. coli. (B) Экспрессия SseJ-F10TCO-HA в E. coli анализируется с помощью флуоресцентной микроскопии в отсутствие (вверху) или присутствии (внизу) 1 мМ TCO*A. Клетки кишечной палочки, экспрессирующие SseJ-F10TCO-HA в отсутствие или присутствии TCO*A, инкубируют с BDP-Fl-тетразином и визуализируют для флуоресценции BDP (зеленый). Флуоресценция SseJ (зеленая) наблюдается только в присутствии включенной метки TCO*A; Обратите внимание на отсутствие фоновой флуоресценции на верхней панели. Масштабная линейка = 2 мкм. Сокращения: TCO*A = транс-циклоокт-2-ен-L-лизин; BF = светлое поле; ГК = гиалуроновая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: TCO*A специфически включен в SseJ-F10TCO-HA, экспрессируемый в сальмонелле. Флуоресцентная микроскопия используется для изучения экспрессии SseJ-F10TCO-HA в сальмонелле в отсутствие (вверху) или в присутствии (внизу) 1 мМ TCO*A. Сальмонеллы , экспрессирующие SseJ F10TCO-HA, обрабатывают JF646-Tz и визуализируют на флуоресценцию JF646 (пурпурную) в присутствии или отсутствии TCO*A. Флуоресценция SseJ (пурпурная) обнаруживается только при наличии TCO*A. Масштабная линейка = 2 мкм. Сокращения: TCO*A = транс-циклоокт-2-ен-L-лизин; BF = светлое поле; ГК = гиалуроновая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Секретируемый SseJ-J10TCO-HA функционирует. (A) Клетки HeLa инфицированы сальмонеллой, содержащей psseJ-HA в течение 16 часов, фиксированы и иммуноокрашены антителами против HA (красный), LPS (зеленый) и DAPI (синий). Как и ожидалось, в инфицированных клетках наблюдается образование SseJ-зависимых SIF. (B) В отсутствие TCO*A янтарный кодон не подавляется, а SseJ-зависимые SIF отсутствуют в инфицированных клетках HeLa. Клетки HeLa инфицированы сальмонеллой, экспрессирующей SseJ-F10TCO-HA в отсутствие TCO*A в течение 16 часов, фиксируются и иммуноокрашиваются антителами против HA (красный), LPS (зеленый) и DAPI (синий). (C) SseJ-зависимые SIF наблюдаются в присутствии TCO*A. Инфицированные клетки HeLa с сальмонеллой, экспрессирующей SseJ-F10TCO-HA в присутствии 400 мкМ TCO*A, фиксируются и иммуноокрашиваются антителами против HA SseJ (красный), LPS (зеленый) и DAPI (синий). SseJ-зависимые SIF наблюдаются на левой панели, что ясно указывает на то, что SseJ был спасен экспрессией sseJ-F10TCO-HA с использованием GCE. Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: ГК = гиалуроновая кислота; ЛПС = липополисахарид; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; TCO*A = транс-циклоокт-2-ен-L-лизин; SIFs = филаменты, индуцированные сальмонеллой; GCE = расширение генетического кода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Специфичность маркировки SseJ красителем JF646-Tz. (A) Клетки HeLa инфицированы сальмонеллой , экспрессирующей SseJ-F10TCO-HA в присутствии 400 мкМ TCO*A. Секретируемый SseJ-F10TCO-HA с меткой TCO мечен 2 мкМ JF646-Tz в 1x PBS, содержащем 1% натриевой соли казеина из коровьего молока, тщательно промытый, фиксированный и иммуноокрашенный антителом против HA для визуализации секретируемого SseJ (зеленый). SseJ-F10TCO-HA секретируется и маркируется красителем JF646-Tz (красный, левая панель). SseJ, помеченные через GCE (красный) и HA (зеленый), четко локализованы (правая панель). (B) Используя несколько иной протокол маркировки, секретируемый TCO-меченый SseJ-F10TCO-HA также мечут 2 мкМ JF646-Tz в полной среде DMEM (без FBS), тщательно промывают и фиксируют, а также подвергают иммунофлуоресцентному окрашиванию против ГК. Секретируемый SseJ-F10TCO-HA помечен красителем JF646-Tz (красный, левая панель) и локализован совместно с HA (зеленый). (C) Чтобы дополнительно установить, что сигнал флуоресценции уникален для SseJ и не является продуктом других белков, высвобождаемых SPI-2, клетки HeLa инфицируют сальмонеллой дикого типа, несущей psseJ-HA и pEVOL-PylRS-AF, в присутствии ncAA (TCO*A). Через 16 ч после заражения инфицированные клетки HeLa обрабатывают 2 мкМ JF646-Tz в полной среде (без FBS и TCO*A), а излишки красителя тщательно удаляют с помощью новой питательной среды. Клетки HeLa фиксируются PFA и тщательно промываются PBS перед иммуноокрашиванием на SseJ (зеленый). Отсутствие видимого фонового флуоресцентного сигнала на левой панели (JF646-Tz) указывает на то, что в клетках-хозяевах почти не происходило внецелевой маркировки. Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: ГК = гиалуроновая кислота; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; FBS = эмбриональная бычья сыворотка; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; TCO*A = транс-циклоокт-2-ен-L-лизин; SIFs = филаменты, индуцированные сальмонеллой; GCE = расширение генетического кода; SPI-2 = остров патогенности сальмонеллы 2; BF = светлое поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Визуализация SseJ, меченного GCE, сверхвысокого разрешения в клетках HeLa. Клетки HeLa инфицируются сальмонеллой , экспрессирующей SseJ-F10TCO-HA в присутствии 400 мкМ TCO*A. Секретируемый TCO-меченый SseJ-F10TCO-HA мечают 2 мкМ JF646-Tz в физиологических условиях, как описано в протоколе, а затем тщательно промывают. Снимки получены с помощью Nikon N-STORM. (A) Изображение яркого поля наблюдаемой клетки HeLa. Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Дифракционно-ограниченное широкопольное изображение секретируемого SseJ, меченного TCO*A и JF-646. Масштабная линейка = 10 мкм. (C) Соответствующее изображение dSTORM SIF, украшенных SseJ. Масштабная линейка = 10 мкм. Врезка C(i) показывает увеличенное изображение SseJ со сверхразрешением в коробочной области. Масштабная линейка = 1 мкм. Сокращения: ГК = гиалуроновая кислота; TCO*A = транс-циклоокт-2-ен-L-лизин; SIFs = филаменты, индуцированные сальмонеллой; GCE = расширение генетического кода; WF = широкоугольный; BF = светлое поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1. Решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой таблицы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Подход, описанный в настоящем описании, был использован для отслеживания точного местоположения эффекторных белков, введенных в клетку-хозяина бактериальным T3SS после инфицирования. T3SS используются внутриклеточными патогенами, такими как сальмонелла, шигелла и иерсиния, для транспортировки компонентов вирулентности в хозяина. Развитие технологий визуализации сверхвысокого разрешения позволило визуализировать факторы вирулентности с невообразимым ранее разрешением12,13,24. Однако определенные ограничения маркировки препятствовали более глубокому исследованию, поскольку фотоактивируемые слияния белков блокируют поры T3SS и не секретируются. Кроме того, артефакты кластеризации и ошибочный анализ могут быть результатом присущей некоторым слитым белкам склонности к кластеризации или агрегации.

В некоторых случаях слитый белок также расщепляется, как мы наблюдали ранее с PAmCherry-SsaP12,13. Все эти ограничения преодолеваются GCE, который позволяет проводить флуоресцентную маркировку POI для конкретного сайта. Это также позволяет визуализировать белки, которых не так много12,13. Хотя существует ряд факторов, которые могут повлиять на эффективность включения ncAA с использованием ортогональной системы тРНК/аминоацил-тРНК-синтетазы, представляется, что контекст кодона является наиболее важным. Ортогональная тРНК включает ncAA наиболее эффективно, когда предпочтительным контекстом кодона является AATTAGACT33. На рисунке 5 мы можем сравнить четкую маркировку, полученную в результате GCE и сайт-специфического флуорофора (а также отсутствие фона) по сравнению с иммуноокрашиванием HA-метки.

В результате исследователи смогут визуализировать POI в патогенах, комменсальных бактериях и эукариотических хозяевах, используя метод, описанный здесь. Короче говоря, генетически кодируемые ncAA обеспечивают альтернативный подход к мечению эффекторных белков, когда традиционные методы терпят неудачу. Однако одним из основных ограничений этого метода являются присущие флуорофору химические свойства, такие как проницаемость, распределение и удержание мембраны, которые могут влиять на эффективность флуоресцентной маркировки. Флуоресцентные ncAA являются альтернативным вариантом, позволяющим избежать реакцийщелчка 12, однако их можно визуализировать только с помощью двухфотонной микроскопии. Читатели отсылаются к списку клеточно-мембранопроницаемых/непроницаемых красителей, приведенному здесь 12,38,39,40,41.

В заключение, мы специально маркировали и визуализировали секретируемый сальмонеллой эффектор SseJ путем генетического кодирования ncAA в сочетании с флуорогенным флуорофором без нарушения его биологической функции. Маркировка SseJ JF646-Tz была высокоспецифичной, и визуализация сверхвысокого разрешения может быть дополнительно использована для визуализации секретируемых эффекторов внутри клеток-хозяев. Таким образом, флуоресцентная маркировка бактериальных эффекторов с использованием dSTORM-совместимых красителей и расширение генетического кода позволили провести субклеточную пространственную локализацию эффекторов, секретируемых бактериями, в клетках-хозяевах с разрешением ниже дифракционного предела. Поскольку эта платформа маркировки совместима с отслеживанием отдельных частиц с визуализацией живых клеток, наш метод позволит анализировать эффекторные белки системы T3SS с беспрецедентными уровнями временного и пространственного разрешения, что улучшит наше молекулярное понимание бактериального патогенеза.

Несмотря на то, что существуют определенные ограничения, такие как низкая эффективность включения ncAA и фотофизические ограничения органического фторофора, мы продемонстрировали, что этот подход может помочь исследователям наблюдать и локализовать секретируемый эффектор внутри клеток-хозяев, даже когда его мало12,13. Мы ожидаем, что адаптация технологии откроет новые и захватывающие возможности для визуализации и исследований других эффекторных белков, продуцируемых бактериями во время инфекции. Метод также легко адаптируется для маркировки вирусов, демонстрируя свою широкую полезность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана стартовыми фондами медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне, штат Техас, и наградой Texas STAR для L.J.K. Мы благодарим профессора Эдварда Лемке (Европейская лаборатория молекулярной биологии, Гейдельберг, Германия) за плазмиду pEVOL-PylRS-AF. Изображения на рисунке 1 были созданы с помощью BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Tags

Биология выпуск 192 Сальмонелла неканонические аминокислоты расширение генетического кода SseJ сверхразрешение dSTORM
Визуализация белков, секретируемых бактериями, со сверхвысоким разрешением с использованием расширения генетического кода
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M. K., Kenney, L. J.… More

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter