Zebrafiskens Tol2-system: En modulär och flexibel gateway-baserad transgenesmetod
Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för det modulära Tol2-transgenessystemet, en gateway-baserad kloningsmetod för att skapa och injicera transgena konstruktioner i zebrafiskembryon.
Abstract
Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) kännetecknas av en mycket varierande uppsättning strukturella defekter och kognitiva funktionsnedsättningar som uppstår på grund av prenatal etanolexponering. På grund av FASD: s komplexa patologi har djurmodeller visat sig vara avgörande för vår nuvarande förståelse av etanolinducerade utvecklingsdefekter. Zebrafisk har visat sig vara en kraftfull modell för att undersöka etanolinducerade utvecklingsdefekter på grund av den höga graden av bevarande av både genetik och utveckling mellan zebrafisk och människor. Som modellsystem har zebrafiskar många attribut som gör dem idealiska för utvecklingsstudier, inklusive ett stort antal externt befruktade embryon som är genetiskt lätthanterliga och genomskinliga. Detta gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera tidpunkten och doseringen av etanolexponering i flera genetiska sammanhang. Ett viktigt genetiskt verktyg som finns i zebrafisk är transgenes. Att generera transgena konstruktioner och etablera transgena linjer kan dock vara komplicerat och svårt. För att ta itu med detta problem har zebrafiskforskare etablerat det transposonbaserade Tol2-transgenessystemet. Detta modulära system använder en multisite Gateway-kloningsmetod för snabb montering av kompletta Tol2-transposonbaserade transgena konstruktioner. Här beskriver vi den flexibla verktygslådan för Tol2-systemet och ett protokoll för att generera transgena konstruktioner redo för zebrafisktransgenes och deras användning i etanolstudier.
Introduction
Prenatal etanolexponering ger upphov till ett kontinuum av strukturella underskott och kognitiva funktionsnedsättningar som kallas fetalt alkoholspektrumstörningar (FASD)1,2,3,4. De komplexa relationerna mellan flera faktorer gör det svårt att studera och förstå etiologin för FASD hos människor. För att lösa denna utmaning har en mängd olika djurmodeller använts. De biologiska och experimentella verktyg som finns tillgängliga i dessa modeller har visat sig vara avgörande för att utveckla vår förståelse av den mekanistiska grunden för etanolteratogenicitet, och resultaten från dessa modellsystem har varit anmärkningsvärt överensstämmande med vad som finns i humana etanolstudier 5,6. Bland dessa har zebrafiskar framkommit som en kraftfull modell för att studera etanolteratogenes7,8, delvis på grund av deras yttre befruktning, hög fecunditet, genetisk smidighet och genomskinliga embryon. Dessa styrkor kombineras för att göra zebrafiskar idealiska för realtidsstudier av FASD med transgena zebrafisklinjer.
Transgena zebrafiskar har använts i stor utsträckning för att studera flera aspekter av embryonal utveckling9. Att skapa transgena konstruktioner och efterföljande transgena linjer kan dock vara mycket svårt. En standardtransgen kräver ett aktivt promotorelement för att driva transgenen och en poly A-signal eller “svans”, allt i en stabil bakterievektor för allmänt vektorunderhåll. Den traditionella genereringen av en multikomponenttransgen konstruktion kräver flera tidskrävande underkloning steg10. PCR-baserade metoder, såsom Gibson-montering, kan kringgå några av de problem som är förknippade med subkloning. Unika primers måste dock utformas och testas för generering av varje unik transgen konstruktion10. Utöver transgenkonstruktion har genomisk integration, överföring av könsceller och screening för korrekt transgenintegration också varit svårt. Här beskriver vi ett protokoll för användning av det transposonbaserade Tol2-transgenessystemet (Tol2Kit)10,11. Detta modulära system använder multisite Gateway-kloning för att snabbt generera flera transgena konstruktioner från ett ständigt växande bibliotek med “entry” och “destination” -vektorer. Integrerade transponerbara Tol2-element ökar kraftigt transgeneshastigheten, vilket möjliggör snabb konstruktion och genomisk integration av flera transgener. Med hjälp av detta system visar vi hur genereringen av en endoderm transgen zebrafisklinje kan användas för att studera de vävnadsspecifika strukturella defekter som ligger bakom FASD. I slutändan visar vi i detta protokoll att den modulära installationen och konstruktionen av transgena konstruktioner i hög grad kommer att hjälpa zebrafiskbaserad FASD-forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafiskar är idealiska för att studera effekterna av etanolexponering på utvecklings- och sjukdomstillstånd 7,8. Zebrafisk producerar ett stort antal genomskinliga, externt befruktade, genetiskt lätthanterliga embryon, vilket möjliggör levande avbildning av flera transgenmärkta vävnader och celltyper samtidigt i flera miljösammanhang19,20. Dessa styrkor, i kombination med det starka utveckling…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen som presenteras i denna artikel stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 till CBL
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
