Summary
Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır
Abstract
Tip üç sekresyon sistemleri (T3SS'ler), gram-negatif bakterilerin bir efektör protein bataryasını doğrudan ökaryotik konakçı hücrelerin sitozolüne enjekte etmesini sağlar. Girişte, enjekte edilen efektör proteinler ökaryotik sinyal yollarını işbirliği içinde modüle eder ve hücresel fonksiyonları yeniden programlayarak bakteri girişini ve hayatta kalmasını sağlar. Bu salgılanan efektör proteinlerin enfeksiyonlar bağlamında izlenmesi ve lokalize edilmesi, konakçı-patojen etkileşimlerinin dinamik arayüzünü tanımlamak için bir ayak izi sağlar. Bununla birlikte, konakçı hücrelerdeki bakteri proteinlerinin yapılarını/işlevlerini bozmadan etiketlenmesi ve görüntülenmesi teknik olarak zordur.
Floresan füzyon proteinlerinin oluşturulması bu sorunu çözmez, çünkü füzyon proteinleri salgı aparatını sıkıştırır ve böylece salgılanmaz. Bu engellerin üstesinden gelmek için, yakın zamanda genetik kod genişlemesi (GCE) kullanarak, bakteriyel salgılanan efektörlerin ve diğer etiketlenmesi zor proteinlerin bölgeye özgü floresan etiketlemesi için bir yöntem kullandık. Bu makale, GCE bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini etiketlemek için eksiksiz bir adım adım protokol ve ardından doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için talimatlar sunmaktadır
Son bulgular, kanonik olmayan amino asitlerin (ncAA'lar) GCE yoluyla dahil edilmesinin, ardından tetrazin içeren boyalarla biyo-ortogonal etiketlemenin, bakteriyel salgılanan proteinlerin seçici etiketlenmesi ve görselleştirilmesi ve konakçıda müteakip görüntü analizi için uygun bir teknik olduğunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, bakteri ve virüslerdeki çeşitli biyolojik süreçleri ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için GCE kullanarak süper çözünürlüklü görüntüleme yapmakla ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.
Introduction
Bakteriyel enfeksiyonlar uzun zamandır insan sağlığı için ciddi bir tehlike olarak kabul edilmektedir. Patojenler, konakçı bağışıklık tepkilerinden kaçınmak ve enfeksiyonları oluşturmak için oldukça gelişmiş, son derece güçlü ve karmaşık savunma sistemlerinin yanı sıra çeşitli bakteriyel virülans faktörlerini (efektör proteinler olarak adlandırılır) kullanırlar 1,2. Bununla birlikte, bu sistemlerin altında yatan moleküler mekanizmalar ve bireysel efektör proteinlerin rolü, patogenez sırasında konakçı hücrelerdeki önemli protein bileşenlerini ve efektörlerini doğrudan takip etmek için uygun yaklaşımların yetersizliği nedeniyle hala büyük ölçüde bilinmemektedir.
Tipik bir örnek, akut gastroenterite neden olan Salmonella enterica serovar Typhimurium'dur. Salmonella Typhimurium, çeşitli efektör proteinleri doğrudan konakçı hücrelere enjekte etmek için tip üç sekresyon sistemlerini (T3SS) kullanır. Salmonella konakçı hücreye girer girmez, Salmonella içeren vakuol (SCV) 3,4 olarak adlandırılan asidik membrana bağlı bir bölmede bulunur. SCV'nin asit pH'ı, Salmonella patojenite adası 2 (SPI-2) kodlu T3SS'yi aktive eder ve vakuolar membran boyunca 20 veya daha fazla efektör proteinden oluşan bir voleybolu konakçı sitosol 5,6,7,8'e dönüştürür. Konağın içinde, efektör proteinlerin bu karmaşık kokteylleri, konakçı hücre sinyal yollarını koordine bir şekilde manipüle eder, bu da SCV'den mikrotübüller boyunca uzanan ve Salmonella'nın konakçı hücreler içinde hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlayan Salmonella kaynaklı filamentler (SIF'ler) olarak adlandırılan son derece dinamik, karmaşık boru şeklindeki membran yapılarının oluşmasına neden olur9,10,11.
Bakteriyel efektör lokalizasyonlarını görselleştirmek, izlemek ve izlemek ve konakçı hücreler içindeki kaçakçılığını ve etkileşimlerini incelemek için kullanılan yöntemler, bakteriyel patogenezi destekleyen mekanizmalar hakkında kritik bilgiler sağlar. Salmonella salgılanan T3SS efektör proteinlerinin konakçı hücreler içinde etiketlenmesi ve lokalizasyonunun teknolojik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır12,13; Bununla birlikte, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerinin gelişimi, canlı sistemler içindeki proteinleri inceleme ve görselleştirme yeteneğimizi dönüştürmüştür. Bununla birlikte, floresan proteinlerinin boyutu (~25-30 kDa)15 genellikle ilgilenilen proteininkiyle karşılaştırılabilir veya hatta ondan daha büyüktür (POI; örneğin, SsaP için 13.65 kDa, SifA için 37.4 kDa). Aslında, efektörlerin floresan protein etiketlemesi genellikle etiketli efektörün salgılanmasını bloke eder ve T3SS14'ü sıkıştırır.
Ayrıca, floresan proteinler daha az kararlıdır ve fotobeyazlatmadan önce düşük sayıda foton yayar, bu da süper çözünürlüklü mikroskobik tekniklerdekullanımlarını sınırlar 16,17,18, özellikle fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (PALM), STORM ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu. Organik floresan boyaların fotofiziksel özellikleri floresan proteinlerinkinden daha üstün olsa da, CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 ve HA-Tags24,25 gibi yöntemler / teknikler, çeviri sonrası modifikasyona veya kaçakçılığa müdahale ederek ilgili efektör proteinin yapısını-işlevini bozabilecek ek bir protein veya peptit eki gerektirir. Gerekli protein modifikasyonunu en aza indiren alternatif bir yöntem, GCE yoluyla çeviri sırasında ncAA'ların bir POI'ye dahil edilmesini içerir. ncAA'lar ya floresandır ya da tıklama kimyası 12,13,26,27,28 ile floresan yapılabilir.
GCE kullanarak, küçük, işlevsel, biyo-ortogonal gruplara (azid, siklopropen veya siklooktin grubu gibi) sahip ncAA'lar, bir hedef proteinin hemen hemen her yerine sokulabilir. Bu stratejide, doğal bir kodon, POI'nin geninde belirli bir konumda amber (TAG) durdurma kodonu gibi nadir bir kodon ile değiştirilir. Modifiye protein daha sonra ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz / tRNA çifti ile birlikte hücrelerde eksprese edilir. tRNA sentetaz aktif bölgesi, yalnızca belirli bir ncAA'yı alacak şekilde tasarlanmıştır, bu daha sonra kehribar kodonu tanıyan tRNA'nın 3' ucuna kovalent olarak bağlanır. ncAA basitçe büyüme ortamına sokulur, ancak hücre tarafından alınmalı ve aminoasil-tRNA sentetazın (aaRS) ortogonal tRNA'ya bağlayabileceği sitozole ulaşmalıdır; daha sonra belirtilen konumdaki İÇN'ye dahil edilir (bkz. Şekil 1)12. Böylece, GCE, keton, azid, alkin, siklooktin, transsiklookten, tetrazin, norbonen, α, β-doymamış amid ve bicyclo [6.1.0]-nonyne gibi biyo-ortogonal reaktif grupların bolluğunun bir POI'ye bölgeye özgü olarak dahil edilmesini sağlarve potansiyel olarak geleneksel protein etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir 12,26,27,28.
Süper çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinde son zamanlarda ortaya çıkan eğilimler, biyolojik yapıları moleküler düzeyde araştırmak için yeni yollar açmıştır. Özellikle, tek moleküllü, lokalizasyon tabanlı, süper çözünürlüklü bir teknik olan STORM, ~ 20-30 nm'ye kadar hücresel yapıları görselleştirmek için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir ve biyolojik süreçleri bir seferde bir molekül araştırabilmekte ve böylece geleneksel topluluk ortalamalı çalışmalarda henüz bilinmeyen hücre içi moleküllerin rollerini keşfedebilmektedir13 . Tek moleküllü ve süper çözünürlüklü teknikler, en iyi çözünürlük için parlak, fotoğraflanabilir organik floroforlara sahip küçük bir etiket gerektirir. Yakın zamanda GCE'nin süper çözünürlüklü görüntüleme12 için uygun probları dahil etmek için kullanılabileceğini gösterdik.
Hücrelerde protein etiketleme için en iyi seçeneklerden ikisi, bisiklo [6.1.0] nonynelysine (BCN) ve trans-siklookten-lizindir (TCO; Şekil 1'de gösterilmiştir), burada Pyl pirolizin temsil eder ve AF, doğal olarak pirolizin 12'yi kodlayan Methanosarcina labirentinden türetilen rasyonel olarak tasarlanmış bir çift mutantı (Y306A, Y384F) temsil eder. 29,30,31. Suş destekli ters elektron talebi Diels-Alder sikloekleme (SPIEDAC) reaksiyonu sayesinde, bu amino asitler tetrazin konjugatları ile kemoselektif olarak reaksiyona girer (Şekil 1)12,30,31. Bu tür sikloekleme reaksiyonları son derece hızlıdır ve canlı hücrelerle uyumludur; Ayrıca, tetrazin moiety 12,26,32 ile uygun bir florofor işlevselleştirilirse, florojenik olabilirler. Bu yazıda, GCE kullanılarak konakçı hücrelere verilen bakteriyel efektörlerin dinamiklerini izlemek için optimize edilmiş bir protokol ve ardından dSTORM kullanılarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonu sunulmaktadır. Sonuçlar, GCE yoluyla bir ncAA'nın dahil edilmesinin, ardından florojenik tetrazin taşıyan boyalarla bir tıklama reaksiyonunun, seçici etiketleme, salgılanan proteinlerin görselleştirilmesi ve ardından konakçıda hücre altı lokalizasyonu için çok yönlü bir yöntemi temsil ettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, burada ayrıntılı olarak açıklanan tüm bileşenler ve prosedürler, GCE sisteminin diğer biyolojik soruları araştırmak için uyarlanabilmesi için ayarlanabilir veya değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid konstrüksiyonu
- POI'yi ifade eden geni, E. coli BL21'deki (DE3) POI'yi ifade eden bir ekspresyon plazmidine (örneğin, pET28a-sseJ 10TAG) klonlayın. Bu adım, mutantların işlevsel olduğunu belirlemeyi kolaylaştırır.
- Konakçı hücrelerde Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için, önceki raporlarda açıklandığı gibi, yerel promotörünün kontrolü altında hedef POI SseJ'yi ifade eden bir ekspresyon plazmidi (pWSK29-sseJ-HA) oluşturun 7,12,24. Bölgeye yönelik mutajenezi kullanarak, Fenilalanin-10 kodonunu SseJ'de (pWSK29-sseJ 10TAG-HA) AMBER KODONU (TAG) ile değiştirin ve AAT-TAG-ACT motifi33,34'ü sağlayın.
- Yukarıdaki plazmidlere ek olarak, trans-siklookt-2-en-L-lizinin (TCO * A) bir POI'ye genetik olarak dahil edilmesi için, plazmid pEVOL'de kodlanmış evrimleşmiş tRNA / sentetaz çifti (tRNAPyl / PylRS AF) genlerini içeren başka bir ekspresyon plazmidi (pEVOL-PylRS-AF)31 kullanın.
NOT: Plazmid ve klonlama protokollerinin ayrıntılı açıklamaları önceki rapor30,31'de açıklanmıştır. - Yüksek kaliteli plazmid DNA'sı elde etmek için piyasada bulunan plazmid hazırlama kitlerini kullanın. Saflaştırılmış DNA için optimal 260/280 oranı ~ 1.8'dir. Gerekirse,% 1 agaroz jeli elektroforezi kullanarak DNA saflığını kontrol edin.
2. Bakteri kültürü hazırlama
- Mutantın E. coli'de işlevsel olduğunu test etmek için çift dönüştürücülerin elde edilmesi
- BL21 yetkin hücrelerini -80 ° C'den çıkarın ve yaklaşık 20-30 dakika boyunca buz üzerinde çözün.
- Her plazmidin 1-5 μL'sini (~ 50 ng pEVOL-PylRS-AF ve pET28a-sseJ 10TAG) 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL kimyasal olarak yetkin BL21 hücresi ile karıştırın. Yetkili hücreleri ve plazmid karışımını yavaşça karıştırın; Buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Mikrosantrifüj tüpünü 42 °C'lik bir su banyosunda 45 s boyunca ısıya maruz bırakın. Tüpleri 2 dakika boyunca tekrar buzun üzerine koyun.
- Mikrosantrifüj tüpüne 1 mL sıcak LB ortamı ekleyin ve karışımı hızlı bir şekilde 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücreleri 37 ° C'de 250 rpm'de bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca inkübe edin. Dönüştürülmüş hücrelerin bir kısmını veya tamamını uygun antibiyotikler içeren LB agar plakaları üzerine plakalayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Bu protokolde, pEVOL-PylRS-AF ve pET28a-sseJ 10TAG'ı seçmek için sırasıyla 35 μg / mL kloramfenikol ve 50 μg / mL kanamisin kullanılmıştır. Dönüşüm adımında, negatif ve pozitif kontrolleri kullanarak başarılı dönüşümü değerlendirin.
- Konakçı hücrelerde Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için mutantı Salmonella'ya aktarın:
- Soğutulmuş bir mikrosantrifüj tüpünde 40-60 μL elektroyetkin Salmonella Typhimurium suşu 14028s'ye pEVOL-PylRS-AF ve pWSK29-sseJ 10TAG'ın her birine 2-3 μL ekleyin. Karışımı bir pipetle hafifçe karıştırın.
- Elektroporasyon karışımını soğutulmuş (0,2 cm elektrot boşluğu) bir küvete aktarın; elektroporasyon ayarlarını 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF olarak ayarlayın. Küveti elektroporasyon odasının içine yerleştirin. Oda elektrodunun mikro darbeli küvetle sıkı temas ettiğinden emin olun.
- Bip sesi çıkana kadar nabız düğmesini basılı tutun.
- Hemen küvete 1 mL ılık LB ortamı ekleyin. Tüm içeriği 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücreleri 37 ° C'de 1 saat boyunca 250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
- Salmonella'nın elektroporasyon karışımının bir kısmını veya tamamını uygun antibiyotikler içeren bir LB agar plakası üzerine plakalayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Bu protokolde, pEVOL-PylRS-AFve pWSK29-sseJ 10TAG'ın seçimi için sırasıyla 35μg / mL kloramfenikol ve 100 μg / mL ampisilin kullanılmıştır.
- Kültür hazırlığı
- Tek bir Salmonella veya E. coli kolonisini, uygun antibiyotikler içeren 5 mL LB ortamında aşılayın. Gece boyunca 37 ° C'de büyüyün, 250 rpm'de sallayın.
3. ncAA taşıyan proteinlerin ekspresyonu ve floresan etiketlemesi
- E. coli'de ncAA taşıyan proteinlerin ekspresyonu
- 100 μL birincil kültürü, 35 μg / mL kloramfenikol ve 50 μg / mL kanamisin içeren 5 mL LB ortamına (1:50 seyreltme) aktarın, ardından OD600 0.4-0.6'ya ulaşana kadar 250 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübasyon.
- 1 mM TCO*A stok çözeltisi hazırlayın (10 mL; Tablo 1).
- Kültürler OD600 = 0.4–0.6'ya ulaştığında, LB ortamını 1 mM TCO*A, 35 μg/mL kloramfenikol ve 50 μg/mL kanamisin içeren taze LB ile değiştirin.
NOT: Alternatif olarak, TCO*A stok çözümü adım 5.4.2'de açıklandığı gibi hazırlanabilir. - 1 mM IPTG,% 0.2 arabinoz varlığında protein ekspresyonunu indükleyin ve gece boyunca 34 ° C, 250 rpm'de çalkalayın. Bakteri hücrelerini 11.000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüjleme ile toplayın. Süpernatantı çıkarın ve pelet bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de dondurun.
- Bir kontrol deneyi için, aynı deneyi tekrarlayın, ancak ncAA'nın yokluğunda ncAA taşıyan proteinleri ifade edin. E. coli'deki ncAA taşıyan proteinlerin in vitro floresan etiketlemesi için, adım 3.3'te açıklanan ayrıntılı prosedürü izleyin.
- Salmonella'da ncAA taşıyan proteinlerin ekspresyonu
- 100 μL birincil kültürü, 35 μg / mL kloramfenikol ve 100 μg / mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamına (1:50 seyreltme) aktarın, ardından OD600 0.6'ya ulaşana kadar 250 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübasyon.
- Modifiye N-minimal ortamı (MgM, pH 5.6) Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- LB ortamını 1 mM TCO*A ile desteklenmiş modifiye N-minimal ortam (MgM) ile değiştirin (Tablo 1). Bakterileri 30 dakika boyunca 34 ° C'de büyütün. Daha sonra,% 0.2 arabinoz, 25 mg / mL kloramfenikol ve 100 mg / mL ampisilin ekleyin ve hücreleri 250 rpm'de çalkalayarak 6 saat daha büyütün.
- 6 saat sonra, bakterileri 30 dakikalık bir aralıkla, ncAA içermeyen taze MgM (pH 5.6) ortamı (Tablo 1) ile 4x yıkayın. Yıkama adımlarında, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 972 × g kullanın.
- Bakterileri santrifüj edin, 1x PBS tamponunda yeniden askıya alın ve fazla ncAA'ları gidermek için karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. 1 saat sonra, bakterileri 3.000 × g, 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin ve daha fazla kullanım için saklayın.
- Bir kontrol deneyi için, ncAA yokluğunda ncAA taşıyan proteinleri eksprese ederek aynı deneyi tekrarlayın.
- Salmonella Typhimurium'da ncAA taşıyan proteinlerin in vitro floresan etiketlemesi
- 1x PBS'de TCO * A'nın yokluğunda veya varlığında (adım 3.2'den itibaren) SseJ-F10TCO-HA'yı eksprese eden Salmonella hücrelerini yeniden askıya alın. PBS'de OD600'ü 4'e ayarlayın. Hücreleri karanlıkta 37 ° C'de 20 μM Janelia Fluor 646-tetrazin (JF646-Tz) veya 20 μM BDP-Fl-tetrazin (DMSO'da 5 mM stok çözeltisi) ile inkübe edin ve 250 rpm'de 1-2 saat çalkalayın.
- Hücreleri peletleyin,% 5 DMSO ve% 0.2 Pluronic F-127 içeren PBS ile 3-4x yıkayın,% 5 DMSO içeren PBS'de tekrar askıya alın ve karanlıkta 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. 1x PBS ile 2 kat daha yıkayın. Yıkama adımlarında, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 972 × g kullanın.
- Konfokal mikroskop kullanarak hücreleri hemen görüntüleyin veya karanlıkta oda sıcaklığında 30-45 dakika boyunca PBS'de% 1.5 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
- Fazla PFA'yı gidermek için sabit hücreleri PBS ile 2 kat ve son olarak PBS'de 50 mM NH4Cl'de 15 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri PBS'de yeniden askıya alın ve 3-4 günden fazla olmamak üzere 4 ° C'de saklayın. Bölüm 6'da açıklandığı gibi konfokal mikroskopi kullanarak bakterileri görüntüleyin.
4. ncAA taşıyan proteinlerin biyokimyasal karakterizasyonu
- Hücre lizisi
- Bölüm 3.1'deki hücreleri lizis tamponunda (Tablo 1) tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla inkübe edin. Karışımı buz üzerinde 15 dakika soğutun.
NOT: Lizis tamponunun kullanılan hücre ağırlığına oranını 1:10 olarak tutun. - Hala buz üzerindeyken askıya alınmış hücreleri sonikleştirin. Bir sonikatör kullanarak, 7 ayarında en az 6x, 1 dakikalık boşluklarla 30 s boyunca darbe alın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Hücre lizatını 20.500 × g'da, 15 dakika boyunca 4 ° C'de döndürün (4 ° C'yi korumak çok önemlidir). Supernatant'ı taze bir tüpe aktarın ve peleti atın.
- Bölüm 3.1'deki hücreleri lizis tamponunda (Tablo 1) tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla inkübe edin. Karışımı buz üzerinde 15 dakika soğutun.
- SDS-SAYFA analizi
- 5x SDS yükleme boyası hazırlayın (Tablo 1). 13 μL hücre lizatına 5 μL SDS jel yükleme tamponu ekleyin. Proteinleri sodyum dodesil sülfat (SDS) numune tamponu ile 95 ° C'de 2 mL'lik bir tüpte 10 dakika boyunca denatüre edin, karışımı 50 s boyunca 2.000 × g'da santrifüj edin ve% 12'lik bir SDS poliakrilamid jele yükleyin.
- Jel kasetini monte edin, bir jel elektroforez aparatına yerleştirin ve elektroforez aparatını bir elektrik güç kaynağına bağlayın. Akan tamponu dökün, moleküler ağırlık belirteçlerini ve protein örneklerini yükleyin ve bromofenol çözücü jelin dibine ulaşana kadar jeli 100 V'ta çalıştırın.
NOT: Analize hemen başlayın, çünkü -20 °C'de depolanan lizatlar her donma-çözülme döngüsünden sonra kaliteyi kaybetme eğilimindedir. - Jeli Coomassie mavi protein boyası ile lekeleyin.
5. HeLa hücrelerinde Salmonella salgılanan efektör SseJ-F10TCO-HA'nın biyo-ortogonal etiketlenmesi
- HeLa hücrelerini 37 ° C'de,% 5 CO 2 ve% 95 nemde, yüksek glikozlu (4.5 g / L) Dulbecco'nun modifiye kartal ortamında (DMEM), Penisilin-Streptomisin'e (1x) ek olarak% 10 (v / v) FBS ile desteklenmiş olarak kültürleyin ve koruyun.
- Kültür bakterileri enfeksiyondan 1 gün önce. pEVOL-PylRS-AF ve pWSK29-sseJ 10TAG barındıran tek bir Salmonella 14028s kolonisini, 37 ° C'de bir gecede 5 mL antibiyotik içeren standart LB suyunda aşılayın ve 250 rpm'de sallayın.
- Enfeksiyondan 1 gün önce tohum HeLa hücreleri. Hücre yoğunluğunun mikroskobik incelemesiyle belirlendiği gibi, ~% 80 akıcılıkta HeLa hücreleri içeren bir doku kültürü şişesi (T-75) alın. Hücreleri ılık PBS ile yıkayın. 3 mL sıcak% 0.25 tripsin / EDTA ile hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 dakika boyunca ayırın.
- Tripsini 2 mL DMEM (+ %10 FBS) kullanarak söndürün. Şişenin tüm içeriğini, hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 1.000 × g'da döndürün. Süpernatantı tüpten çıkarın. HeLa hücre peletini önceden ısıtılmış büyüme ortamında yeniden askıya alın.
- Süspansiyonu incelemek ve mevcut hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. 1 × 105 hücre/mL'de seyreltilmiş bir hücre stoğu hazırlayın. Sekiz kuyucuklu bir slaytta 500 μL DMEM +% 10 FBS büyüme ortamında kuyu başına 0.5 ×10 5 HeLa hücresi tohumlayın. Oda sürgüsünü bir inkübatörde 37 ° C,% 5 CO2, 24 saat boyunca% 95 nemde tutun.
- Bakteriyel enfeksiyon
- Alt kültür Salmonella 14028s, pEVOL-PylRS-AF ve pWSK29-sseJ 10TAG'ı barındırarak, 100 μL gecelik bakteri kültürünü (adım 5.2'den itibaren) 35 μg / mL kloramfenikol ve 100 μg / mL ampisilin içeren 3 mL LB ortamına (1:30 seyreltme) seyrelterek, ardından 5-7 saat boyunca 250 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübasyon.
NOT: Bu aşamada, kültürler geç üstel faza ulaşır ve bakteriler oldukça invazivdir. - 100 mM TCO*A stok çözümü hazırlayın ve ortamı tamamlayın (Tablo 1).
- HeLa hücre enfeksiyonunu başlatmak için, HeLa hücrelerini inkübatörden çıkarın ve her bir oyuğa 500 μL taze DMEM (+% 10 FBS) eklemeden önce hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın. Enfeksiyon başlayana kadar oda sürgüsünü CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.
- 5-7 saatlik inkübasyondan sonra, Salmonella kültürünü 1 mL DMEM büyüme ortamında OD600 = 0.2'ye (~ 3 × 108 cfu / mL) seyreltin. Oda slaytının her bir kuyucuğuna gerekli miktarda Salmonella inoculum ekleyin, böylece enfeksiyon çokluğu (MOI) 100 olur.
- Enfekte olmuş hücreleri bir CO2 inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücre dışı Salmonella'yı çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile 3 kat yıkayın. Bu zaman noktasını enfeksiyondan sonra 0 saat olarak ayarlayın. 1 saat boyunca 100 μg / mL gentamisin içeren 500 μL tam ortam (Tablo 1) ekleyin. 1 saat sonra, hücreleri DPBS ile 3x yıkayın. Tam ortamdan 500 μL ekleyin (adım 5.4.2'den; Tablo 1) oda slaytının her bir kuyucuğuna %0.2 arabinoz, 10 μg/mL gentamisin takviyesi yapılmıştır.
- Bir kontrol deneyinde, TCO * A olmadan HeLa hücrelerinin benzer enfeksiyonlarını gerçekleştirin.
- Oda slaytını CO2 inkübatöründe 10 saat boyunca inkübe edin.
- Alt kültür Salmonella 14028s, pEVOL-PylRS-AF ve pWSK29-sseJ 10TAG'ı barındırarak, 100 μL gecelik bakteri kültürünü (adım 5.2'den itibaren) 35 μg / mL kloramfenikol ve 100 μg / mL ampisilin içeren 3 mL LB ortamına (1:30 seyreltme) seyrelterek, ardından 5-7 saat boyunca 250 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübasyon.
- Canlı hücrelerde kimya tabanlı etiketlemeye tıklayın
- Bakteri bulaşmış hücreleri etiketlemeye devam edin. Tüm ortamı TCO * A olmadan önceden ısıtın (Tablo 1).
- Enfeksiyondan 10 saat sonra, komple ortamı TCO * A içermeyen taze tam ortamla değiştirin ve HeLa hücrelerini önceden ısıtılmış DPBS ile her biri 30 dakikalık bir aralıkta 4 kez yıkayın, ardından taze tam ortam (TCO * A olmadan).
- DMSO'da 0,5 mM'lik bir boya-tetrazin stok çözeltisi hazırlayın.
NOT: Konakçı hücrelerde Salmonella salgılanan efektörleri etiketlemek için iki protokol sunulmuştur. Protokol 1 için, JF646-Tz stoğunu sığır sütünden% 1 kazein sodyum tuzu içeren 1x PBS'de seyrelterek boya karışımını hazırlayın, böylece son çalışma çözeltisi 2 μM olur. Protokol 2 için, sıcak komple ortam hazırlayın (FBS ve TCO * A olmadan) ve 2 μM JF646-Tz ekleyin. Mümkünse karanlıkta çalışın (davlumbazdaki ve / veya odadaki ışıkları kısın). - Enfeksiyondan 12 saat sonra, ortamı hücrelerden aspire edin. Hücreyi önceden ısıtılmış DPBS 2x veya 3x ile yıkayın. Bir grup kuyucuğa, protokol 1'de açıklanan boya çözeltisi karışımının 500 μL'sini ekleyin ve aynı oda slaytının başka bir kuyucuk grubunda, adım 5.5.3'te belirtilen protokol 2'de açıklanan boya çözeltisi karışımından 500 μL ekleyin. Oda slaytlarını 1,5-2 saat boyunca CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.
- Enfeksiyondan 13.5-14 saat sonra, HeLa hücrelerini önceden ısıtılmış DPBS ile 2 kat durulayın. 500 μL taze DMEM ekleyin (FBS ile desteklenmiş). Oda slaytını inkübatöre 30 dakika boyunca geri yerleştirin. Hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın, ardından 30 dakikalık bir aralıkta taze DMEM 4x ile yıkayın.
- Enfeksiyondan 16 saat sonra, her bir kuyucuğa 200 μL% 4 PFA ekleyerek ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek HeLa hücrelerini PFA ile sabitleyin. PFA'yı aspire edin, PBS ile 3 kat durulayın ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de PBS'de saklayın.
NOT: PFA oldukça toksik bir kimyasaldır. Soluma, cilt ve göz temasından kaçının. Kullanım sırasında koruyucu ekipman kullanın. Etiketli numunenin ışığa maruz kalmasını önlemek için, hücre kültürü başlığındaki ışığı kapatın.
- HA etiketli proteinlerin immün boyama
- PBS'yi aspire edin ve bloke edici çözeltide bir kez durulayın (Tablo 1).
- Sabit HeLa hücrelerini PBS bazlı bir birincil antikor çözeltisi (Tablo 1) ile karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Salgılanan SseJ'yi boyamak için bir tavşan anti-HA birincil antikoru kullanın (1:500 seyreltme).
- 1 saat sonra, hücreleri 2x 0.5 mL% 0.1 Ara-20/1x PBS ile nazikçe yıkayın. Tween/PBS çözeltisi ile yapılan yıkamalar sırasında, hücreleri 5 dakika boyunca 0,5 mL% 0,1 Tween20/1x PBS ile 3x inkübe edin.
- İkincil antikor eşek anti-tavşan 555 1:500'ü ikincil antikor çözeltisinde seyreltin ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- 1 saat sonra, hücreleri 2x 0.5 mL% 0.1 Ara-20/1x PBS ile nazikçe yıkayın ve 5 dakika boyunca 0.5 mL% 0.1 Tween20/1x PBS ile 2x inkübe edin.
- Hücreleri 0,5 mL 1x PBS ile 3x yıkayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın.
NOT: Sabit hücreler PBS'de 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir. İmmün boyama son dakikada yapılmalıdır.
6. Konfokal görüntüleme
- Dönen disk (SD) veya STED mikroskobu gibi bir konfokal mikroskop kullanın.
- Tarama modu (XYZ), tarama hızı (400 Hz), çözünürlük (512 x 512), büyütme (100x) ve Z istifleme gibi görüntü alma ayarlarını yapın.
- DAPI, BDP-Tz ve JF646 tetrazin için doğru uyarım/emisyon filtrelerini kullanın.
NOT: Bu protokol için, konfokal görüntüleme, darbeli beyaz ışık lazeri ile donatılmış bir STED mikroskop sistemi üzerinde gerçekleştirildi ve 470-670 nm aralığında uyarma seçimine ve 405 nm, 488 nm ve 647 nm'de uyarma için UV 405 nm diyot lazere izin verdi. Uygun emisyon aralıkları, konfokal sistemin prizma tabanlı ayarlanabilir çok bantlı spektral tespiti ile birlikte dahili akusto-optik ışın ayırıcı kullanılarak ayarlandı. - 100×/1,4 yağ daldırma hedefini kullanarak görüntüleri elde edin.
7. Süper çözünürlüklü (dSTORM) görüntüleme
- Termal dengeye izin vermek için görüntülemeden 3 saat önce mikroskobu açın (görüntüleme bundan önce başlarsa sürüklenme olasılığı daha yüksektir). Fotoğraf makinesini -70 °C'ye soğutun.
- Bu arada, taze GLOX-BME görüntüleme tamponu hazırlayın (Tablo 1).
- Hücreleri mikroskopa getirin. Görüntüleme odasını numune tutucudaki mikroskop aşamasına yerleştirin. Tutucuda, numunenin düz ve güvenli olduğundan emin olun. Kuyudaki ortamı 0,4 mL'lik yeni yapılmış GLOX-BME görüntüleme tamponu ile değiştirin.
- Doğru lazer çizgisini ve filtre setlerini ayarlayın. İlgilenilen bir HeLa hücresini tanımlamak için lazer gücünü ~ 1 mW'a düşürün. Numuneyi düşük 647 nm lazer yoğunluklarıyla aydınlatırken odak düzlemini ve lazer ışını açısını ayarlayın (bu durumda, HILO sinyali arka plana [SBR] yükselttiğinden, dik eğimli bir açı [HILO] önerilir). HILO aydınlatma açısını ayarlayın.
NOT: Bu protokolde, Alexa Fluor 647 kanalında SseJ'in süper çözünürlüklü görüntülemesi, bir TIRF hedefi (100x Apo TIRF yağ daldırma hedefi, NA 1.49) ile donatılmış, ters çevrilmiş, epifloresan mikroskobu ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak elde edilmiştir. Floresan, μManager aracılığıyla kontrol edilen bir EMCCD kamera ile tespit edildi. - Ön amplifikatör kazancını 3 olarak ayarlayın ve μManager'da kare aktarımını etkinleştirin. Önceki bir rapor35'te açıklandığı gibi, dSTORM ölçümlerinde daha yüksek hassasiyet için EM kazancını 200 olarak ayarlayın.
- dSTORM görüntülemeden önce, hedef yapının referans kırınımla sınırlı bir görüntüsünü yakalayın. Lazeri maksimum gücüne açarak floroforları karanlık duruma getirin.
NOT: JF646 floroforları, daha önce 36 tarif edildiği gibi, 647 nm uyarma ışığının sürekli aydınlatılmasıyla ağırlıklı olarak karanlık bir duruma dönüştürüldüğünde, JF646 floroforlarının bireysel, hızla yanıp sönen molekülleri gözlenmiştir. - Lazer gücünü, yanıp sönen olayların uzay ve zamanda ayrıldığı uygun bir seviyeye ayarlayın, maruz kalma süresini 30 ms'ye ayarlayın ve edinmeye başlayın. 10.000–30.000 kare elde edin.
NOT: Yanıp sönmeyi optimize etmek için lazer gücünde değişiklikler yapılmalıdır. Algılanan çok fazla olay (üst üste binen yanıp sönen parçacıklar) varsa lazer yoğunluğunu artırmayı düşünün. İdeal uzunluk numunenin kalitesine bağlıdır, ancak ~ 10.000 kare fark edilebilir özellikler göstermelidir.
8. dSTORM'un görüntü rekonstrüksiyonu
- Görüntü analizi için uygun yazılımı kullanın.
NOT: Mevcut birçok açık kaynaklı görüntü yeniden yapılandırma programından biri olan ThunderSTORM, aşağıda kısaca açıklanmıştır. - ImageJ'yi açın ve ham verileri içe aktarın. ThunderSTORM eklentisini açın ve cihaza karşılık gelen kamera ayarını yapılandırın.
- Analizi Çalıştır'a gidin ve görüntü filtreleme (ortalama filtrelerin farkı), yerelleştirme yöntemleri (yerel maksimum) ve moleküllerin alt piksel lokalizasyonu (tümleşik Gauss PSF) gibi uygun ayarları yapın. Görüntü yeniden yapılandırmayı başlatmak için Tamam'ı tıklatın.
NOT: Gerekirse, ThunderSTORM'da parametrelerin ayarlanması için ayrıntılı talimatlar zaten açıklanmıştır37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol belgesinde, Şekil 1'de gösterildiği gibi, bölgeye özgü floresan etiketleme ve Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için GCE tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. ncAA taşıyan trans-siklookten biyoortogonal grubunun (TCO) kimyasal yapısı ve floresan boya Şekil 1A'da gösterilmiştir. SseJ etiketlemesi, GCE teknolojisi ile ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz / tRNA çiftleri kullanılarak bir amber stop kodonunda (bakınız Şekil 1B) biyoortogonal ncAA'ların genetik olarak dahil edilmesiyle sağlanmıştır. TCO etiketli efektörlerin florofor (JF646-Tz veya BDP-Tz) içeren tetrazin ile tedavisi, konakçının enfeksiyonundan saatler sonra translokasyonlu Salmonella salgılanan efektörlerin gözlemlenmesini sağlayan alternatif bir protein etiketleme stratejisi sağlamıştır (Şekil 1B, C). Olası amino asit kalıntılarını tanımlayarak başladık ve yüzey erişilebilirliğine ve SseJ fonksiyonel kalıntıları hakkındaki mevcut bilgilere dayanarak ncAA dahil edilmesi için SseJ'in 10. pozisyonunu seçtik. Önceki yapısal veriler ve yüzeye maruz kalma projeksiyonları, belirli konumların seçiminde yardımcı olabilir.
Kehribar kodonun POI'yi kodlayan gen içine yerleştirilmesi, TCO katılımının etkinliğini etkiler. Sonuç olarak, POI geninin çeşitli konumlarında amber kodonları olan bir dizi mutant, optimum entegrasyon verimliliği için oluşturulmalı ve analiz edilmelidir. Amber kodon pozisyonunun seçimi ampiriktir. Genel olarak, değiştirilmiş kalıntılar POI fonksiyonu için gerekli olmamalı, çeviri sonrası modifikasyonlardan yoksun olmalı ve floresan problar için erişilebilir olmalıdır. İfade plazmidi, POI'nin yerel kopya numarasını taklit etmesi için düşük bir kopya numarası olmalıdır. Kodon bağlamı, bir ncAA'nın ortogonal bir tRNA / aminoasil-tRNA sentetaz sistemi tarafından ne kadar etkili bir şekilde dahil edildiğini etkiler. AAT-TAG-ACT, ortogonal tRNA'nın tercih edilen bağlamı olsa da, sseJ'nin Fenilalanin-10'unun konumu TAG olarak değiştirildi ve ncAA'nın en etkili şekilde birleştirilmesini sağlamak için AAT-TAG-ACT bağlamı sağlandı. İlk olarak, mutantların E. coli'de işlevsel olup olmadığını, sseJ'yi eksprese etmek için yüksek kopya numaralı bir plazmid kullanarak test ettik. SDS-PAGE tarafından kanıtlandığı gibi, SseJ-F10TCO-HA mutant ekspresyonu, TCO * A'nın varlığına ve buna karşılık gelen optimal tRNA / aaRS'ye bağlıydı (Şekil 2A). SseJ-F10FCO-HA, E. coli'deki SPIEDAC tıklama kimyası kullanılarak JF646-Tz ile etiketlendi. SseJ-F10TCO-HA'nın in vitro olarak seçici floresan etiketlemesi, floresan mikroskobu analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 2B). GCE kullanılarak, TCO * A böylece sseJ'deki bir amber kodonuna özel olarak dahil edildi. tRNAPyl/PylRS AF sistemini kullanarak ncAA'ların genomik hedef dışı katılımını doğrudan tanımlama girişimleri, varlıklarına dair hiçbir kanıt üretmedi. Bununla birlikte, burada belirtilen daha önce bildirilen makalelerde belgelendiği gibi, pEVOL plazmidinin verimliliğini, özgüllüğünü, hedef dışı birleşme derecesini ve toksisitesini değerlendirmek için jel içi floresan, Western blot, floresan füzyon proteini, in vitro floresan etiketleme ve diğer yöntemleri kullanmanızı öneririz.
sseJ'deki bastırılmış TAG'in işlevsel olduğunu belirledikten sonra, sseJ-F10TCO-HA'yı yerel promotörü ile birlikte düşük kopya numaralı plazmid pWSK29'a klonladık ve floresan etiketleme ve görselleştirme için bir AAT-TAG-ACT motifi sağladık. Salmonella hücrelerinde SseJ-F10TCO-HA'nın in vitro seçici etiketlemesi, floresan mikroskobu kullanılarak doğrulandı (Şekil 3). Daha sonra HeLa hücrelerini, TCO ile birleştirilmiş SseJ'nin konakçı hücrelere translokasyon edilip edilemeyeceğini belirlemek için TCO * A'nın yokluğunda veya varlığında, p sseJ-HA veya psseJ 10TAG-HA ile tamamlanan vahşi tip Salmonella suşu ile enfekte ettik. Enfekte HeLa hücreleri PFA ile sabitlendi ve SseJ tarafından dekore edilen SIF'leri vurgulamak için enfeksiyondan 16 saat sonra anti-HA antikoru ile immün boyandı. Şekil 4C'de gösterildiği gibi, SseJ-F10TCO-HA açıkça salgılandı, SseJ'e bağımlı SIF'ler oluştu ve vahşi tip enfekte hücrelerde gözlenenlere benziyorlardı (Şekil 4A). Bununla birlikte, SseJ'e bağımlı SIF'ler TCO * A yokluğunda gözlenmedi (Şekil 4B). Bu gözlemler, GCE kullanılarak sseJ-F10TCO-HA ekspresyonunun SseJ'e bağımlı SIF'leri kurtardığını göstermiştir. Ek olarak, sonuçlar ayrıca SseJ-F10TCO-HA'nın Salmonella için tamamen işlevsel bir virülans faktörü olduğunu göstermiştir.
GCE etiketli SseJ'in işlevsel olduğunu ve salgılandığını doğruladıktan sonra, HeLa hücrelerinde JF646-Tz ile SseJ-F10TCO-HA'yı etiketlemek için SPIEDAC reaksiyonunu kullandık. Bunu yapmak için, HeLa hücrelerini, TCO * A varlığında p sseJ-F10TCO-HA ile tamamlanan vahşi tip Salmonella ile enfekte ettik. Protokol bölüm 5'te açıklanan iki alternatif protokol kullanılarak JF646-Tz ile etiketlendikten sonra, hücreler fazla boyayı çıkarmak için kapsamlı bir şekilde yıkandı, PFA ile sabitlendi ve salgılanan SseJ-F10TCO-HA'yı görselleştirmek için bir anti-HA antikoru ile immün boyandı. HeLa hücrelerinin sitoplazmasına salgılanan SseJ-F10TCO-HA, JF646-Tz (Şekil 5A, B, kırmızı) ile etiketlendi ve HA-etiketi (yeşil) ile açıkça birlikte lokalize edildi. İki etiketin birbiriyle örtüştüğü gözlemi (biri floresan boya, diğeri immün boyama ile etiketlenmiş), GCE etiketlemesinin özgüllüğünü daha da vurgulamaktadır.
Bu HeLa hücrelerinde gözlenen floresan sinyalinin sadece salgılanan efektör SseJ'ye özgü olduğundan emin olmak için, TCO * A ve pEVOL-PylRS-AF varlığında vahşi tip Salmonella (psseJ-HA taşıyan) ile hücreleri enfekte ettik. HeLa hücrelerinde herhangi bir arka plan etiketlemesi olup olmadığını gözlemlemek için bir tıklama boyası kullanıldı. SseJ, konakçı hücrenin sitoplazmasına salındı, hücre içi veya spesifik olmayan floresan sinyalleri yoktu (Şekil 5C), floresan sinyalinin SseJ'ye özgü olduğunu gösterdi. ncAA'ların özellikle bir amber kodonuna dahil edildiğini ve salgılanan SseJ'nin tıklama reaksiyonu yoluyla konakçı hücrede görselleştirilebileceğini belirledikten sonra, bir sonraki amaç HeLa hücrelerinde salgılanan SseJ'nin süper çözünürlüklü bir görüntüsünü oluşturmaktı (Şekil 6). Şekil 6'da, GCE'nin gücünü ve HeLa hücrelerinde Salmonella salgılanan efektör SseJ'nin bölgeye özgü süper çözünürlüklü görüntülerini oluşturmak için JF646 boyasının kullanımını gösteriyoruz.
Resim 1: SPI-2 efektörlerinin sahaya özgü floresan etiketleme şeması. (A) TCO * A ve JF-646-tetrazin. (B) Şematik, bir ncAA'nın bir SPI-2 efektörüne dahil edilmesini gösterir. Bakteri hücresinde, bir efektör POI (mor) geni içeren bir plazmid ve bir ortogonal baskılayıcı tRNA (kırmızı) / aminoasil sentetaz (yeşil) çifti tanıtılır. Doğal bir kodon, izin verilen bir yerde efektör gen dizisindeki bir amber (TAG, kırmızı) durdurma kodonu ile değiştirilir. ncAA (koyu kırmızı daire) basitçe büyüme ortamına sokulur. Daha sonra hücre tarafından toplanır ve aminoasil-tRNAsentetaz (aaRS) tarafından ortogonal tRNA'ya bağlandığı sitozol ulaşır. Bir CUA antikodonu ile ncAA-asillenmiş tRNA, efektör mRNA (mor) üzerindeki tamamlayıcı amber kodonun bir sonucu olarak ribozomal makineye girer ve ekli ncAA'yı efektöre dahil eder. ncAA, efektör bölgenin tam uzunluktaki polipeptit zinciri tarafından taşınır, bu zincir daha sonra katlanır ve fonksiyonel bir efektör proteinine monte edilir. Yeni üretilen efektör, T3SS aracılığıyla konakçı hücreye aktarılır. Harici olarak tedarik edilen bir florofor, ncAA ile entegre edilmiş salgılanan bir SPI-2 efektörünü etiketlemek için kullanılabilir. (C) Florojenik tetrazin boyası ile bakırsız tıklama reaksiyon şeması. SPIEDAC tıklama reaksiyonu sayesinde, bir POI'ye (SseJ) dahil edilmiş gergin bir alken grubuna sahip bir ncAA, tetrazin bağlantılı bir boya (JF646-Tz) ile reaksiyona girer. Florojenik, tetrazin bağlantılı boya JF646-Tz, ancak başarılı etiketlemeden sonra floresan (kırmızı) olur. Kısaltmalar: TCO * A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; ncAA = kanonik olmayan amino asit; T3SS = tip üç sekresyon sistemi; SPI-2 = Salmonella patojenite adası 2; POI = ilgilenilen protein; SPIEDAC = gerinim destekli ters elektron talebi Diels-Kızılağaç sikloeklemesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TCO*A, E. coli ile ifade edilen SseJ-F10TCO-HA'YA özel olarak dahil edilmiştir. (A) Coomassie boyalı SDS-PAGE, TCO * A'nın SseJ-F10TCO-HA'ya (kırmızı okla gösterilir) in E. coli'ye seçici olarak dahil edildiğini doğrular. (B) 1 mM TCO*A'nın yokluğunda (üstte) veya varlığında (altta) floresan mikroskobu ile analiz edilen E. coli'de SseJ-F10TCO-HA ekspresyonu, TCO*A'nın yokluğunda veya varlığında SseJ-F10TCO-HA eksprese eden e. coli hücreleri BDP-Fl-tetrazin ile inkübe edilir ve BDP floresan (yeşil) için görüntülenir. SseJ floresan (yeşil) sadece dahil edilen TCO * A etiketinin varlığında gözlenir; Üst panelde arka plan floresansının bulunmadığına dikkat edin. Ölçek çubuğu = 2 μm. Kısaltmalar: TCO * A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = parlak alan; HA = hyaluronik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TCO * A, Salmonella ile ifade edilen SseJ-F10TCO-HA'ya özel olarak dahil edilmiştir. Floresan mikroskopisi, 1 mM TCO*A'nın yokluğunda (üstte) veya varlığında (altta) Salmonella'da SseJ-F10TCO-HA ekspresyonunu incelemek için kullanılır. SseJ F10TCO-HA'yı eksprese eden Salmonella, JF646-Tz ile muamele edilir ve JCO * A'nın varlığında veya yokluğunda JF646 floresan (macenta) için görüntülenir. Ölçek çubuğu = 2 μm. Kısaltmalar: TCO * A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = parlak alan; HA = hyaluronik asit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Salgılanan SseJ-J10TCO-HA işlevseldir. (A) HeLa hücreleri, 16 saat boyunca psseJ-HA barındıran Salmonella ile enfekte olur, anti-HA antikoru (kırmızı), LPS (yeşil) ve DAPI (mavi) ile sabitlenir ve immün olarak boyanır. Beklendiği gibi, enfekte hücrelerde SseJ'e bağımlı SIF'lerin oluşumu gözlenir. (B) TCO * A'nın yokluğunda, amber kodonu baskılanmaz ve enfekte HeLa hücrelerinde SseJ'e bağımlı SIF'ler yoktur. HeLa hücreleri, 16 saat boyunca TCO * A yokluğunda SseJ-F10TCO-HA eksprese eden Salmonella ile enfekte olur, anti-HA antikoru (kırmızı), LPS (yeşil) ve DAPI (mavi) ile sabitlenir ve immünoboyalıdır. (C) SseJ'e bağımlı SIF'ler TCO * A varlığında gözlenir. 400 μM TCO * A varlığında SseJ-F10TCO-HA eksprese eden Salmonella ile enfekte HeLa hücreleri sabitlenir ve anti-HA antikoru SseJ (kırmızı), LPS (yeşil) ve DAPI (mavi) ile immün boyanır. Sol panelde SseJ'e bağımlı SIF'ler gözlenmiştir, bu da SseJ'in GCE kullanılarak sseJ-F10TCO-HA ifadesiyle kurtarıldığını açıkça göstermektedir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: HA = hyaluronik asit; LPS = lipopolisakkarit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TCO * A = trans-siklookt-2-en-L-Lizin; SIF'ler = Salmonella kaynaklı filamentler; GCE = genetik kod genişlemesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: SseJ'in JF646-Tz boya ile etiketleme özgüllüğü. (A) HeLa hücreleri, 400 μM TCO*A. TCO-etiketli salgılanan SseJ-F10TCO-HA varlığında SseJ-F10TCO-HA eksprese eden Salmonella ile enfekte olur, sığır sütünden% 1 kazein sodyum tuzu içeren 1x PBS'de 2 μM JF646-Tz ile etiketlenir, salgılanan SseJ'yi (yeşil) görselleştirmek için anti-HA antikoru ile kapsamlı bir şekilde yıkanır, sabitlenir ve immünoboyanır. SseJ-F10TCO-HA, JF646-Tz boya (kırmızı, sol panel) ile salgılanır ve etiketlenir. GCE (kırmızı) ve HA (yeşil) ile etiketlenen SseJ açıkça birlikte lokalize edilmiştir (sağ panel). (B) Biraz farklı bir etiketleme protokolü kullanılarak, TCO etiketli salgılanan SseJ-F10TCO-HA, AYRICA TAM ORTA DMEM'de (FBS olmadan) 2 μM JF646-Tz ile etiketlenir, kapsamlı bir şekilde yıkanır ve sabitlenir ve anti-HA immünofloresan boyamasına tabi tutulur. Salgılanan SseJ-F10TCO-HA, JF646-Tz boya (kırmızı, sol panel) ile etiketlenir ve HA (yeşil) ile birlikte lokalize edilir. (C) Floresan sinyalinin SseJ'e özgü olduğunu ve diğer SPI-2 salınan proteinlerin bir ürünü olmadığını daha fazla kanıtlamak için, HeLa hücreleri, ncAA (TCO * A) varlığında psseJ-HA ve pEVOL-PylRS-AF taşıyan vahşi tip Salmonella ile enfekte edilir. Enfeksiyondan 16 saat sonra, enfekte HeLa hücreleri tam ortamda (FBS ve TCO * A olmadan) 2 μM JF646-Tz ile muamele edilir ve fazla boya yeni büyüme ortamı kullanılarak iyice uzaklaştırılır. HeLa hücreleri PFA ile sabitlenir ve SseJ (yeşil) için immün boyanmadan önce PBS ile iyice yıkanır. Sol panelde (JF646-Tz) görünür arka plan floresan sinyalinin olmaması, konakçı hücrelerde neredeyse hiç hedef dışı etiketleme yapılmadığını gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: HA = hyaluronik asit; PBS = fosfat tamponlu salin; FBS = fetal sığır serumu; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TCO * A = trans-siklookt-2-en-L-Lizin; SIF'ler = Salmonella kaynaklı filamentler; GCE = genetik kod genişlemesi; SPI-2 = Salmonella patojenite adası 2; BF = parlak alan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: HeLa hücrelerinde GCE etiketli SseJ'nin süper çözünürlüklü görüntülenmesi. HeLa hücreleri, 400 μM TCO*A varlığında SseJ-F10TCO-HA'yı eksprese eden Salmonella ile enfekte olur. TCO etiketli salgılanan SseJ-F10TCO-HA, protokolde tarif edildiği gibi fizyolojik koşullar altında 2 μM JF646-Tz ile etiketlenir, daha sonra kapsamlı bir şekilde yıkanır. Görüntüler Nikon N-STORM kullanılarak elde edilir. (A) Gözlem altındaki bir HeLa hücresinin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) TCO*A ve JF-646 ile etiketlenmiş salgılanan SseJ'nin kırınım sınırlı, geniş alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) SseJ ile dekore edilmiş SIF'lerin karşılık gelen dSTORM görüntüsü. Ölçek çubuğu = 10 μm. C(i) İç kısım, kutulu bölgedeki süper çözümlenmiş SseJ'nin büyütülmüş bir görünümünü gösterir. Ölçek çubuğu = 1 μm. Kısaltmalar: HA = hyaluronik asit; TCO * A = trans-siklookt-2-en-L-Lizin; SIF'ler = Salmonella kaynaklı filamentler; GCE = genetik kod genişlemesi; WF = geniş alan; BF = parlak alan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1. Çözümleri. Bu tablonun daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yaklaşım, enfeksiyondan sonra bakteriyel T3SS tarafından konakçı hücreye enjekte edilen efektör proteinlerin kesin yerini izlemek için kullanılmıştır. T3SS'ler, virülans bileşenlerini konakçıya taşımak için Salmonella, Shigella ve Yersinia gibi hücre içi patojenler tarafından kullanılır. Süper çözünürlüklü görüntüleme teknolojilerinin geliştirilmesi, virülans faktörlerini daha önce hayal bile edilemeyen bir çözünürlükte görselleştirmeyi mümkün kılmıştır12,13,24. Bununla birlikte, bazı etiketleme kısıtlamaları, fotoaktivatable protein füzyonları T3SS gözeneklerini bloke ettiğinden ve salgılanmadığından, daha derinlemesine araştırmayı engellemiştir. Ek olarak, kümeleme artefaktları ve hatalı analiz, bazı füzyon proteinlerinin kümelenme veya agregaya olan doğal eğiliminden kaynaklanabilir.
Bazı durumlarda, füzyon proteini de daha önce PAmCherry-SsaP12,13 ile gözlemlediğimiz gibi parçalanır. Tüm bu kısıtlamalar, POI'lerin sahaya özgü floresan etiketlemesine izin veren GCE ile aşılır. Aynı zamanda bol miktarda12,13 olmayan proteinlerin görselleştirilmesini sağlar. Ortogonal bir tRNA / aminoasil-tRNA sentetaz sistemi kullanarak ncAA birleşmesinin verimliliğini etkileyebilecek bir dizi faktör olsa da, kodon bağlamının en önemli olduğu görülmektedir. Ortogonal tRNA, tercih edilen kodon bağlamı AATTAGACT33 olduğunda bir ncAA'yı en verimli şekilde içerir. Şekil 5'te, GCE'den ve bölgeye özgü bir florofordan (ve ayrıca arka planın yokluğundan) kaynaklanan net etiketlemeyi, bir HA-etiketinin immünoboyamasına kıyasla karşılaştırabiliriz.
Sonuç olarak, araştırmacılar burada özetlenen yöntemi kullanarak patojenlerdeki, komensal bakterilerdeki ve ökaryotik konakçılardaki POI'leri görselleştirebileceklerdir. Kısacası, genetik olarak kodlanmış ncAA'lar, geleneksel yöntemler başarısız olduğunda efektör protein etiketlemesine alternatif bir yaklaşım sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemin önemli bir sınırlaması, floresan etiketlemenin verimliliğini etkileyebilecek membran geçirgenliği, dağılımı ve tutulması gibi floroforun doğal kimyasal özellikleridir. Floresan ncAA'lar, tıklama reaksiyonlarını önlemek için alternatif bir seçenektir12, ancak bunlar yalnızca iki foton mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir. Okuyucular, buradabelirtilen hücre zarı geçirgen / geçirimsiz boyaların bir listesine atıfta bulunur 12,38,39,40,41.
Sonuç olarak, Salmonella salgılanan efektör SseJ'yi, biyolojik işlevini bozmadan florojenik bir florofor ile kombinasyon halinde ncAA'ları genetik olarak kodlayarak spesifik olarak etiketledik ve görselleştirdik. SseJ'in JF646-Tz ile etiketlenmesi oldukça spesifikti ve konakçı hücrelerin içindeki salgılanan efektörleri görselleştirmek için süper çözünürlüklü görüntüleme daha da kullanılabilir. Böylece, dSTORM uyumlu boyalar ve genetik kod genişlemesi kullanılarak bakteriyel efektörlerin floresan etiketlemesi, konakçı hücrelerde bakteri salgılanan efektörlerin kırınım sınırının altında bir çözünürlükte hücre altı uzamsal lokalizasyonuna izin verdi. Bu etiketleme platformu, canlı hücre görüntüleme tek parçacık takibi ile uyumlu olduğundan, yöntemimiz, T3SS sisteminin efektör proteinlerini, bakteriyel patogenez hakkındaki moleküler anlayışımızı geliştirecek benzeri görülmemiş zamansal ve mekansal çözünürlük seviyeleri ile analiz etmeyi mümkün kılacaktır.
Zayıf ncAA birleştirme verimliliği ve organik floroforun fotofiziksel kısıtlamaları gibi belirli sınırlamalar olsa da, bu yaklaşımın araştırmacıların konakçı hücreler içinde salgılanan bir efektörü gözlemlemelerine ve lokalize etmelerine yardımcı olabileceğini gösterdik. Teknolojinin adaptasyonunun, enfeksiyon sırasında bakteriler tarafından üretilen diğer efektör proteinler üzerinde görüntüleme ve araştırma için yeni ve heyecan verici fırsatlar yaratacağını tahmin ediyoruz. Yöntem ayrıca virüslerin etiketlenmesi için kolayca uyarlanır ve geniş faydasını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Teksas Üniversitesi Tıp Fakültesi, Galveston, TX'den başlangıç fonları ve L.J.K.'ya Texas STAR ödülü ile desteklendi. Prof. Edward Lemke'ye (Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Heidelberg, Almanya) plazmid pEVOL-PylRS-AF için teşekkür ederiz. Şekil 1'deki görüntüler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
References
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
- Galan, J. E., Waksman, G.
- Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
- Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
- Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
- Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
- Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
- Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
- Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
- Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
- Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
- Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
- Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
- Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
- Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
- Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
- Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
- Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
- Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
- Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
- Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
- Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
- Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).
