Summary
이 작업은 소금물 새우 치사 분석으로도 확인된 Artemia salina 치사율 생물학적 분석 절차를 평가하고 검토하는 것을 목표로 합니다. 이 간단하고 저렴한 방법은 샘플, 즉 천연물의 일반적인 독성 (예비 독성 평가로 간주 됨)에 대한 정보를 제공합니다.
Abstract
천연물은 고대부터 의약품을 생산하는 데 사용되어 왔습니다. 요즘에는 천연 자원에서 얻은 화학 요법 약물이 많이 있으며 과다한 질병에 사용됩니다. 불행히도, 이러한 화합물의 대부분은 종종 전신 독성 및 부작용을 나타냅니다. 선택된 잠재적 생리활성 샘플의 내약성을 더 잘 평가하기 위해, 염수 새우(Artemia salina)는 일반적으로 치사율 연구의 모델로서 사용된다. A. salina 테스트는 연구 된 생리 활성 화합물이 애벌레 단계 (nauplii)에서 미세 갑각류를 죽이는 능력을 기반으로합니다. 이 방법은 세포 독성 연구뿐만 아니라 합성, 반합성 및 천연 제품의 일반적인 독성 스크리닝을위한 편리한 출발점을 나타냅니다. 일반적으로 전술한 목적에 적합한 다른 많은 분석(시험관 내 세포 또는 효모 균주, 제브라피쉬, 설치류)과 비교하여 간단하고 빠르며 저렴한 분석으로 간주될 수 있습니다. 또한 특별한 교육 없이도 쉽게 수행 할 수 있습니다. 전반적으로, A. salina 분석은 선택된 화합물의 예비 독성 평가 및 천연 제품 추출물의 바이오 유도 분획화에 유용한 도구를 나타낸다.
Introduction
식물, 동물 또는 미생물의 천연물은 다양한 생물학적 및 약리학적 활성으로 인해 새로운생리 활성 분자의 개발에서 수년 동안 관심이 증가하고 있습니다1. 그러나 관련 부작용, 약물 내성 또는 약제의 부적절한 특이성은 특히 항암제로 사용될 때 비효율적인 치료 1,2로 이어질 수 있는 주요 요인을 나타냅니다.
지난 수십 년 동안 여러 식물 유래 세포 독성 제제가 발견되었으며 그 중 일부는 항암제 1,2,3으로 사용되었습니다. 이러한 맥락에서 파클리탁셀은 천연 기원의 가장 잘 알려져 있고 가장 활동적인 화학 요법 약물 중 하나로보고됩니다 3,4. 현재 시장에 나와있는 모든 의약품의 35 % 이상이 천연 제품에서 파생되거나 천연 제품에서 영감을 얻은 것으로 추정됩니다5. 이러한 화합물의 잠재적 인 높은 독성은 다양한 유형의 오염 물질 또는 식물 자체의 대사 성분이 독성 영향을 일으킬 수 있기 때문에 모든 연구 단계에서 고려해야합니다. 이러한 이유로 새로운 잠재적 식물 기반 치료의 생물학적 활성과 안전성을 평가하기 위해 예비 단계에서 약리학 적 및 독성 학적 프로파일을 수행해야합니다. 새로운 생리 활성 샘플의 독성을 평가하기 위해 무척추 동물을 연구하기에 가장 좋은 모델로 간주 할 수 있습니다. 그들은 최소한의 윤리적 요구 사항을 요구하고 예비 체외 분석을 허용하여 척추 동물 1,6의 다음 테스트 라운드에서 가장 유망한 제품의 우선 순위를 지정합니다.
일반적으로 소금물 새우로 알려진 A. salina는 Artemia 속에 속하는 작은 호 염성 무척추 동물입니다 (가족 Artemiidae, 주문 Anostraca, 아문 갑각류; 그림 1). 해양 및 수생 식염수 생태계에서 소금물 새우는 미세 조류를 먹고 물고기에게 먹이를주는 데 사용되는 동물성 플랑크톤의 구성 요소이기 때문에 중요한 영양 역할을합니다. 또한, 그들의 유충 (nauplii로 알려짐)은 예비 연구 1,3,7 동안 일반적인 독성 평가에 널리 사용됩니다.
Artemia spp.는 치사율 연구에 널리 사용되며 실험실 1,8에서 자란 nauplii를 죽이는 능력을 기반으로 잠재적으로 생리 활성 화합물의 독성을 추적하여 독성 평가를위한 편리한 출발점이기도합니다. 이러한 이유로 A. salina의 사용은 동물 모델9에 대한 다른 테스트에 비해 매우 효율적이고 사용하기 쉬운 방법이기 때문에 일반적인 독성 연구에서 매력을 얻었습니다.
간단한 해부학, 작은 크기 및 짧은 수명주기로 인해 한 번의 실험으로 수많은 무척추 동물을 연구 할 수 있습니다. 따라서 유전적 순응성과 저비용 호환성을 대규모 스크리닝과결합합니다1. 이러한 맥락에서 일반적인 독성 분석에서 염수 새우를 사용하면 빠른 성장 (부화에서 첫 번째 결과까지 28-72 시간 필요), 비용 효율성 및 상업용 계란의 긴 유통 기한과 같은 몇 가지 이점이 있습니다., 일년 내내 사용할 수있는 3,10. 반면에 무척추 동물은 원시 장기 시스템을 가지고 있고 적응 면역 체계가 없기 때문에 인간 세포에 대한 완벽하고 신뢰할 수있는 모델을 나타내지 않습니다1.
그러나, 선택된 샘플의 일반적인 독성에 대한 예비 평가 방법을 제공한다. 치사율 분석으로 널리 사용되기 때문에 잠재적인 항암제의 독성 효과에 대한 잠정적 징후를 제공할 수 있습니다. 또한 Artemia 새우 중에서 가능한 가장 낮은 사망률을 나타내는 것이 필수적인 다른 생물학적 활동이 부여 된 화합물의 일반적인 독성에 대한 피드백을 얻는 데에도 종종 사용됩니다.
우리 그룹의 진행중인 연구에서 Plectranthus 종의 다른 추출물은 항산화 및 항균 활성을 보여주었습니다 (미공개 결과). 병행하여, 분리 된 화합물을 추출물의 정제에 의해 수득 한 다음, 화학적으로 변형 하였다. 추출물, 순수 화합물 및 반합성 유도체를 일반적인 독성 측면에서 테스트했습니다. 이러한 맥락에서, 본 연구는 Plectranthus11 속의 다른 식물에서 생리 활성 추출물 및 분리 된 화합물의 일반적인 독성 및 잠재적 세포 독성 활성의 평가를위한 Artemia 치사 생물학적 분석법의 사용에 대한 개요를 제공하는 것을 목표로합니다.
그림 1: 현미경으로 본 아르테미아 살리나 . 현미경으로 본 A. salina 의 새로 부화 된 nauplii (배율 12x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 장비 준비
- 상업적으로 이용 가능한 해칭 장비를 구입하십시오. 해칭 장비를 설치할 적절한 장소를 선택하십시오(그림 2A). 깔때기 모양의 용기를 검은색 지지대(세트에 포함)에 놓고 깔때기를 적절한 방향으로 돌려 레벨 표시와 탭을 확인합니다.
- 손으로 만든 마이그레이션 장비를 만들려면 두 개의 0.5L (직경 5.8cm) 플라스틱 병의 상단을 잘라 최종 높이 12cm를 얻으십시오. 각 병의 바닥에서 7cm에서 한쪽에 직경 1.5cm의 구멍을 만들고 두 구멍 사이에 13cm 고무 튜브 (외부 1.3cm, 내경 0.9cm)를 삽입합니다. 뜨거운 접착제 (그림 2B)로 개구부를 밀봉하고 15 분 동안 건조시킵니다. 병을 평평한 표면에 놓고 물로 채워 누출이 없는지 확인하십시오.
2. 인공 염 용액의 제조
- 유리 비커에서 35g/L 농도의 인공 소금 용액(소금물 새우 소금)을 준비합니다. 이렇게하려면 제조업체의 지침에 따라 수돗물 800mL에 소금 28g을 넣으십시오. 모든 소금이 완전히 녹을 때까지 교반 막대와 섞는다.
알림: 사용 가능한 용기의 크기에 따라 준비된 식염수의 부피를 조정하십시오.
3. 샘플 준비
- 모든 시료를 미세원심분리 튜브에 적절한 양의 추출물(플렉트란서 스 추출물, Pa-P. ambigerus; Pb- P. 바바투스; Pc-P. cylindraceus ; 및 Pe-P. ecklonii) 또는 화합물 1-5 ( Plectranthus spp.로부터 수득되는 2개의 천연 화합물 [1 및 2] 및 3개의 반합성 유도체 [3, 4, 5]; 그림 3) 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)12에서 최종 농도 10mg / mL를 얻습니다 (샘플이 수용성 인 경우 DMSO를 사용할 필요가 없음).
- 단계 2.1에서 제조된 990μL의 인공 식염수를 사용하여 새로운 미세 원심분리 튜브에서 각 시료(음성 대조군의 경우 DMSO) 10μL를 희석하여 최종 농도 0.1mg/mL를 얻습니다.
- 흄 후드 아래에서, 삼각 플라스크에서, 1 mg/mL13,14,15 농도의 증류수에 중크롬산칼륨(K2Cr2O7) 용액을 준비한다.
4. 소금물 새우 치사율 생물학적 분석
참고 :이 분석은 수정된 여러 저자의 작업에서 개발되었습니다 1,16,17,18,19.
- 2.1단계에서 준비한 배지를 레벨 표시(500mL)까지 부화 용기에 채웁니다(그림 2C).
- 소금물 새우 낭종 한 스푼 (약 0.75g)을 소금 용액에 넣은 다음 용기를 닫습니다. 램프(테이블 램프, 40W, 230V, 50Hz, LED 전구 8W, 4,000K, 830lm)를 장비(그림 2A)를 직접 가리키도록 놓고 켭니다.
- 공기 공급 시스템(3W 출력, 50Hz, 230V)을 장비 상단에 있는 커넥터에 연결하고 펌프를 켭니다.
- 실내 온도를 25 ± 3 °C로 유지하십시오. 소금물 새우 낭종은 인공 소금 용액에서 격렬한 통기, 지속적인 조명 및 안정적인 온도 하에서 24 시간에서 48 시간 후에 부화합니다.
알림: 또는 수직 인큐베이터를 사용할 수 있습니다. - 알이 부화하면 공기 펌프를 끄고 노플리(깔때기 아래쪽으로 이동)가 빈 알 케이스(상단에 떠 있음)에서 분리될 때까지 기다립니다.
- 부화되지 않은 알을 살아있는 nauplii에서 분리하려면 바닥의 배출구 탭을 열고 깔때기의 내용물을 수제 마이그레이션 장비 컨테이너의 컨테이너 중 하나에 배출하십시오 (1.2 단계에서 설명). nauplii와 잔여 부화되지 않은 계란이 들어있는 용액이 튜브 높이보다 낮은지 확인하십시오. 두 번째 용기에 2.1 단계의 잔류 염 용액을 튜브 높이 위에 놓습니다.
- 알루미늄 호일을 사용하여 nauplii와 나머지 부화되지 않은 계란으로 용기를 덮으십시오. 소금 용액만으로 두 번째 용기에 램프를 놓습니다. 소금물 새우는 빛에 끌려 한 용기에서 다른 용기 (수확 용기)로 이동하여 계란 (천천히 바닥으로 침전됨)과 살아있는 Artemia 사이의 효율적인 분리로 이어집니다.
- 그런 다음 4.4 단계에서 사용 된 것과 동일한 조건에서 장비를 4 시간 동안 인큐베이터에 놓습니다 (그림 2E). 수확 용기로부터 10 내지 15 노플리를 함유하는 900 μL의 식염수를 수집한다. 생리식염수와 함께 노플리를 24-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다(도 2F); 모든 샘플은 사중 증식으로 테스트됩니다.
- 음성 대조군(DMSO), 양성 대조군(K2Cr2O7, 중크롬산칼륨),인공 염 용액 및각각의 샘플을 각각 웰에 각각 100 μL씩 추가합니다(그림 2F)13,14.
알림: 각 웰의 샘플은 0.01 mg / mL의 농도입니다. 소금 용액에서 양성 대조군의 최종 농도는 0.1mg/mL로, 우물의 모든 노플리가 중크롬산칼륨의 독성 효과에 노출되어 죽는지 확인합니다. 인공 염 용액은 공백으로 작용합니다. - 플레이트를 조명 하에서 25 ± 3°C에서 24시간 동안 배양합니다(그림 2G). 24 시간 후, 쌍안 현미경 (12x) 20 (그림 2H)으로 각 웰에서 죽은 유충 수 (5 초 동안 비 이동성 nauplii)를 등록합니다. 또는 핸드 렌즈를 사용하십시오.
- 중크롬산 칼륨 용액 100μL를 첨가하여 나머지 살아있는 유충의 죽음을 유도하고 6 시간 동안 기다립니다. 현미경으로 각 우물의 총 죽은 유충을 세십시오. 다음 방정식에 따라 사망률을 결정하십시오.
- 모든 분석을 삼중으로 수행하십시오. 표준 편차(SD)를 계산하고 결과를 각각 내부 사중(n = 12)이 있는 3개의 독립적인 실험의 평균± SD로 표현합니다. Meyer et al.이 언급했듯이 LC50< 1,000 μg / mL의 원유 추출물과 순수 화합물을 독성으로 간주하십시오. 또한, 염수 새우의 폐사율은 시험 된 샘플(21)의 농도에 비례한다는 것을 고려한다.
그림 2: 아르테미아 살리나 치사 생물학적 분석 방법. (A) 염수 새우 낭종의 부화에 사용되는 상업적으로 이용 가능한 장비; (B) 손으로 만든 마이그레이션 장비; (c) 식염수로 채워진 부화 용기; (D) 부화되지 않은 알과 노플리의 수집; (E) 마이그레이션 단계 동안 인큐베이터의 수제 장비. 램프에서 멀리 떨어진 용기는 알루미늄 호일로 덮어야합니다. 그러나 세트 설치를 더 잘 볼 수 있도록 여기에서 제거되었습니다. (F) 분석을 수행하기 전에 우물에서 아르테미아 수확. 화합물은 다음과 같이 배치되어야 한다: - 음성 대조군 (DMSO)을 지칭하고, 양성 대조군 (K2Cr2O7)에+, 인공 염 용액에 염, 및 시험할 샘플에 1 내지 3 (이 경우 화합물 1 내지 3); (g) 선택된 샘플을 포함하는 24-웰 플레이트의 인큐베이션; (H) 쌍안 현미경으로 아르테미아 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 선택된 화합물의 구조. Plectranthus 종에서 추출한 화합물 1-2 및 반 합성으로 얻은 화합물 3-5의 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
우리 그룹이 최근에 연구 한 일부 천연물의 일반적인 독성은 소금물 새우 치사율 생물학적 분석을 통해 평가되었습니다. 4개의 추출물( Pa-P. ambigerus; Pb- P. 바바투스; Pc- P. 원통형; 및 Pe- P. ecklonii)의 항산화 활성으로 알려진 Plectranthus 속의 (미공개 결과)를 테스트했습니다. 추가적으로, Plectranthus spp.로부터 얻은 2 개의 천연 화합물 (1 및 2) 및 3 개의 반합성 유도체 (3, 4, 5; 그림 3), 다른 작업3에 설명된 모든 것도 조사되었습니다. 본원에서, 잠재적인 세포독성 활성의 관점에서 이들의 예비 평가가 보고된다.
시험된 모든 추출물은 매우 고무적인 결과를 나타냈으며, 이는 블랭크(염 용액) 및 음성 대조군(DMSO; 그림 4). 반대로, 순수 화합물 1-5 중에서 유도체 5만이 일반적인 독성이 없는 낮은 사망률(100ppm 농도에서 2.30%)을 나타냈습니다(그림 5).
그림 4: 아르테미아 살리나에 대한 추출물의 치사율. A. 살리나의 사망률 (%) 0.1 mg / mL에서 Plectranthus spp.의 4 개의 메탄올 추출물에 24 시간 노출 후 (Pa- P. ambigerus; Pb- P. 바바투스; Pc- P. 원통형; Pe- P. ecklonii). 모든 추출물은 이 분석을 사용하여 일반적인 독성의 관점에서 허용가능하였다. 소금은 염 용액(blank)에 상응하고; 양성대조군으로는K2Cr2O7을, 음성대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 결과는 각각 내부 사중 증식 (n = 12) ± SD가있는 3 개의 독립적 인 실험의 평균으로 표현되었습니다. 비교는 Dunnett의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분산 분석을 통해 그룹 내에서 수행되었습니다. 대조군과 실험군 간의 유의한 차이는 상용 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 확률 수준 p < 0.01은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 아르테미아 살리나에 대한 화합물의 치사율. 사망률 A. 살리나 (%) 24 mg / mL에서 5 개의 순수 화합물에 0.1 시간 노출 후 (1과 2는 천연물이고 3-5는 1과 2에서 제조 된 유도체입니다). 5개만이 이 분석을 사용하여 매우 제한된 독성을 나타낸다는 것이 분명합니다. 소금은 염 용액(blank)에 상응하고; 양성대조군으로는K2Cr2O7을, 음성대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 결과는 각각 내부 사중 증식 (n = 12) ± SD가있는 3 개의 독립적 인 실험의 평균으로 표현되었습니다. 비교는 Dunnett의 사후 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분산 분석을 통해 그룹 내에서 수행되었습니다. 대조군과 실험군 간의 유의한 차이는 상용 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 확률 수준 p < 0.01은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
천연물 1과 2는 중간 정도의 치사율 (각각 100ppm에서 36.68 % 및 30.95 %)을 보인 반면, 1 및 2에서 각각 얻은 반합성 유도체 3 및 4는 원래 스캐 폴드보다 독성이 더 강했습니다 (100ppm에서 각각 64.02 % 및 36.64 %; 그림 5).
전반적인 데이터는 항산화 활성으로 알려져 있고 일반적인 독성을 나타내지 않는 모든 테스트 된 추출물이 선택된 세포주에 대한 추가 시험관 내 활성 및 독성 연구의 후보로 간주 될 수 있음을 시사했습니다. 독성의 부재가 피부 모델에서도 입증되면, 피부 적용을위한 새로운 생리 활성 제품의 개발이 수행 될 수있다. 반면에 화합물 1-4에 대해 관찰된 독성 효과는 항암제로서의 추가 평가에 적합한 후보가 될 수 있습니다.
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Discussion
지난 몇 년 동안 과학계는 독성 스크리닝을위한 대체 모델에 대한 관심을 증가 시켰습니다21. A. salina 치사성 생물학적 분석 외에도 샘플 내약성 평가를 위해 다른 방법론이 일반적으로 수행되며 척추 동물 생물 분석 (예 : 설치류), 무척추 동물 (예 : 제브라 피쉬), 효모 균주 또는 세포를 사용하는 시험관 내 방법 및 인실리코 방법22,23,24,25 . 이러한 모든 방법에는 지출 된 비용과 시간, 결과의 재현성 및 분석 할 샘플 유형을 고려하여 명확한 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, 인실리코 접근 방식은 최소한의 장비를 필요로 하는 표준화된 저비용 방법론을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 이러한 연구가 단일 대상에 초점을 맞출 때 품질이 좋지 않은 결과가 얻어져 이 연구25,26에서 제시한 바와 같이 이 대안은 예비 심사 범위를 벗어납니다. 미생물과 관련하여 사카로 미세스 세레 비시 애는 독성 화합물23의 평가에 가장 광범위하게 사용되는 모델 중 하나로 간주됩니다. 사실, 시험관 내 효모의 사용은 일반적으로 빠르고 수행하기 쉽습니다. 그러나, 특정 화학 제품 및 장비를 필요로 하고, 세포독성 화합물(27)의 최소 투여량에 대해 낮은 민감도를 나타내기 때문에 비용이 많이 들 수 있다. 대안적인 접근법에서, 인간 세포는 빠르고, 간단하고, 저렴한 방법으로 사용될 수 있다. 그렇다 하더라도, 이것들은 전체 유기체를 대표할 수 없습니다. 따라서 생리적 조건에서 발생하는 서로 다른 세포 유형 및 전신 섭동 간의 상호 작용은 적절하게 고려되지 않습니다25,26. 반면에, 생체내 분석은 전체 유기체를 고려하는 큰 이점을 갖지만, 동물 모델(예: 설치류)은 분석 실행에 더 많은 시간을 필요로 하고, 더 비싸고 복잡한 윤리적 고려사항을 내포한다(25). 반대로, 독성 스크리닝을 위해 수생 생물을 사용하는 생체 내 분석은 해양 무척추 동물의 사용이 윤리적 문제가 적고 방법론이 수행하기 쉽고 빠르며 저렴하다는 점을 고려할 때 일반적으로 잘 받아 들여집니다21,24. 이러한 맥락에서 일반적인 독성 연구에 제브라 피쉬를 사용하는 것은 종종 현장에서 첫 번째 선택을 나타냅니다. 사실, 다른 동물 실험과 비교할 때, 제브라 피쉬는 빠르게 발달하고 수정 후 72 시간에서 13 일 사이에 초기 애벌레 단계에 도달하기 때문에 저렴한 옵션으로 간주 될 수 있습니다21,28. 그럼에도 불구하고 제브라 피쉬의 유지 관리에는 잘 훈련 된 작업자와 순환 시스템이있는 어항과 같은 특정 조건이 필요하며 시스템 물을 폭기하고 여과하여 전반적인 품질을 유지할 수 있습니다. 또한 제브라 피쉬가 점프 할 수 있고 특정 조명 조건 (14 시간 빛, 10 시간 어둠)이 필요하며 pH 수준을 매일 확인해야하며 특히29,30입니다. 이러한 고려 사항은 모두 함께 제브라 피쉬 모델을 여기에보고 된 Artemia 모델보다 더 많은 시간과 비용이 많이 들게하는데, 이는 이러한 미세 갑각류가 다루기 쉽고 실험실 방법을 사용하여 대규모 개체군에서 재배 할 수 있기 때문입니다. 이것은 A. salina를 의심 할 여지없이 가장 많이 사용되는 스크리닝 도구 중 하나로 만들고 주로 약물 및 약용 식물 추출물과 같은 다양한 샘플의 일반적인 독성을 테스트하는 데 사용됩니다1.
프로토콜에서, A. salina nauplii는 각 샘플에 의해 유도된 nauplii 사망률을 추정하기 위해 24시간 동안 적절한 샘플과 함께 사육, 수집 및 배양되었습니다. 첫 번째 단계에서 알 부화는 상업적으로 이용 가능한 깔때기 모양의 번식 용기에서 수행되며, 여기서 격렬한 버블 링이 도입되었습니다 (그림 2A). 이 강제 통기는 소금물 새우 부화가 가능한 한 성공적으로 일어날 수 있기 때문에 필요합니다. 부화는 25 ± 3 ° C에서 약 24 시간에 발생하는 반면 저온에서는 최대 48 시간이 필요할 수 있습니다. 알이 부화하면 펌프가 꺼져 빈 계란 케이스가 상단에 떠 있도록 하고, 하단의 깔때기 탭을 열어 노플리와 부화되지 않은 알을 쉽게 모을 수 있습니다. 우리의 실험 동안, 완전한 알 부화는 결코 달성되지 않았으며, 결과적으로 수집 된 용액에 nauplii와 성숙하지 않은 알이 존재했습니다. 이러한 이유로 두 가지 형태의 Artemia를 효율적으로 분리하기 위해 소금물 새우의 이동을위한 수제 장비를 준비합니다 (단계 1.2). 하나의 용기는 수확 된 유기체로 채워진 다음 알루미늄 호일로 덮여 있고 다른 용기는 램프의 직사광선에 노출됩니다. 이러한 조건에서 부화되지 않은 알은 정착하는 경향이 있는 반면, 살아있는 노플리는 인접한 컨테이너에 부딪히는 빛에 끌려 다리 연결을 통해 한쪽에서 다른 쪽으로 이동하는 것을 선호합니다. 4 시간 후, 거의 모든 살아있는 nauplii는 빛에 노출 된 용기 안에 있고 분석 실행을 위해 수집 될 준비가되었습니다. 이 단계에서, 10 내지 15 개의 nauplii를 함유하는 바닷물 용액의 일부가 제거되고 테스트 될 각각의 샘플과 함께 배양된다.
이 작업에서는이 방법이 효율적이고 경제적이며 수행하기 쉬운 방법을 보여주었습니다. 그러나 이 분석을 수행할 때 몇 가지 중요한 점을 인정해야 합니다.
분석은 일반적으로 수돗물로 수행됩니다. 지리적 및 물리 화학적 요인에 따라 수돗물은 다른 경도 분포를 나타내며 분석의 재현성, 특히 알 부화 단계에 영향을 미칩니다. 같은 이유로 해수를 사용하면 테스트의 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다양한 염분 농도, 오염 물질, 미세 플라스틱 및 기타 소체의 존재로 인해 작업자는 여과 및 기타 유형의 정제와 같은 추가 단계를 거쳐야 하므로 실험이 더 복잡하고 다루기 쉽지 않습니다. 모든 고려 된 최적 조건은 수돗물의 특성과 가용성에 따라 결정되어야하며, 특히 적절한 환경을 조성하고 nauplii의 영양 역할을하는 인공 소금의 양을 신중하게 조절해야합니다.
온도 변화가 크면 해치 속도가 낮아질 수 있습니다. 결과적으로, 낮은 수준의 살아있는 Artemia 가 관찰 될 수 있으며, 많은 수의 부화되지 않은 알과 혼합됩니다. 분명히, 이러한 조건은 신뢰할 수있는 분석의 개발에 적합하지 않으므로 방의 제어 된 기후화 또는 적절한 수직 인큐베이터의 사용을 고려해야합니다.
부화 용기 내에서 용액의 격렬한 폭기가 필요합니다. 지속적인 버블 링의 존재는 계란 사이의 접촉을 촉진하고 부화 과정을 가속화합니다.
수확하는 동안 부화되지 않은 알과 nauplii를 모두 수집하면 분석의 신뢰성에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 샘플과 함께 배양하는 동안 부화 할 가능성이 있기 때문입니다. 이 경우 모든 nauplii가 동일한 시간 동안 노출된 것은 아니며 결과적으로 잘못된 사망률이 발생합니다. 알과 노플리는 너무 작아서 효율적으로 분리할 수 없기 때문에 부화 장비의 배양 시간이 길거나 수제 이동 장비를 사용해야 합니다.
각 우물은 양안 현미경 (12x 배율)을 사용하여 신중하게 계산 한 배양 단계를 위해 10-15 nauplii를 포함해야합니다. 같은 우물에 너무 많은 nauplii가 있으면 겹치기 때문에 최종 계산이 어렵거나 오류가 발생할 수 있습니다. 반면에 소량의 새우는 통계적 유의성이없는 결과로 이어질 것입니다.
분명히 알 수 있듯이이 방법의 대부분의 문제는 부화 및 성장 단계와 관련이 있으며 신뢰성 문제를 피하기 위해 더 많은주의가 필요합니다. 그럼에도 불구하고이 방법은 특히 위에서 설명한 가장 중요한 점과 관련하여 수정을 허용 할 수 있습니다. 물론 이러한 매개 변수 중 하나가 변경되면 원래 방법을 최적화하기 위해 여러 번 시도해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 온도를 변경하면 분석의 전체 시간을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다: 온도를 28-29°C까지 높이면 해치 속도가 증가하고 전체 공정의 속도가 빨라집니다.
A. salina 생물학적 분석의 일부 제한은 또한 시험 조건 및 시간에 대한 샘플의 안정성과 관련이 있습니다. 분석은 실온 및 가시광선 아래에서 안정적인 샘플을 사용해야만 수행할 수 있습니다. 또한 전체 절차가 최소 4 일 동안 지속되며 부화 속도가 낮 으면 부화 단계에 하루가 더 필요할 수 있다는 점을 고려해야합니다.
전반적으로이 연구에서는 A. salina 방법을 통한 일반 독성 평가 적용의 두 가지 예를 강조합니다. 테스트 된 모든 샘플에 대해 일반 독성이 확립되었습니다. Plectranthus 식물과 화합물 5의 추출물은 일반적인 독성을 나타내지 않은 반면, 화합물 1-4는 소금물 새우에 중간 또는 매우 독성이있는 것으로 판명되었습니다. 특히, 아르테미아에 대한 화합물 1 및 2의 부정적인 영향은 이전에 MTT 및 SRB/MTT 분석에 의해 Sitarek 및 Matias에 의해 각각31,32로 입증되었습니다. 동시에, 벤조일화 유사체인 화합물 3 및 4는 그의 전구체 1 및 2보다 더 높은 독성 값을 나타내며, Garcia et al.33에 의해 인간 NSCLC MDR 암 세포주에서 화합물 4에 대해 확인된 바와 같이 에스테르 기능화가 세포독성 측면에서 중요한 역할을 할 수 있음을 강조합니다. 그러나 이러한 세포 독성 활성이 암 치료에 악용 될 수 있음을 확인하기 위해서는 다른 분석이 필요합니다. 반면에 유도체 5는 모든 분석 추출물과 함께 독성이 없었으며 시리즈 중 가장 유망한 순수 화합물로 나타납니다. 그러나, 피부 적용에 대한 잠재적 인 생물학적 활성을 평가하기위한 추가 연구가 필요하다.
여기에서 우리는 Artemia salina 기반 방법을 스크리닝 도구로 사용하여 다른 알려진 방법론에 비해 시간과 비용을 절약할 수 있는 방법을 보여주었습니다. 이는 예비 독성 맥락에서 이용되는 효율적이고 유리한 방법을 나타냅니다. 그것은 다양하고 복잡한 샘플, 합성 및 반합성 약물의 존재뿐만 아니라 천연 제품 추출물 및 샘플의 바이오 유도 분획에 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 재정적 또는 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
아밀카르 로베르토 교수를 추모합니다.
이 작업은 CBIOS 및 박사 보조금 SFRH/BD/137671/2018(Vera Isca)에 기인하는 UIDB/04567/2020 및 UIDP/04567/2020 프로젝트에 따라 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, 포르투갈)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
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